Expression of phage lysin Cp51 in recombinant Lactococcus lactis and its antibacterial activity against Clostridium perfringens type A
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摘要:目的
构建A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens裂解酶重组表达乳酸菌Lactococcus lactis，并检测重组菌及其表达产物的抗菌效果。
方法全基因合成噬菌体裂解酶Cp51基因，构建PNZ8148-Cp51原核表达重组载体，电转化至乳酸菌NZ9000，经乳链菌肽诱导表达可溶性Cp51蛋白；用比浊法检测表达蛋白对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性；利用细菌液混合培养检测重组菌对A型产气荚膜梭菌增殖的抑制作用。
结果噬菌体裂解酶Cp51在乳酸菌中成功表达，为1 268 bp；质量浓度1 μg·mL−1以上的重组蛋白对A型产气荚膜梭菌具有高效抗菌活性；重组乳酸菌对A型产气荚膜梭菌增殖有一定的抑制效果，混合培养后使产气荚膜梭菌活菌数从9×109 CFU·mL−1下降到约9×108 CFU·mL−1。
结论A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶重组乳酸菌构建成功，为后续优化表达和临床应用研究奠定了基础。
Abstract:ObjectiveTo construct a recombinant Lactococcus lactis expression system of phage lysine Cp51, and study its antibacterial activity against Clostridium perfringensin type A invitro.
MethodPhage lysin Cp51 gene was inserted into the prokaryotic expression vector PNZ8148, and then the recombinant vector PNZ8148-Cp51 was constructed and transformed into L. lactis NZ9000. Nisin was used to induce expression of soluble protein Cp51. The antibacterial activity of the recombinant protein against C. perfringens type A was detected by kinetic turbidimetric assay in vitro. The inhibitory effect of recombinant L. lactis on the proliferation of C. perfringens type A was tested by mixed cultivation.
ResultThe recombinant phage lysin Cp51 was successfully expressed in L. lactis and the Cp51 gene was 1 268 bp in length. The recombinant protein had strong antibacterial activity against C. perfringens type A at the concentration above 1 μg·mL−1 in vitro. The recombinant L. lactis also had certain inhibitory effect on C. perfringens type A with the number of C. perfringens decreased from 9×109 CFU·mL−1 to 9×108 CFU·mL−1 after mixed cultivation.
ConclusionRecombinant L. lactis expressing phage lysin Cp51 which against C. perfringens type A has been successfully constructed, which provides a basis for further optimization of expression and clinical application.
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Keywords:
- Clostridium perfringens /
- Lactococcus lactis /
- lysin /
- recombinant protein /
- antibacterial activity
