Effect of pagP gene deletion on outer membrane characteristics of avian pathogenic Escherichia coli
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摘要:目的
研究pagP基因缺失对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)外膜特性的影响。
方法采用最低抑菌浓度(MIC)试验探索pagP基因缺失对菌株生物被膜通透性的影响；通过菌体自聚合试验、外膜疏水性试验以及生物被膜形成条件，分析pagP基因缺失对生物被膜形成能力的影响，并在扫描电镜下观察细菌生物被膜形态。
结果pagP基因缺失后，菌株MIC降低，菌株的外膜通透性增强且菌体自聚合能力显著增强(P<0.01)，其中红霉素和氨苄西林的MIC分别为7 和20 μg/mL，菌株自聚合能力为87.89%；pagP基因缺失对菌株外膜疏水性无显著影响，疏水性仅为5.337%；随着细菌在LB培养基中静置培养时间的延长，生物被膜形成量增多；pagP基因缺失株的生物被膜形成能力高于野生株。
结论pagP基因缺失可使APEC外膜特性发生改变，生物被膜形成能力增强。
Abstract:ObjectiveTo study the effect of pagP gene deletion on outer membrane characteristics of avian pathogenic Escherichia coli(APEC).
MethodThe minimal inhibitory concentration (MIC) experiment was used to explore the effect of pagP deletion on the permeability of outer membrane of strain. Autoaggregation experiment, outer membrane hydrophobicity test, and analysis of biofilm-forming conditions of strain were performed to understand the influence of pagP deletion on biofilm-forming ability. The biofilm morphology was observed by scanning electron microscopy.
ResultThe MIC of strain decreased after the deletion of pagP gene, the outer membrane permeability of strain increased, and the autoaggregation ability of strain increased significantly (P<0.01). The MICs of erythromycin and ampicillin were 7 and 20 μg/mL respectively. The autoaggregation ability of strain was 87.89%. The deletion ofpagP gene had no significant effect on the hydrophobicity of outer membrane of strain, and the hydrophobicity was only 5.337%. The amount of biofilm increased with the increase of time when the strain was cultured in LB medium. The strain with pagP deletion had higher biofilm-forming ability than wild strain.
ConclusionThe deletion of pagP gene can change the characteristics of outer membrane of APEC and enhance the biofilm-forming ability.
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Keywords:
- avian pathogenic Escherichia coli /
- pagP gene /
- biofilm /
- hydrophobicity /
- autoaggregation ability
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氧化亚氮(N2O)是重要的温室气体之一，其单位质量的增温潜能是二氧化碳的265倍[1]。农田土壤是N2O的主要排放源，农田排放量约占全球N2O排放总量的25%[2]。农田施用氮肥引起的N2O排放占土壤总N2O排放增量的70%[3]。与此同时，农田施肥通常伴随着灌溉，灌溉改变了土壤水分状况，灌水量、灌水方式和灌水频率等措施均会对土壤N2O的排放产生影响[4]。因此，研究合理的水肥管理对降低农田N2O排放有重要意义。
土壤N2O是硝化与反硝化过程的中间产物[5]，无机氮作为硝化和反硝化作用的底物，其含量高低能影响土壤N2O的排放，而土壤无机氮含量则会随施氮水平的提高而提高[6-7]。相对于传统的大水漫灌、沟灌等，滴灌施肥技术能将水肥均匀、适量、精确地输送到作物根部土壤，不仅能有效提高氮肥利用率，还能通过改变土壤通气性、水分运移及有效氮分布情况等，从而影响土壤硝化和反硝化作用[8-9]。前人研究表明，滴灌施肥技术将养分施到作物根层，减少土壤NO3−-N的累积，改变NH4+和NO3−浓度和分布，影响土壤酶活性，从而影响土壤N2O的排放[10]。谢海宽等[11]发现相同氮肥施用量下，滴灌相比常规漫灌在提高作物产量的同时，N2O排放总量减少29.4%~35.1%，而且没有显著的年际差异。于亚泽等[12]研究也发现，N2O排放量随施氮量的增加而增加，滴灌与沟灌相比可有效降低N2O排放。大量研究还表明，滴灌施肥技术下的土壤水分及养分条件与常规漫灌或沟灌的有显著差异[13]，影响了土壤氮素转化过程[14]及N2O排放。
