猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是α冠状病毒属的成员，是一种具有高感染性的单股正义链RNA病毒。其可以导致猪发生急性水样腹泻、呕吐、脱水等临床症状，尤其对新生仔猪具有高致死率^[1]。1978－2018年近40年的时间内，PEDV严重危害了全球养殖业，仅在2010年冬就造成了我国南方近100万头仔猪的死亡，给我国猪业造成了不可估量的损失^[2]。到2013年，美国17个州爆发PEDV，近10%的仔猪死亡，随即病毒在接下来的几年传播到欧洲国家，PEDV迅速地遍及全世界^[3-4]。对于PEDV防控和治疗，现有研究主要以接种疫苗的方式防控，但是由于疫苗的有效性、安全性和毒株的变异性等问题^[5-6]，仍然不能使仔猪完全避免PEDV的影响。开发有效的PEDV防控手段对养猪业良性发展具有重要意义。

基因编辑是利用基因编辑工具对生物体基因组进行修改，以产生相应表型的一种精确基因修饰手段。其中簇状规律性短回文重复序列结合蛋白(Clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas)系统是一种在细菌和古细菌里发现的天然适应性免疫系统，由CRISPR序列(间隔区)和侧翼的Cas基因组成。基于参与切割的Cas蛋白将该系统分为2类：一类是多个亚单位蛋白复合发挥作用的I类系统，包含type I，type III和type IV蛋白；另一类主要是以单一蛋白发挥功能的type II(Cas9)，type V(Cpf1、C2c1、C2c3)和type VI(Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d)型CRISPR系统^[7-8]。近年研究发现，CRISPR/Cas系统是唯一可以靶向RNA切割的免疫系统，Cas13蛋白含有2个高等真核生物和原核生物核苷酸结合域，可以介导对RNA的精准靶向切割^[9]。该系统通过CRISPR阵列转录成成熟的CRISPR RNA (crRNA)，与Cas13蛋白形成Cas13-crRNA复合物靶向切割目标RNA序列。迄今为止Cas13蛋白家族中，Cas13a和Cas13b是已证明可以靶向切割RNA的有力工具^[10-11]。Cox等^[10]的结果显示Cas13b拥有比Cas13a更高效的RNA抑制效率。Rashid 等^[12]利用Cas13a系统成功干扰芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)的感染，首次证实了该系统对植物RNA病毒的抑制能力。基于这些对CRISPR/Cas13系统的研究，本研究以 CRISPR/Cas13b 系统为基础，根据PEDV基因组的保守区域设计多个 CRISPR/Cas13b 系统打靶crRNA，旨在筛选出有效的crRNA以实现对PEDV体外增殖的有效抑制。本研究为后续开发有效的PEDV治疗手段，建立PEDV抗性动物提供了一种新的候选研究手段。

1.   材料与方法

1.1   材料

质粒：CRISPR/Cas13b基因编辑载体pC0043-PspCas13b crRNA backbone (Addgene编号：103854)、pC0046-EF1a-PspCas13b-NES-HIV(Addgene编号：103862)购于Addgene公司，无PEDV污染的Vero细胞由温氏研究院保存；PEDV ST2毒株由温氏研究院分离保存。

试剂：质粒小提试剂盒(Biomiga，广州)，胶回收试剂盒(OMEGA，广州)，病毒RNA抽提试剂盒(Magen，上海)，Premix Ex Taq DNA聚合酶、SYBR Green Ex Taq酶、Primer Script RT Master Mix(Takara Biotechnology，大连)，T4连接酶(New England Biolabs，美国)，BbsI内切酶(Thermo Fisher，美国)，感受态细胞TOP10(唯地生物，上海)，Lipofetamine 3000转染试剂、Alexa Fluor 594标记羊抗兔二抗(Invitrogen，美国)，PEDV单克隆抗体(JENO，韩国)，无EDTA胰酶、Opti-MEM、DMEM、FBS等细胞培养试剂(Gibco，美国)。

1.2   试验方法

1.2.1   crRNA的设计与合成

通过查找近年国内流行PEDV的序列，进行多重比对，寻找其保守序列，设计出多条基于Cas13b打靶系统的crRNA。crRNA长度28 nt，无特定PAM位点需求。将所设计的crRNA序列及其互补链序列分别加上与BbsI酶切位点相匹配的黏性末端，合成相应的寡聚核苷酸。