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水稻Oryza sativa是我国的主要粮食作物之一，是保障我国粮食安全的压舱石。随着社会发展和人民生活水平的提高，稻米品质越来越成为人们关注的重点，稻米的食味品质、香味等性状越来越成为影响消费者喜好的重要因素[1]，具有香味的稻米尤其更具有市场优势。除优质外，高抗病性也是好的杂交稻品种的必备品质，而稻瘟病是我国水稻主要病害之一，近年来我国稻瘟病年发生面积约5×106 hm2[2]。聚合多个稻瘟病抗性基因、培育高抗水稻品种是防控稻瘟病最经济有效的途径。分子标记辅助选择(Molecular marker-assisted selection，MAS)技术通过与传统杂交育种相结合，可快速聚合和转移有利基因，进而提高选择效率，缩短育种年限，成为重要的育种辅助手段[3-7]。‘恒丰B’和‘广8B’是具有优良育种潜力的保持系材料，所分别对应的‘恒丰A’和‘广8A’育成的一系列三系杂交稻品种，丰产性好，优势明显[8]，但是在抗病性上还有改良的空间，同时这2个保持系稻米缺乏香味。本研究以‘恒丰B’和‘广8B’为材料，利用前期所创制的携带有Pita、Badh2等优异等位基因的保持系材料‘B39’，结合分子标记辅助选择，对2个保持系稻瘟病抗性和米质相关性状进行定向改良，以期得到优质、高抗的新保持系，为培育新的优质不育系和综合性状优良的杂交稻组合奠定材料基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
轮回亲本：保持系材料‘恒丰B’(广东省农科院水稻研究所利用‘黄壳香选’与保持系种质‘113B’杂交选育)；保持系材料‘广8B’(广东省农科院水稻研究所由‘增城丝苗−8选’和‘1325B’杂交选育)。‘恒丰B’和‘广8B’稻米无香味；‘恒丰B’稻瘟病抗性表现为中抗，‘广8B’稻瘟病抗性为抗。
供体亲本：国家植物航天育种工程技术研究中心选育的保持系材料‘B39’。该保持系材料具有香味，稻瘟病抗性表现为高抗。前期基因背景分析表明，‘B39’携带Pita、badh2等优异等位基因。本研究重点为对以上基因位点进行定向筛选。
1.2 群体构建与后代筛选路线
在2017年早造，分别以‘恒丰B’和‘广8B’为母本，以‘B39’为父本进行杂交；2017年晚造，种植相应F1，‘恒丰B’和‘广8B’分别作为轮回亲本，进行回交获得回交一代(BC1F1)；2018年早造，种植相应BC1F1，‘恒丰B’和‘广8B’分别作为轮回亲本，进行回交获得回交二代(BC2F1)；2018年晚造，种植相应BC2F1，‘恒丰B’和‘广8B’分别作为轮回亲本，进行回交获得回交三代(BC3F1)。每个回交世代中, 根据株叶形态选择外观与轮回亲本相似性最高的个体筛选目标基因型，再根据株高、抽穗期和粒型等农艺性状，确定改良单株，继续与轮回亲本回交。2019年早造种植相应BC3F1；2019年晚造种植相应BC3F2，并对F2群体的单株进行稻米品质、稻瘟病抗性及农艺性状考察。具体流程见图1。
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图 1 分子标记辅助选择(MAS)改良水稻保持系香味和稻瘟病抗性技术流程图Figure 1. Process scheme of improving rice fragrance and blast resistance of rice maintainer through molecular marker-assisted selection(MAS)1.3 水稻农艺性状调查与稻米品质性状鉴定
供试材料于2017年至2019年早、晚季种植于广州市华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心试验基地，田间管理(水、肥、病虫害防治等)按当地大田常规栽培要求实施。籽粒完熟期调查水稻主要农艺性状，稻谷收获烘干后放置3个月，按照农业部标准米质测定方法NY147—88[9]进行碾磨品质、外观品质、直链淀粉含量(Amylose content, AC)、胶稠度(Gel consistency, GC)和碱消值(Alkali spreading value, ASV)等理化指标的测定。稻米香味的测定采用较为便捷和准确的KOH浸泡法，称取2 g糙米放入试管中，加入10 mL 0.3 mol/L KOH溶液，加盖振荡使溶液和米粒充分接触，放入50 ℃烘箱加热10 min后，根据标准香味样品，打开试管进行香味鉴别，每个样品设置3个重复。
1.4 分子标记检测
采用CTAB法提取水稻幼嫩叶片基因组DNA。目标基因Badh2的基因分型采用毛细管电泳分析，PCR扩增产物检测采用自动荧光毛细管电泳(Fragment AnalyzerTM，USA)，利用PROSize 3.0对电泳结果进行分析，确定基因型。抗性基因Pita的基因分型采用高分辨率溶解曲线分析(High-resolution melting analysis，HRM)技术，该技术利用基因组单碱基差异对目的基因型进行区分，具体分析方法参考Luo等[10]。本试验中所涉及的引物由生工生物技术有限公司合成，具体序列信息见表1。
表 1 目标检测基因及引物序列Table 1. Target genes and molecular marker sequences分型方法