玉米是我国第一大粮食作物，对我国粮食安全有重大意义[15]，且广西是全国玉米生产一年两熟或者三熟的地区之一[16]，因此对种植玉米土壤N2O排放研究有重要意义。当前滴灌施肥的研究主要集中在与传统施肥的比较和不同施氮量等方面，而关于等氮肥用量下滴灌施氮对玉米土壤无机氮含量变化及土壤N2O排放的影响报道较少。因此，本文通过田间试验，研究不同滴灌灌水量和施氮比例对玉米生育时期土壤N2O排放通量和土壤无机氮含量的影响，并分析玉米土壤N2O排放通量和土壤无机氮含量的关系，以获得玉米种植土壤N2O减排的滴灌施肥模式，并揭示不同滴灌灌水量和施氮比例下土壤无机氮含量对土壤N2O排放的影响。
1. 材料与方法
1.1 试验地点及材料
田间试验在广西大学试验基地(N 22°51′12″，E 108°17′26″)移动防雨棚内进行。该移动棚通风、透光，可以保障作物生长期间自然光照和温度，可通过电控传感器调节移动棚的遮蔽或移开，雨天时根据试验处理选择避雨，非降雨时将移动棚移开。
供试土壤为赤红壤，试验前0~20 cm耕层土壤的主要理化性质如下：容重1.42 g·cm−3(环刀法)，田间持水量24.9%(质量含水量，环刀法)，pH 6.7(水土质量比2.5︰1.0，pH计法)，有机质17.39 g·kg−1(重铬酸钾容量法–外加热法)，全氮1.3 g·kg−1(半微量开氏法)，碱解氮94.52 mg·kg−1(NaOH碱解扩散法)，速效磷99.78 mg·kg−1[0.05 mol·L−1 HCl–0.025 mol·L−1(1/2 H2SO4)浸提，比色法]，速效钾85.6 mg·kg−1(1 mol·L−1中性NH4OAc浸提，火焰光度法)。
供试作物为春季玉米和夏季玉米(生食水果玉米)，品种均为农友利–美珍。
1.2 试验方法与管理
试验设3种滴灌灌水量(以下简称灌水量)，W60、W80和W100分别为田间持水量的50%~60%、70%~80%和90%~100%；设2种滴灌施氮比例(以下简称施氮比例)，F55为50%氮肥作基肥土施，50%氮肥作滴灌施肥(苗期30%，拔节期40%，孕穗期30%)，F37为30%氮肥作基肥土施，70%氮肥作滴灌施肥(苗期30%，拔节期40%，孕穗期30%)，试验为完全方案设计，共6个处理，每个处理重复3次，共18个小区，每小区面积8.64 m2。小区之间用水泥砖墙(厚25 cm，深120 cm)隔开，做到各处理水分养分不相互渗透。每个小区种植4行玉米，行距60 cm，株距30 cm，靠近各小区边缘的两行，距离小区边缘30 cm。穴播方式进行播种，每穴留苗1株，每行种植12株。本研究共进行2次试验，试验1为春季玉米，试验2为夏季玉米。
各处理肥料施用量一致，N、P2O5和K2O总施用量分别为180、90 和180 kg · hm−2。氮肥为尿素(N质量分数为46.2%，重庆建峰化工股份有限公司产品)，磷肥为钙镁磷肥(P2O5质量分数为17%，广西鹿寨万强化肥有限责任公司产品)，钾肥为氯化钾(K2O质量分数为60%，中化化肥有限公司产品)。所有处理磷钾肥均作为基肥，氮肥按照试验设计比例施入基肥和追肥。基肥按穴施方式施入土壤，追肥采用滴灌施肥方式，先将尿素溶入一定量水中，将尿素溶液通过滴灌系统施入土壤。定苗后采用便携式土壤水分测量仪(TRIME-PICO-IPH TDR)观测土壤含水量，确保各处理土壤水分在试验设定范围内。每行玉米摆放一条滴灌带，用水表控制灌水量，不同处理各生育期灌水量见表1。
表 1 玉米各生育期不同水肥处理的灌水量1)Table 1. Irrigation amount at each growth stage of maize in different water and fertilizer treatmentsmm 季节 Season 生育期 Growth stage W60F37 W60F55 W80F37 W80F55 W100F37 W100F55 春季 Spring 苗期 Seedling stage 57.9 57.9 90.0 91.3 114.6 115.3 拔节期 Jointing stage 103.1 108.2 142.2 156.6 216.6 214.2 抽穗期 Heading stage 95.1 70.9 117.4 96.0 153.9 153.5 成熟期 Maturing stage 36.3 52.5 84.9 89.2 119.2 119.7 合计 Total 292.3 289.5 434.5 433.1 604.3 602.7 夏季 Summer 苗期 Seedling stage 57.9 57.9 69.4 69.4 81.0 81.0 拔节期 Jointing stage 147.3 139.8 215.3 232.7 283.5 286.9 抽穗期 Heading stage 93.8 105.6 143.2 119.1 199.5 190.3 成熟期 Maturing stage 19.1 11.7 47.7 56.5 70.2 74.4 合计 Total 318.0 314.9 475.6 477.7 634.2 632.7 1) W60、W80和W100分别为田间持水量的50%~60%、70%~80%和90%~100%；F55： 50%氮肥作基肥土施、50%氮肥作滴灌施肥；F37：30%氮肥作基肥土施、70%氮肥作滴灌施肥 1) W60, W80 and W100 are 50%−60%, 70%−80% and 90%−100% of field water holding capacity, respectively; F55: 50% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 50% nitrogen fertilizer as fertigation; F37: 30% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 70% nitrogen fertilizer as fertigation 1.2.1 春季玉米管理