1.2.2   CRISPR/Cas13b系统打靶质粒的制备

用BbsI酶切crRNA骨架质粒。酶切体系为：BbsI酶2 μL，10×buffer 2 μL，质粒(717 ng/μL)3 μL，无菌水补至20 μL，37 ℃条件下反应2 h。酶切产物经电泳鉴定酶切完全后，切胶回收线性化载体片段用于下游连接。

合成的crRNA寡聚核苷酸经过退火复性形成双链DNA。退火体系和程序如下：互补寡聚核苷酸(10 nmol/L)各取5 μL混合，95 ℃ 1 min，10 ℃ 3 min，3个循环；95 ℃ 3 min。退火后形成的双链DNA与BbsI酶切后线性化的骨架质粒以T4连接酶进行连接，反应体系如下：T4连接酶1 μL，线性化载体1 μL，退火双链2 μL，补充无菌水至10 μL，16 ℃条件下连接过夜。连接后的质粒转化感受态细胞Top10，挑取单菌落扩大培养后进行鉴定。由于crRNA片段很短，无法通过酶切进行鉴定，因此我们采用合成的crRNA作为一侧引物，并在载体上设计一段序列作为另一侧引物，采用二者进行PCR扩增时，阳性质粒可以扩增出片段。我们通过菌液PCR鉴定质粒是否构建正确，菌液PCR鉴定引物如表1，PCR反应体系如下：菌液1 μL，上下游引物(10 nmol/L)各0.6 μL，2×Ex Taq酶10 μL，补充无菌水至20 μL，引物序列如表1所示。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30个循环；72 ℃，5 min，4 ℃保存，菌液PCR鉴定为阳性的菌落进行序列测定以确定质粒序列是否正确。阳性质粒分别命名为U6-crRNA1、U6-crRNA2、U6-crRNA3和U6-crRNA4。大量抽提质粒用于后续转染试验。

表  1  用于PCR鉴定crRNA插入的引物序列

Table  1.  Primer sequences for identifying positive crRNA insertion in PCR

靶点 Target	正向引物序列(5′→3′) Forward primer sequence	反向引物序列(5′→3′) Reverse primer sequences
crRNA1	GAGGGCCTATTTCCCATGATT	CAACACTGCTAGTGAAGCCGTCTCATACTATTCT
crRNA2	GAGGGCCTATTTCCCATGATT	CAACCCAATACATGTGTGGCGCTGACGGGAAACC
crRNA3	GAGGGCCTATTTCCCATGATT	CAACCCAGAAGGTTTTAGTTTTAATAATTGGTTT
crRNA4	GAGGGCCTATTTCCCATGATT	CAACATGGTAACTCTCGTTGTAAACAATTACTC

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1.2.3   PEDV病毒培养和TCID₅₀测定病毒滴度

PEDV在Vero细胞上以含7%(φ)胰酶的无血清DMEM培养，至细胞完全病变后收取全部上清和细胞，反复冻融3次以促进病毒释放，再分装后冻存于−80 ℃备用。测定病毒滴度时，将长势良好的Vero细胞接种于96孔板，加入100 μL以含7%(φ)胰酶的无血清DMEM培养基进行10倍梯度稀释的PEDV病毒液，病毒液稀释梯度为10⁻¹~10⁻⁷，每个稀释度接种5孔，观察一周的病变情况，应用Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。

1.2.4   CRISPR/Cas13b转染

Vero细胞在转染前1天消化铺板。将长势良好的细胞消化后均匀铺至24孔板，用含 10%(φ)FBS的 DMEM 培养基在37 ℃、CO₂体积分数为5%的培养箱中培养，待细胞汇合度达到70%~90%时，弃掉原有培养皿中的培养液，每孔加入300 μL新鲜培养液以备转染。按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书以如下步骤转染：将1.5 μL Lipofectamine 3000用25 μL Opti-MEM稀释，另取25 μL Opti-MEM稀释转染质粒(每孔500 ng)和P3000(每孔1 μL)，将二者混合后室温下静置10~15 min，混合物加入含300 μL培养基的24孔板中，混匀后静置培养。其中构建好的打靶质粒U6-crRNA和Cas13b质粒共转染Vero细胞为试验组，对照组则转入空白crRNA和Cas13b质粒，每个转染组重复3孔。

1.2.5   病毒感染

转染48 h后，弃掉含脂质体培养液并用PBS缓冲液清洗转染细胞3遍，以每孔400 μL含有感染复数(Multiplicity of infection，MOI)=0.001的PEDV病毒液接种细胞，置于37 ℃培养箱中感染1 h，然后弃去病毒液，以PBS缓冲液洗涤细胞3遍，加入500 μL含胰酶的DMEM培养基继续培养。