Genotyping method靶基因
Target
gene基因型
Allele表型 Phenotype 扩增产物/bp
Amplicon退火温度/℃
Annealing temperature正向/反向引物
Forward/reverse primer引物序列
Primer sequence毛细管电泳
Capillary electrophoresisBadh2 第7外显子
8 bp缺失
8 bp deletion
in the
7th exon香 Fragrant 360+215 57 正向 Forward GGGAGTTATGAA
ACTGGTAAAAAGA反向 Reverse AACCATAGGAG
CAGCTGAAATA无8 bp缺失
No 8 bp
deletion不香
Not fragrant368+188 57 正向 Forward CTTCCTTCAGG
TGTGCTAAACA反向 Reverse GAATGATGCTCA
AAGTGTCTTGA高分辨率溶
解曲线分析
HRMPita T 感 Sensitive 244+132 56 正向 Forward CCCAGGTTACAA
CTTACAAGGA反向 Reverse CTCTGAAGACG
TGAAGAGGATTG 抗 Resistant 244+160 56 正向 Forward CTTCTTTCTTT
CTCTGCCGTGG反向 Reverse TCATCAAGTCAG
GTTGAAGATGC1.5 抗稻瘟病测定
水稻材料的稻瘟病抗性鉴定采用病区自然诱发病鉴定方法[11]。2019年晚造亲本和6份‘恒丰B’的BC3F2改良株系以及8份‘广8B’的BC3F2改良株系种植于位于从化吕田的典型稻瘟病代表性自然诱发病圃，在该病圃进行田间穗颈瘟抗性测验。每品系种5行，每行5穴，每穴2~3苗，周边插植2行高感稻瘟病品种CO39。
1.6 改良株系测保
测定改良的后代株系对于相应不育系的雄性不育保持力。2019年早造分别选取‘恒丰B’的BC3F1和‘广8B’的BC3F1株系进行单株测保检测，2019年晚造套袋后调查单株不育系自交结实率。同时，利用碘−碘化钾染色法鉴定水稻花粉育性，最终根据自交结实率及育性检测结果保留测保全不育和高不育的保持系株系。
1.7 改良株系的遗传背景回复率测定
选取7份BC3F2改良材料，利用水稻20K SNP芯片对改良材料的遗传背景回复率进行分析。该部分分析工作由石家庄博瑞迪生物技术有限公司完成。
2. 结果与分析
2.1 回交后代的分子标记辅助筛选
对改良群体进行抗病基因Pita和香味基因Badh2的分子标记检测，其中Pita利用HRM进行基因分型分析，Badh2采用毛细管电泳进行基因分型分析。每造选取杂合基因型的材料与轮回亲本回交，BC3F2选取纯合抗病基因型的单株进行下一步筛选。香味基因分型结果显示，BC3F2改良材料均为携带优异香味基因Badh2(图2)。对抗病基因Pita的HRM基因分型分析可以对亲本及后代改良株系进行有效鉴定与筛选(图3)。‘恒丰B’与‘广8B’的改良后代BC3F2株系在该位点均携带有Pita抗性基因。
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图 2 亲本和改良后代BC3F2株系Badh2基因分型毛细管电泳结果M：DNA 标记；1：‘B39’；2：‘恒丰B’；3：‘广8B’；4~17：‘恒丰B’改良BC3F2株系；18~32：‘广8B’改良BC3F2株系Figure 2. Genotyping of Badh2 of parents and the genetically-improved BC3F2 lines detected by capillary electrophoresisM: DNA marker; 1: ‘B39’; 2: ‘Hengfeng B’; 3:‘Guang 8B’; 4−17: Improved BC3F2 lines from ‘Hengfeng B’; 18−32: Improved BC3F2 lines from ‘Guang 8B’![]()
图 3 亲本和改良后代BC3F2株系Pita基因分型HRM分析结果灰色曲线表示位点含纯合有利等位基因(‘B39’为此基因型)；红色曲线表示位点不含抗性有利等位基因；蓝色曲线表示位点杂合Figure 3. HRM genotyping of Pita of parents and the genetically-improved BC3F2 linesGrey lines represent the rice lines harboring elite homozygous allele(‘B39’has the genotype)，red lines represent the rice lines not carrying the elite allele, and blue lines represent the rice lines harboring heterozygous alleles2.2 回交后代株系的稻瘟病抗性鉴定