于2021年4月9日将作为基肥部分的尿素、钙镁磷肥以及氯化钾施入各试验小区。4月10日播种，每穴播已催芽露白的玉米种子5粒，4月17日出苗，4月20日定苗，每穴留1株。4月23日苗期用滴灌系统施用尿素，5月1日进行第1次培土，5月4日拔节期用滴灌系统施用尿素，5月20日进行第2次中耕培土，5月22日孕穗期用滴灌系统施用尿素，于6月24日收获鲜食玉米。春季玉米生育时期为：苗期4月10—28日；拔节期4月29日—5月19日；抽穗期5月20日—6月8日；成熟期6月9—24日，共76 d。
1.2.2 夏季玉米管理
于2021年8月9日将作为基肥部分的尿素、钙镁磷肥以及氯化钾施入各试验小区。8月10日播种，每穴播已催芽露白的玉米种子5粒，8月16日出苗，8月19日定苗，每穴留1株。8月21日苗期用滴灌系统施用尿素，8月28日进行第1次培土，9月1日拔节期用滴灌系统施用尿素，9月18日进行第2次中耕培土，9月19日孕穗期用滴灌系统施用尿素，于10月20日收获鲜食玉米。夏季玉米生育时期为：苗期8月10—26日；拔节期8月27日—9月17日；抽穗期9月18日—10月7日；成熟期10月8—20日，共71 d。
1.3 样品采集和测定
1.3.1 N2O气体收集及测定
用静态箱法收集N2O气体，静态箱用不锈钢制成，包括底座和箱盖两部分，底座和箱盖之间用橡胶垫圈密封。底座为正方形，高度30 cm，边长37 cm，带有凹槽，在播种前一周埋入地下30 cm，置于玉米行间，压实底座周围土壤，保证其密封状态。箱盖为顶部密封的正方形柱体，高度25 cm，边长35 cm，每个静态箱装有取样端口、温度探头和小风扇。每个小区放置1个静态箱(玉米行之间中部)，施肥后1、3、5 d采样，不施肥时，间隔7 d采样。采样时间为上午09:00开始，采样时将箱盖放至凹槽处灌满水的底座上，分别于0、10、20和30 min用50 mL医用注射器(成都市新津事丰医疗器械有限公司)取样。用Agilent 7890A气相色谱仪(美国安捷伦科技公司)中ECD检测器测定样品中的N2O浓度，检测温度为350 ℃，柱温60 ℃，氢气流速为40 mL·min−1，载气为99.99%高纯氩/甲烷气(95%氩气＋5%甲烷，体积分数)。手动打入气样20 mL至ECD检测器中，每组气体样品进样时间为4.45 min。
土壤N2O通量是指单位时间内通过单位面积的N2O质量，可根据箱内气体浓度的变化计算得出。计算公式如下[17]：
$$ F＝\dfrac{P\times M}{(T+273)\times R}\times H\times \dfrac{\mathrm{d}c}{\mathrm{d}t} \text{，} $$ (1) 式中：F为土壤N2O通量，µg·m−2·h−1；P为标准大气压(1.013×105 Pa)；M为N2O气体的摩尔质量分数(44.0 g·mol−1)；H为箱体高度(25 cm)；T为采气时箱体内的平均温度， ℃；R为气体常数(8.314 J·mol−1·kg−1)；dc/dt为土壤N2O排放速率，µL·m−3·h−1。
不同生育期N2O排放量(
${f}$ )是相邻两次气体通量平均值乘以间隔时间，再累加而得。$$ {f}={\displaystyle\sum} _{i}^{n}\left[\dfrac{({F}_{i}+{F}_{i-1})}{2}\times t\times 24\times {10}^{-2}\right] \text{，} $$ (2) 式中：Fi为第i次所测土壤N2O通量；Fi−1为第i−1次所测土壤N2O通量；t为相邻两次采集气体间隔时间，d；n为同一生育期N2O测定次数。全生育期N2O总排放量为不同生育期N2O排放量之和。
1.3.2 土壤采集及测定
每次在滴灌系统施用氮肥第2天(苗期在出苗日采土)，使用不锈钢土钻(直径6 cm)按照5点采样法采集各试验小区0~20 cm耕层土壤，剔除杂草、碎石和根系后，放入对应编号密封袋，带回实验室置于4 ℃冰箱保存，用于铵态氮、硝态氮和亚硝态氮含量的测定。
土壤无机氮(铵态氮、硝态氮、亚硝态氮)含量用0.01 mol·L−1的CaCl2浸提后，采用连续流动化学分析仪AA3(德国Bran + Luebbe公司)测定[18]。
1.4 统计分析
采用Microsoft Excel 2019和SPSS 26.0软件对试验数据进行统计分析。显著性检验用方差分析法，多重比较用Duncanʼs法，用Pearson法分析土壤N2O通量和土壤无机氮含量之间的相关性。
2. 结果与分析
2.1 土壤N2O排放
2.1.1 土壤N2O通量
不同处理下春季和夏季玉米生育期内土壤N2O通量的变化见图1。2次试验土壤N2O通量排放高峰均出现在每次灌溉及施肥之后。春季玉米试验中(图1a)，在W60和W80处理下，施肥后N2O通量均表现为施氮比例F37 > F 55，而在W100处理下，则表现为F37 < F 55。在F37处理下，施肥后N2O通量除拔节期以外，其余时期均表现为W60 < W 80 < W 100。在F55处理下，施肥后N2O通量拔节期表现为W80 < W 60 < W 100，其余时期均表现为W60 < W 80 < W 100。W100处理下，施肥后N2O通量高于W60和W80，说明高水分处理下土壤N2O排放相较于中、低水分处理更多。在相同水分、不同施氮比例处理下，施肥后N2O通量表现为F55 < F 37，说明施肥比例F55土壤N2O排放相较于F37更低。