2019年晚造送测‘恒丰B’的BC3F2改良材料6份、‘广8B’的BC3F2改良材料8份，并进行病区自然诱发病鉴病圃测定。测抗结果显示，与轮回亲本‘恒丰B’相比，改良后代材料发病率为5%~20%，穗瘟病级分布1~3级， 80%改良材料稻瘟病抗性评价为“抗”，20%表现为“高抗”，抗病表现明显优于‘恒丰B’(表2)。与轮回亲本‘广8B’相比，改良后代材料发病率为5%~20%，穗瘟病级分布1~3级，75%改良材料稻瘟病抗性评价为“抗”，25%表现为“高抗”，抗病表现较亲本略有提升(表3)。
表 2 ‘恒丰B’改良后代BC3F2稻瘟病抗性鉴定结果Table 2. Rice blast resistance identification of the genetically-improved BC3F2lines from ‘Hengfeng B’材料
Material来源
OriginPita基因分型
Genotyping of Pita阳江穗瘟感病级数
Disease grade of neck
blast in Yangjiang发病率/%
Incidence评价
EvaluationH1 BC3F2(恒丰B/B39) 纯合 Homozygous 3 10 抗 Resistant H2 BC3F2(恒丰B/B39) 纯合 Homozygous 3 5 抗 Resistant H3 BC3F2(恒丰B/B39) 纯合 Homozygous 1 5 高抗 Highly resistant H4 BC3F2(恒丰B/B39) 杂合 Heterozygous 3 20 抗 Resistant H5 BC3F2(恒丰B/B39) 纯合 Homozygous 3 10 抗 Resistant H6 BC3F2(恒丰B/B39) 纯合 Homozygous 3 20 抗 Resistant A1 恒丰B 无 None 5 20 中抗 Medium resistant A3 B39 纯合 Homozygous 1 1 高抗 Highly resistant 表 3 ‘广8B’改良后代BC3F2稻瘟病抗性鉴定结果Table 3. Rice blast resistance identification of the genetically-improved BC3F2 lines from ‘Guang 8B’材料
Material来源
OriginPita基因分型
Genotyping of Pita阳江穗瘟病级
Disease grade of neck
blast in Yangjiang发病率/%
Incidence评价
EvaluationG1 BC3F2(广8B/B39) 纯合 Homozygous 3 5 抗 Resistant G2 BC3F2(广8B/B39) 纯合 Homozygous 1 5 高抗 Highly resistant G3 BC3F2(广8B/B39) 杂合 Heterozygous 3 20 抗 Resistant G4 BC3F2(广8B/B39) 纯合 Homozygous 3 20 抗 Resistant G5 BC3F2(广8B/B39) 纯合 Homozygous 3 10 抗 Resistant G6 BC3F2(广8B/B39) 纯合 Homozygous 3 10 抗 Resistant G7 BC3F2(广8B/B39) 杂合 Heterozygous 3 5 抗 Resistant G8 BC3F2(广8B/B39) 纯合 Homozygous 1 5 高抗 Highly resistant A2 广8B 无 None 3 20 抗 Resistant A3 B39 纯合 Homozygous 1 1 高抗 Highly resistant 2.3 改良后代株系主要农艺性状、稻米品质性状及香味鉴定结果
对‘恒丰B’和‘广8B’相应的BC3F2改良单株系主要农艺性状、稻米品质性状等进行了调查，结果显示，BC3F2改良单株系株高、剑叶长宽性状、结实率和长宽比等性状与原轮回亲本都较为相似。‘恒丰B’的BC3F2改良单株系虽然有效穗数均减少，但每穗粒数增加，因此千粒质量相对于亲本反而表现出一定优势；而‘广8B’的BC3F2改良单株系则相反，有效穗数均表现为增加，每穗粒数较亲本有的增加、有的减少，但总体而言千粒质量相对于亲本也表现出一定优势(表4)。改良后代株系在穗型方面较亲本相比，部分表现出穗长增加、着粒更密(图4、图5)；而在株型方面，大多数改良后代株型比亲本更紧凑(图6、图7)。
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图 4 ‘恒丰B’及其后代改良株系H2和H4穗型对比Figure 4. Panicles of ‘Hengfeng B’ and its genetically improved line，H2 and H4表 4 亲本和改良后代BC3F2株系的主要农艺性状Table 4. Main agronomic characteristics of parents and the genetically-improved BC3F2 lines材料
Material株高/cm
Plant
height剑叶
长/cm
Leaf length剑叶
宽/cm
Leaf width单株穗质量/g
Panicle
weight
per plant有效穗数
Effective panicle number穗长/cm
Panicle length每穗粒数
Grains per spike结实率/%