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图 1 不同处理下春季和夏季玉米土壤N2O通量的变化图中向下箭头所指为施肥时间；W60、W80和W100分别为田间持水量的50%~60%、70%~80%和90%~100%；F55：50%氮肥作基肥土施、50%氮肥作滴灌施肥；F37：30%氮肥作基肥土施、70%氮肥作滴灌施肥Figure 1. Changes of N2O fluxes in spring and summer maize soil under different treatmentsThe downward arrow in the figure represents each fertilization time; W60, W80 and W100 were 50%−60%, 70%−80% and 90%−100% of field water holding capacity, respectively; F55: 50% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 50% nitrogen fertilizer as fertigation; F37: 30% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 70% nitrogen fertilizer as fertigation夏季玉米试验中(图1b)，在3个水平的灌水量处理下，施肥后N2O通量除苗期表现为施氮比例F37 < F 55以外，其他时期均表现为F37 > F 55。F37处理下，施肥后N2O通量在拔节期和成熟期为W60 < W 80 < W 100，苗期为W60 < W 100 < W 80，抽穗期为W100 < W 60 < W 80。F55处理下，施肥后拔节期和抽穗期的N2O通量为W60 < W 80 < W 100，苗期为W100 < W 60 < 80，成熟期为W80 < W 100 < W 60。总的来看，W100处理下施肥后N2O通量除抽穗期外均高于W60和W80，相同灌水量下，施肥后除苗期外，N2O通量表现为施氮比例F55 < F 37。
2.1.2 土壤N2O累积排放量
不同处理对春季和夏季玉米土壤N2O累积排放量的影响见表2。春季玉米试验中，W60处理下除成熟期外，其余时期F37处理的土壤N2O累积排放量显著高于F55；W80处理下，抽穗期F37处理的土壤N2O累积排放量较F55显著高48.3%。施氮比例F37处理下，拔节期W60的土壤N2O累积排放量显著高于W80和W100，分别高48.4%和31.6%；施氮比例F55处理下苗期和抽穗期各水分处理土壤N2O累积排放量均表现为W100 > W 80 > W 60。从整个生育期土壤N2O累积排放总量来看，W60F55处理显著低于其他处理，W80F55次之。
表 2 不同处理下玉米各生育期土壤N2O累积排放量及方差分析1)Table 2. Cumulative emissions of N2O at each growth stage of maize under different treatmentsg·hm−2 季节 Season 水分处理(W) Water treatment 施氮比例(F) Fertigation proportion 苗期 Seedling stage 拔节期 Jointing stage 抽穗期 Heading stage 成熟期 Maturing stage 总计 Total 春季 W60 F37 45.20±2.94a 32.36±0.60a 23.02±1.17bc 15.01±1.14a 115.59±3.25a Spring F55 22.30±1.66c 24.54±1.22b 14.59±1.96d 11.51±0.86a 72.94±3.91c W80 F37 37.72±2.29ab 21.80±1.90b 27.62±3.24ab 15.59±1.83a 102.74±8.19ab F55 25.18±1.37bc 20.89±1.90b 18.63±0.73cd 14.98±0.23a 79.68±3.46bc W100 F37 50.81±7.95a 24.59±1.99b 29.90±2.20ab 19.02±5.95a 124.31±16.48a F55 42.41±6.53a 23.81±2.82b 34.00±2.60a 13.16±1.52a 113.38±3.37a 夏季 W60 F37 19.09±0.99b 22.66±1.24c 16.14±0.13d 11.80±0.25c 69.69±2.55c Summer F55 21.47±0.33ab 16.05±0.63d 20.59±1.54b 15.89±0.89a 74.01±2.46bc W80 F37 23.21±0.17a 26.34±0.34b 32.11±0.13a 13.00±0.18bc 94.66±0.67a F55 21.38±1.64ab 18.87±0.76d 17.83±0.24cd 10.08±0.06d 68.60±0.89c W100 F37 22.31±1.41ab 32.24±0.58a 20.77±0.03b 16.56±0.23a 91.88±2.01a F55 20.95±0.42ab 22.67±1.55c 19.21±0.38bc 13.79±0.41bc 76.62±1.50b 春季 P W < 0.05 < 0.01 < 0.01 0.569 < 0.01 Spring F < 0.01 0.060 < 0.05 0.155 < 0.01 W×F 0.297 0.141 < 0.05 0.631 0.181 夏季 W 0.120 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 Summer F 0.883 < 0.01 < 0.01 0.156 < 0.01 W×F 0.136 0.309 < 0.01 < 0.01 < 0.01 