Seed setting rate长宽比
Grain length-to-width ratio千粒质量/g
1 000-seed weight恒丰B 108.6±0.07 37.3±2.78 2.3±0.06 27.2±1.42 9.0±0.00 22.4±0.33 180.4±8.80 80.3±0.67 4.5±0.02 19.7±0.23 H1 109.8 36.8 2.3 28.5 7 20.95 207.25 79.32 4.56 19.79 H2 108.7 38.5 2.3 29.1 7 24.12 199.42 81.15 4.33 19.56 H3 109.8 39.8 2.2 31.2 8 24.01 201.17 79.65 4.35 19.96 H4 111.3 35.8 2.4 27.6 8 20.62 197.25 81.02 4.34 19.71 H5 112.3 36.7 2.3 27.5 7 23.63 210.71 80.62 4.27 20.09 H6 106.5 40.6 2.3 29.8 7 21.71 198.60 80.31 4.32 20.11 广8B 109.9±0.75 37.3±0.34 1.9±0.03 30.8±2.52 7.6±0.33 22.2±0.43 206.5±3.40 73.0±1.15 4.1±0.12 15.8±0.03 G1 110.9 37.4 1.8 34.1 8 25.95 207.11 74.15 4.16 14.63 G2 111.3 38.5 1.9 28.8 8 23.36 196.75 75.03 4.14 14.93 G3 112.3 36.7 1.9 31.6 7 22.97 187.00 71.98 4.20 15.24 G4 111.2 35.7 2.0 32.8 9 22.33 195.08 71.65 4.06 15.61 G5 113.7 36.5 1.8 27.9 8 22.44 214.22 72.81 4.08 17.08 G6 112.8 38.5 1.8 28.5 8 21.83 202.88 76.01 4.12 16.08 G7 110.6 39.2 2.1 29.2 9 22.22 196.75 69.98 4.04 15.96 G8 112.4 37.5 1.9 28.9 8 23.14 189.64 71.65 4.16 16.15 B39 98.9±1.02 41.1±0.50 1.9±0.03 24.3±0.73 8.6±0.33 22.9±0.64 166.4±24.88 79.0±8.51 3.7±0.77 19.2±0.19 ![]()
图 5 ‘广8B’及其后代改良株系G4和G5穗型对比Figure 5. Panicles of ‘Guang 8B’ and its genetically improved lines, G4 and G5![]()
图 6 ‘恒丰B’及其后代改良株系H2和H4株型对比Figure 6. Plant types of ‘Hengfeng B’ and its genetically improved lines, H2 and H4![]()
图 7 ‘广8B’及其后代改良株系G4和G5株型对比Figure 7. Plant types of ‘Guang 8B’ and its genetically improved lines，G4 and G5‘恒丰B’和‘广8B’的BC3F2改良株系在稻米垩白和碾磨品质方面与相应轮回亲本差别不大；‘恒丰B’的BC3F2改良株系直链淀粉含量平均约为18.4%，‘广8B’的BC3F2改良株系直链淀粉含量平均约为17.5%，基本保持了各自亲本的低直链淀粉含量特性；在胶稠度方面，2个改良后代群体株系均表现出长胶属性，胶长在60 mm以上，碱消值在5.7左右；香味鉴定结果显示，所有改良材料均表现为有香味(表5)。
表 5 亲本和改良后代BC3F2株系的稻米品质性状Table 5. Rice quality traits of parents and the genetically-improved BC3F2 lines材料
Material垩白粒率/%
Chalky grain percentage垩白度/‰
Chalk
degree糙米率/%
Brown rice rate精米率/%
Milled rice ratio整精米率/%
Head yieldw(直链淀
粉)/%
Amylose
content胶稠度/mm
Gel consistency碱消值
Alkali spreading value香味性状