1)表中数据为平均值±标准误；相同玉米季的同列数据后，不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncanʼs法)；W60、W80和W100分别为田间持水量的50%~60%、70%~80%和90%~100%；F55：50%氮肥作基肥土施、50%氮肥作滴灌施肥；F37：30%氮肥作基肥土施、70%氮肥作滴灌施肥 1)The values in the table are means ± standard errors; Different lowercase letters in the same column of the same maize-season indicate significant difference among treatments (P<0.05, Duncan’s test); W60, W80 and W100 were 50%−60%, 70%−80% and 90%−100% of field water holding capacity, respectively; F55: 50% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 50% nitrogen fertilizer as fertigation; F37: 30% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 70% nitrogen fertilizer as fertigation 夏季玉米试验中，W60处理下，拔节期F37土壤N2O累积排放量较F55显著高41.2%，而抽穗期和成熟期则显著低21.6%和25.7%；W80处理下除苗期外，F37土壤N2O累积排放量均显著高于F55；W100处理下，拔节期和成熟期F37土壤N2O累积排放量较F55分别高42.2%和20.1%。施氮比例F37处理下，苗期W80土壤N2O累积排放量较W60显著高21.6%，成熟期W100土壤N2O累积排放量显著高于W60和W80。施氮比例F55处理下，拔节期W100土壤N2O累积排放量显著高于W60和W80，成熟期W80土壤N2O累积排放量显著低于W60和W100。从整个生育期土壤N2O累积排放总量来看， W60F37和W80F55处理的土壤N2O累积排放量均较低。
2.2 土壤无机氮含量
2.2.1 铵态氮含量
不同处理对春季玉米和夏季玉米不同生育时期土壤铵态氮含量的影响见表3。总的来看，2季玉米种植土壤铵态氮含量随着玉米生长都表现为先增加再减少，成熟期土壤铵态氮含量相对于苗期有增加。春季玉米试验中，施氮比例F37处理下，4个时期各水分处理的土壤铵态氮含量之间差异显著，均表现为W100 > W 80 > W 60；施氮比例F55处理下，除苗期外土壤铵态氮含量与F37规律一致。从水分处理来看，除苗期外，其余时期土壤铵态氮含量均为W100 > W 80 > W 60。
表 3 不同处理下玉米各生育期土壤铵态氮含量1)Table 3. Soil ammonium nitrogen content at each growth stage of maize under different treatmentsg·hm−2 季节 Season 水分处理 Water treatment 施氮比例 Fertigation proportion 苗期 Seedling stage 拔节期 Jointing stage 抽穗期 Heading stage 成熟期 Maturing stage 春季 Spring W60 F37 12.38±0.64c 20.76±0.60c 25.05±0.66d 18.03±0.40c F55 13.43±0.91bc 21.02±0.67c 25.72±0.76d 18.13±0.68c W80 F37 15.11±0.48b 26.86±0.30b 30.12±0.23c 20.87±0.66b F55 14.98±0.86b 27.22±0.63b 33.77±0.25b 20.48±0.79b W100 F37 21.02±0.78a 28.81±1.08a 39.68±0.70a 26.74±0.73a F55 20.11±0.73a 28.46±0.14a 39.70±0.49a 26.92±0.76a 夏季 Summer W60 F37 21.57±0.01d 27.22±0.06d 29.19±0.05f 25.62±0.33d F55 20.40±0.65d 31.82±0.22c 30.95±0.05e 25.72±0.51d W80 F37 23.27±0.37c 32.47±0.32c 39.71±0.46c 37.96±0.58c F55 25.04±0.05b 34.06±0.03b 37.66±0.68d 37.06±1.02c W100 F37 27.60±0.78a 32.74±0.71c 46.59±0.12b 40.87±0.38b F55 27.50±0.77a 39.20±0.44a 50.58±0.21a 44.40±0.31a 1)表中数据为平均值±标准误；相同玉米季的同列数据后，不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncanʼs法)；W60、W80和W100分别为田间持水量的50%~60%、70%~80%和90%~100%；F55：50%氮肥作基肥土施、50%氮肥作滴灌施肥；F37：30%氮肥作基肥土施、70%氮肥作滴灌施肥 1)The values in the table are means ± standard errors; Different lowercase letters in the same column of the same maize-season indicate significant difference among treatments (P<0.05, Duncan’s test); W60, W80 and W100 were 50%−60%, 70%−80% and 90%−100% of field water holding