Fragrance恒丰B 4.3±0.16 13.8±0.12 73.8±0.48 62.7±0.61 50.1±0.64 18.6±0.41 61.7±0.26 5.7±0.17 不香 H1 4 13.67 72.97 63.14 50.91 18.54 63.4 5.74 香 H2 3 12.57 74.55 63.25 49.67 17.56 62.9 5.68 香 H3 3 14.52 74.96 63.21 51.34 19.45 63.7 5.64 香 H4 4 11.54 73.53 64.50 50.29 18.21 61.7 5.24 香 H5 5 13.24 71.97 61.34 51.98 17.96 62.8 5.36 香 H6 5 12.47 72.58 62.25 50.47 18.47 63.7 5.28 香 广8B 3.9±0.64 19.7±0.25 71.6±0.67 61.8±0.94 51.5±0.47 17.9±0.28 63.8±0.54 5.6±0.23 不香 G1 4 18.45 71.45 61.47 51.74 17.58 64.5 5.91 香 G2 3 17.21 70.86 60.57 51.02 17.12 65.3 5.64 香 G3 4 16.84 70.67 60.97 50.86 18.56 64.1 5.17 香 G4 5 19.57 71.96 61.56 50.34 18.23 65.8 5.87 香 G5 3 16.58 71.54 61.32 51.21 17.56 64.7 5.63 香 G6 4 18.59 71.61 61.87 51.23 16.87 65.9 5.67 香 G7 4 15.34 70.34 60.25 50.67 17.54 66.7 5.85 香 G8 3 18.57 72.47 62.19 51.11 16.98 64.8 5.47 香 B39 3.1±0.25 12.9±0.64 75.4±0.23 64.9±0.47 53.8±0.96 16.4±0.84 65.9±0.78 5.4±0.36 香 2.4 改良材料测保结果
在2019年早造对‘恒丰B’和‘广8B’的BC3F1进行了单株测保检测。2019年晚造测保结果显示，23个BC3F1代材料对应的测保小区中，16个小区不育等级为全不育和高不育、4个小区为半不育等级，3个小区材料为正常可育等级。BC3F1测保材料中69.57%不育等级为全不育和高不育，17.39%为半不育，13.04%为正常可育，可育率达到30.43%。测保成功的株系花粉活力分析结果显示，花粉染色为典型败育类型(图8A、8B)；测保不育株株型调查显示，不育株株型正常(图8C、8D)。
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图 8 部分测保不育株花粉活力与株型调查结果A：H2测保不育株花粉；B：G3测保不育株花粉；C：H2测保不育株株型；D：G3测保不育株株型Figure 8. Pollen vigors and plant types of partial sterile linesA: Pollen from sterile line maintained by H2; B: Pollen from sterile line maintained by G3; C: Plant type of sterile line maintained by H2; D: Plant type of sterile line maintained by G32.5 改良材料遗传背景回复率
利用分布于水稻12条染色体上共26170个SNP标记探针，检测改良后代材料的遗传背景回复率。结果显示，改良材料的平均遗传背景回复率达到86.16%，其中最高达到89.16%，最低为81.29%(表6)。以上研究结果表明，经过三代回交后改良材料的遗传背景回复率达到预期目标。杂合SNP位点所占比例约为3%，表明染色体上还存在一定比例的杂合位点。
表 6 部分改良BC3F2株系遗传背景回复率Table 6. Genetic background reversion rate of some genetically-improved BC3F2 lines材料
Material遗传背景回复率/%
Genetic background
reversion rate杂合SNP位点
比例/%
Percentage of
heterozygous SNP lociH1 85.64 3.16 H2 83.71 5.19 H3 86.96 2.17 G1 89.14 3.67 G2 87.23 2.96 G3 89.16 1.39 G4 81.29 4.61 平均 Average 86.16 3.31 3. 讨论与结论
3.1 稻瘟病抗性和稻米香味性状改良
水稻稻瘟病是水稻产区最主要的病害，培育稻瘟病抗性品种是育种专家的重要育种目标。目前已经报道了100多个主效抗病基因，其中36个已经成功克隆，如Pi-ta、Pi2、Pi9、Piz-t、Pigm、Pik、Pi5、Pi1 等[12]。利用分子标记辅助选择技术将稻瘟病抗性基因聚合是防治稻瘟病害最经济、最有效的途径[13]。通过传统育种方法与分子标记辅助选择方法的有机结合，可克服传统表型鉴定的局限性，能够快速准确地对基因型进行直接选择，聚合多个有利基因，加快育种进程[14-16]。本研究中，‘恒丰B’和‘广8B’的稻瘟病抗性分别为中抗与抗级别，通过聚合Ptia后，部分改良材料表现出高抗水平。对稻瘟病抗性基因进行聚合选择，可以进一步提高改良品种在广东地区表现出普适的稻瘟病抗性。