capacity, respectively; F55: 50% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 50% nitrogen fertilizer as fertigation; F37: 30% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 70% nitrogen fertilizer as fertigation 夏季玉米试验中，W60处理下，拔节期和抽穗期F55土壤铵态氮含量较F37分别提高16.9%和6.0%；W80处理下，苗期和拔节期F55土壤铵态氮含量较F37分别提高7.6%和4.9%，而抽穗期则相反，F55土壤铵态氮含量较F37低5.2%；W100处理下，拔节期、抽穗期和成熟期F55土壤铵态氮含量较F37分别提高19.7%、8.6%和8.6%，且差异显著。施氮比例F55处理下，各生长期土壤铵态氮含量均表现为W100 > W 80 > W 60，且除拔节期F37W80与F37W100以外，差异均显著。施氮比例F37处理下，土壤铵态氮含量变化与F55规律一致，且除拔节期W80与W100以外，差异均显著。
2.2.2 硝态氮含量
不同处理对春季玉米和夏季玉米不同生育时期土壤硝态氮含量的影响见表4。春季玉米试验中，W60处理下，抽穗期F55土壤硝态氮含量较F37提高19.1%；W80处理下，苗期和抽穗期F55土壤硝态氮含量较F37分别提高7.0%和52.8%；W100处理下，拔节期和成熟期F37土壤硝态氮含量较F55分别提高37.1%和7.2%。施氮比例F37处理下，不同水分处理土壤硝态氮含量表现为：苗期和拔节期W100 > W 80 > W 60，抽穗期W60低于W80和W100，成熟期W100 > W 60 > W 80；施氮比例F55处理下，不同水分处理土壤硝态氮含量表现为：苗期W60显著低于W80和W100，拔节期和抽穗期W80高于W100和W60，成熟期W100显著高于W60和W80。
表 4 不同处理下玉米各生育期土壤硝态氮含量1)Table 4. Soil nitrate nitrogen content at each growth stage of maize under different treatmentsg·hm−2 季节 Season 水分处理 Water treatment 施氮比例 Fertigation proportion 苗期 Seedling stage 拔节期 Jointing stage 抽穗期 Heading stage 成熟期 Maturing stage 春季 Spring W60 F37 4.39±0.21c 4.18±0.07b 2.77±0.03d 2.88±0.08c F55 4.17±0.25c 4.72±0.27b 3.30±0.13c 2.46±0.04d W80 F37 7.69±0.16b 5.70±0.15a 3.90±0.20b 2.35±0.03d F55 8.23±0.16a 6.27±0.08a 5.96±0.01a 2.46±0.06d W100 F37 8.37±0.09a 6.17±0.32a 3.76±0.12b 3.42±0.12a F55 8.33±0.06a 4.50±0.12b 3.95±0.05b 3.19±0.03b 夏季 Summer W60 F37 4.07±0.01c 3.46±0.47d 2.72±0.02c 1.77±0.02e F55 4.31±0.02c 4.06±0.02b 3.00±0.02b 3.09±0.10b W80 F37 4.73±0.10b 4.03±0.02bc 3.24±0.02a 2.89±0.05c F55 6.65±0.12a 3.55±0.01bc 3.27±0.01a 3.37±0.03a W100 F37 6.59±0.12a 4.66±0.02a 2.99±0.03b 2.54±0.02d F55 4.32±0.08c 4.14±0.08ab 2.40±0.08d 2.57±0.05d 1)表中数据为平均值±标准误；相同玉米季的同列数据后，不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncanʼs法)；W60、W80和W100分别为田间持水量的50%~60%、70%~80%和90%~100%；F55：50%氮肥作基肥土施、50%氮肥作滴灌施肥；F37：30%氮肥作基肥土施、70%氮肥作滴灌施肥 1)The values in the table are means ± standard errors; Different lowercase letters in the same column of the same maize-season indicate significant difference among treatments (P<0.05, Duncan’s test); W60, W80 and W100 were 50%−60%, 70%−80% and 90%−100% of field water holding capacity, respectively; F55: 50% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 50% nitrogen fertilizer as fertigation; F37: 30% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 70% nitrogen fertilizer as fertigation 夏季玉米试验中，W60处理下，拔节期、抽穗期和成熟期F55土壤硝态氮含量较F37分别提高17.3%、10.3%和74.6%；W80处理下，苗期和成熟期F55土壤硝态氮含量较F37分别增加40.6%和16.6%；W100处理下，苗期和抽穗期F37土壤硝态氮含量较F55分别提高52.5%和24.6%。施氮比例F37处理下，不同水分处理土壤硝态氮含量表现为：苗期和拔节期W100 > W 80 > W 60，抽穗期和成熟期W80 > W 100 > W 60。施氮比例F55处理下，不同水分处理土壤硝态氮含量表现为：苗期W80显著高于W60和W100，抽穗期和成熟期W80 > W 60 > W 100。
2.2.3 亚硝态氮
不同处理对春季和夏季玉米不同生育时期土壤亚硝态氮含量的影响见表5。春季玉米试验中， W60处理下，苗期和拔节期F55土壤亚硝态氮含量较F37分别提高160.6%和107.6%；W80处理下，拔节期F55土壤亚硝态氮含量也显著高于F37；W100处理下，苗期F37土壤亚硝态氮含量较F55增加75.9%。施氮比例F37处理下，苗期W60土壤亚硝态氮含量较W80和W100分别低88.0%和89.3%，拔节期W100土壤亚硝态氮含量较W60和W80分别高284.5%和290.8%；F55处理下，土壤亚硝态氮含量表现为：苗期W80 > W 100 > W 60，且差异显著，拔节期W100显著高于W60和W80，抽穗期W100 > W 60 > W 80，且差异显著，成熟期W100显著高于W80。
表 5 不同处理下玉米各生育期土壤亚硝态氮含量1)Table 5. Soil nitrite nitrogen content at each growth stage of maize under different treatmentsμg·hm−2 季节 Season 水分处理 Water treatment 施氮比例 Fertigation proportion 苗期 Seedling stage 拔节期 Jointing stage 抽穗期 Heading stage 成熟期 Maturing stage 春季 Spring W60 F37 13.57±3.83d 22.44±2.39c 18.72±3.48b 4.24±0.51ab F55 35.36±2.41c 46.58±7.07b 14.60±4.68b 3.38±0.08ab W80 F37 113.26±8.24a 22.08±4.26c 24.29±4.95ab 0.00±0.00b F55 114.43±7.68a 47.37±10.22b 2.90±2.50c 0.00±0.00b W100 F37 127.11±7.38a 86.28±4.89a 24.12±2.75ab 5.91±4.9ab F55 72.25±7.70b 98.23±4.15a 34.70±1.23a 9.04±0.88a 夏季 Summer W60 F37 3.03±1.92b 0.00±0.00c 1.74±1.74b 0.00±0.00c F55 0.00±0.00c 72.38±9.67c 1.53±1.53b 0.00±0.00c W80 F37 0.00±0.00c 42.10±16.94b 3.57±1.41b 0.00±0.00c F55 0.00±0.00c 37.97±12.75b 0.00±0.00b 0.00±0.00c W100 F37 15.86±0.22a 83.16±9.73a 21.99±4.22a 27.99±6.69b F55 16.88±0.89a 87.64±0.23a 20.17±7.73a 37.25±0.32a 1)表中数据为平均值±标准误；相同玉米季的同列数据后，不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncanʼs法)；W60、W80和W100分别为田间持水量的50%~60%、70%~80%和90%~100%；F55：50%氮肥作基肥土施、50%氮肥作滴灌施肥；F37：30%氮肥作基肥土施、70%氮肥作滴灌施肥 1)The values in the table are means ± standard errors; Different lowercase letters in the same column of the same maize-season indicate significant difference among treatments (P<0.05, Duncan’s test); W60, W80 and W100 were 50%−60%, 70%−80% and 90%−100% of field water holding capacity, respectively; F55: 50% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 50% nitrogen fertilizer as fertigation; F37: 30% nitrogen fertilizer applied to soil as basal fertilizer and 70% nitrogen fertilizer as fertigation 夏季玉米试验中，W60处理下苗期W37土壤亚硝态氮含量显著高于W55，W100处理下成熟期F55土壤亚硝态氮含量较F37高33.1%。施氮比例F37处理下，不同水分处理土壤亚硝态氮含量表现为：苗期W100 > W 60 > W 80，拔节期W100 > W 80 > W 60，抽穗期和成熟期W100显著高于W60和W80；F55处理下，不同水分处理土壤亚硝态氮含量表现为：苗期、抽穗期和成熟期W100显著高于W60和W80，拔节期W100 > W 80 > W 60。
2.3 土壤氧化亚氮通量与无机氮含量的关系
将土壤N2O通量与采集气样当天的土壤无机氮含量进行相关性分析，结果见表6。由表6可以看出，春夏两季玉米土壤N2O通量与土壤硝态氮和亚硝态氮含量之间呈极显著正相关，相关系数分别为0.433~0.579和0.396~0.532，与土壤铵态氮含量之间呈负相关，但相关性不显著。因此，土壤硝态氮和亚硝态氮含量显著影响土壤N2O通量，而土壤铵态氮含量不显著影响土壤N2O通量。