另外，随着优质香米市场需求的不断增加，育种家对稻米香味性状的培育也日益重视。已有研究表明，香味性状的主效基因是位于水稻第8号染色体上的Badh2基因，该基因编码甜菜碱醛脱氢酶，当Badh2基因突变，突变类型中甜菜碱醛脱氢酶活性丧失，可能导致γ−氨基丁醛在体内积累，进而使γ−氨基丁醛转化为1−吡咯啉，最终合成大量的2−AP积累，进而使稻米产生香味[17-19]。用基于该香味基因设计的分子标记进行辅助选择, 为进一步提高香稻育种选择效率和准确性提供了可能[20]。本研究中，利用香味分子标记对改良材料进行筛选，携带有Badh2有利等位基因的材料，经香味鉴定稻米都具有香味，表明该分子标记在香味性状筛选中起到了有力的作用。
在保持系的改良中，对于供体亲本的选择，除了考虑是否携带控制目标性状的目的基因外，同时应考虑对轮回亲本保持力的影响，否则会对保持系的背景产生一定的干扰[21]。本研究中，BC3F1测保材料中还存在有部分半不育及可育现象，原因可能是供体亲本‘B39’携带了恢复基因。因此，定向改良育种中，需要考虑供体亲本的背景对改良对象的影响，否则可能会影响定向改良成功率。
通过分子标记辅助筛选，结合抗病性鉴定、香味鉴定和农艺性状的选择，本研究成功获得14份含有目标基因的BC3F2改良材料(其中，‘恒丰B’的改良材料6份，‘广8B’的改良材料8份)；且多数株系的遗传背景回复率在80%~90%之间，基本达到预期回复效果。改良后的目标株系中87.5%香味评级为香味较浓；稻瘟病抗性有显著提高，病圃抗性鉴定抗稻瘟病等级为抗或高抗稻瘟病；稻米品质表现为米粒细长、低直链淀粉、低垩白；其他农艺经济性状与轮回亲本相似。分子标记辅助筛选与传统选、育种的结合，切实地缩短了育种进程、提高了种质改良的成功率。
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图 1 重组质粒PNZ 8148-Cp51的酶切鉴定
M：DNA marker DL5000；1：大肠埃希菌中构建的阳性质粒；2：乳酸菌NZ9000中的重提质粒
Figure 1. Identification of recombinant plasmid PNZ 8148-Cp51 by enzyme digestion
M：DNA marker DL5000; 1: Positive plasmid in Escherichia coli; 2: Positive plasmid extracted from Lactococcus lactis NZ9000
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图 2 NZ9000/PNZ8148-Cp51蛋白纯化SDS-PAGE电泳图
M：蛋白marker；1：蛋白流穿液；2：初次洗涤液；3：末次洗涤液；4：150 mmol·L−1咪唑洗脱液
Figure 2. SDS-PAGE analysis of purified NZ9000/PNZ8148-Cp51 protein
M: Protein marker; 1: Flow-through solution; 2: First washing solution; 3: Last washing solution; 4: 150 mmol·L−1 imidazole elution
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图 3 NZ9000/PNZ8148-cp51 Western Blot检测结果
M：蛋白marker；1：NZ9000/PNZ8148-Cp51诱导培养液上清；2：NZ9000/PNZ8148(空载)诱导菌；3：NZ9000/PNZ8148-Cp51诱导菌；4：NZ9000/PNZ8148-Cp51不诱导菌；5：NZ9000/PNZ8148诱导条带；6：NZ9000/PNZ8148-Cp51诱导破碎上清；7：NZ9000/PNZ8148-Cp51诱导破碎沉淀
Figure 3. Detection of NZ9000/PNZ8148-Cp51 by Western Blot
M: Protein marker; 1: NZ9000/PNZ8148-Cp51 induced supernatant; 2: NZ9000/PNZ8148(negative control) induced bacteria; 3: NZ9000/PNZ8148-Cp51 induced bacteria; 4: NZ9000/PNZ8148-Cp51 non-induced bacteria; 5: NZ9000/PNZ8148 supernatant; 6: NZ9000/PNZ8148-Cp51 induced supernatant; 7: NZ9000/PNZ8148-Cp51 induced precipitate
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图 4 不同浓度NZ9000/PNZ8148-Cp51噬菌体裂解酶对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性
Figure 4. Antibacterial activities of different concentrations of NZ9000/PNZ8148-Cp51 phage lysin against Clostridium perfringens type A
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