表 6 土壤N2O通量与无机氮含量的相关性分析1)Table 6. Correlation analysis of soil N2O flux and inorganic nitrogen content季节 Season 指标 Index 铵态氮 Ammonium nitrogen 硝态氮 Nitrate nitrogen 亚硝态氮 Nitrite nitrogen 春季 Spring N2O通量 N2O flux −0.107 0.579** 0.532** 夏季 Summer N2O通量 N2O flux −0.075 0.433** 0.396** 1) “**”：P<0.01，r0.01=0.300，n=72 3. 讨论与结论
3.1 土壤N2O排放
土壤N2O的产生是由硝化和反硝化过程共同作用的结果[19]。土壤硝化作用是指在好氧条件下，土壤硝化微生物将铵(NH4+)、氨(NH3)等转化为亚硝酸根(NO2−)或硝酸根(NO3−)等的过程[20]。土壤反硝化作用则是在缺氧条件下，土壤反硝化微生物将NO3−还原为一氧化氮(NO)、N2O与氮气(N2)的过程[21]。本研究中土壤N2O排放高峰均出现在每次滴灌施用氮肥之后，这与土壤硝化和反硝化过程主要依赖于土壤水分以及底物的规律一致[19]。
本研究中，土壤N2O通量在玉米苗期较高，可能原因是氮肥作基肥土施和苗期追肥后，苗期时玉米对氮素利用较少，土壤中无机氮累积，而灌水促进硝化和反硝化作用，从而导致土壤N2O通量增加。土壤N2O通量高峰主要集中在拔节期和抽穗期滴灌施肥后1周内，可能原因是尿素施入土壤后，在1周内会转化为铵态氮，为硝化作用提供了底物，从而有利于硝化过程中N2O的排放，这与刘广深等[22]施肥后土壤N2O排放增加的规律一致。杜娅丹等[23]发现，施氮后土壤中氮浓度增加，从而增强土壤硝化和反硝化作用。从水分处理来看，施用氮肥后W100土壤N2O通量高峰显著高于W60和W80，说明高土壤含水量促进土壤N2O的排放[24]。王艳丽等[25]也发现，土壤水分饱和有利于嫌气环境，而嫌气环境增加反硝化潜势和N2O排放。从施氮比例来看，相同水分处理下，施肥后F55土壤N2O通量高峰低于F37，这可能是不同施氮比例影响了氮肥在不同生育期的分布所致。
从不同施氮比例来看，在相同水分处理下，施氮比例F37与F55处理的土壤N2O累计排放量主要区别在于抽穗期，对于春季玉米试验，W60和W80处理下土壤N2O累计排放量均表现为F37显著高于F55，对夏季玉米试验，W80处理下土壤N2O累计排放量规律一致。此外，W80F55处理2季玉米全生育期土壤N2O总排放量较低，且该处理春季玉米的鲜穗产量为1407.4 kg·hm−2，夏季玉米为2185.2 kg·hm−2，显著高于其他处理(结果未列示)。
3.2 土壤无机氮
本研究中，相同水分处理下，在抽穗期，施氮比例F55土壤铵态氮和硝态氮含量大多显著高于F37，而W80处理下F37土壤亚硝态氮含量显著高于F55。其可能原因是不同施氮比例下，促进作物地下部根系生长程度不同，使氮素吸收效率不同，使土壤细菌繁殖活性不同等，同时，土壤细菌的生长和繁殖也会引起土壤无机氮动态变化[26]。
从不同水分处理来看，成熟期土壤铵态氮含量较苗期高，可能是由于成熟期追肥后导致土壤铵态氮增加，同时酸性土壤中易发生硝态氮异化还原成铵的反应，使硝态氮和亚硝态氮向铵态氮转化[27]。土壤铵态氮含量均表现为W60 < W 80 < W 100，说明土壤水分含量高可使土壤铵态氮含量提高。土壤硝态氮含量在整个玉米生育时期呈下降趋势，土壤硝态氮含量大多表现为W80高于W60和W100，说明土壤水分过高或过低都会降低土壤硝态氮含量。土壤亚硝态氮含量大多在苗期和拔节期较高，而在抽穗期和成熟期较低，这与土壤N2O通量在苗期和拔节期较高一致。抽穗期和成熟期土壤亚硝态氮含量较低的可能原因是由于参与硝化反应的NH4+-N减少，致使产生的NO2−-N减少[28]。试验还发现，土壤亚硝态氮含量大多表现为W100高于W60和W80，这说明在高水分处理下，土壤反硝化作用显著。
3.3 土壤N2O通量和土壤无机氮含量的关系
本试验中，土壤N2O通量与土壤硝态氮和亚硝态氮含量之间呈极显著正相关，说明土壤硝态氮和亚硝态氮含量的变化显著影响土壤N2O的排放，这与马兰等[28]和张艺磊等[29]的研究结果一致。他们也发现，土壤N2O通量与土壤硝态氮和亚硝态氮含量之间呈显著正相关。
3.4 结论
相同施氮比例下，施肥后W100土壤N2O通量高于W60和W80。相同水分处理下，施肥后F55土壤N2O通量高峰低于F37。W80F55处理2季玉米全生育期土壤N2O总排放量较低，且该处理2季玉米鲜穗产量高于其他处理。此外，土壤硝态氮和亚硝态氮含量显著影响土壤N2O通量。特别是在2季玉米苗期和拔节期，土壤硝态氮和亚硝态氮含量越高，土壤进行的硝化与反硝化作用越强烈，导致中间产物土壤N2O排放越多。
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图 1 不同培养温度下菌株自聚合能力
相同温度柱子上的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’ s法)
Figure 1. Autoaggregation abilities of bacteria strains at different culture temperatures
Different lowercase letters on the bars of the same temperature indicate significant difference(P<0.05，Duncan’ s test)
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图 2 不同初始浓度对菌株自聚合能力的影响
Figure 2. Effects of different initial concentrations on autoaggregation abilities of bacteria strains
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