1.2.6   免疫荧光试验

病毒感染细胞24 h后，以免疫荧光(Immunofluorescence assay，IFA)检测病毒的增殖情况。用体积分数为4%的多聚甲醛溶液固定细胞10 min，PBS缓冲液清洗3次，每次5 min。用体积分数为0.3%的Triton溶液透化细胞10 min，PBS缓冲液清洗3次，每次5 min。以3 g/mL BSA溶液室温封闭2 h，然后加入PEDV抗体于4 ℃条件下孵育过夜。次日弃去抗体液，用PBS缓冲液清洗3次，每次5 min，而后加入以PBS缓冲液按1∶500的体积比稀释的Alexa Fluor 594标记二抗，于室温孵育2 h，PBS缓冲液漂洗后于荧光显微镜下观察病毒的感染情况。

1.2.7   荧光定量PCR检测细胞上清病毒含量

病毒感染24 h的细胞上清按照Magen病毒RNA抽提试剂盒抽提病毒RNA，抽提相同体积上清液的病毒以保证后续定量操作的一致性。以反转录试剂盒反转录成cDNA，反转录程序为：37 ℃15 min，85 ℃5 s。cDNA用无菌水稀释10倍后用于相对荧光定量PCR，根据Miller等^[13]的报道设计PEDV检测用PCR引物：

PEDV-Forward：GAATTCCCAAGGGCGAAAAT；

PEDV-Reverse：TTTTCGACAAATTCCGCATCT。

定量PCR反应体系为：SYBR Green Ex Taq酶 10 μL，上下游引物(10 nmol/L)各0.8 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 2 μL，无菌水补充至20 μL。定量PCR程序为：95 ℃30 s；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40个循环。同时设置无菌水为阴性对照。定量结果用2^−△△Ct法计算相对病毒RNA含量。

1.2.8   数据分析

试验数据利用“SPSS for Windows 21.0”统计软件进行了数据差异性检验，采用Duncan’ s法进行组间的多重比较分析。

2.   结果与分析

2.1   U6-crRNA载体构建

根据病毒基因组设计的crRNA序列和位点见表2，其中靶点1和2靶向PEDV polI基因，靶点3和4靶向S基因。

表  2  CRISPR/Cas13b靶向PEDV病毒RNA的crRNA序列

Table  2.  The crRNA sequences of CRISPR/Cas13b targeting PEDV RNA

靶点编号 Target number	对应PEDV基因组位点/bp Corresponding genomic loci of PEDV	crRNA序列(5′→3′) crRNA sequence
1	364~392	ACTGCTAGTGAAGCCGTCTCATACTATTCT
2	645~674	CCAATACATGTGTGGCGCTGACGGGAAACC
3	21 395~21 424	CCAGAAGGTTTTAGTTTTAATAATTGGTTT
4	23 085~23 114	ATGGTAACTCTCGTTGTAAACAATTACTCA

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将crRNA序列经过复性后形成带2个黏性末端的双链 DNA，和Bbs Ⅰ酶切线性化后的U6-crRNA骨架质粒(图1)进行连接构建U6-crRNA1、U6-crRNA2、U6-crRNA3和U6-crRNA4载体(分别对应靶点1~4)。重构质粒经菌落PCR鉴定正确(图2)。测序结果如图3所示，显示插入crRNA序列正确。

图  1  BbsI酶切U6-crRNA骨架载体电泳图谱

M：DNA Marker 5000；1：U6-crRNA骨架质粒；2：BbsI酶切U6-crRNA线性化骨架质粒

Figure  1.  Electrophoresis of restriction digestion product of U6-crRNA backbone vector by BbsI

M: DNA Marker 5000; 1: U6-crRNA backbone plasmid; 2: BbsI digestion of U6-crRNA backbone plasmid

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图  2  crRNA连接入骨架载体的阳性质粒PCR鉴定

M：DNA Marker 2000；阳性PCR条带处代表目的crRNA成功构建入U6-crRNA载体；克隆1、2、3和4为被选择用作后续转染试验的U6-crRNA载体

Figure  2.  PCR result showing positive plasmids with crRNA insertions

M: DNA Marker 2000；Positive PCR band indicates U6-crRNA vector with successful crRNA insertion; Clone 1, 2, 3 and 4 are four crRNA vectors selected for subsequent cell experiments

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图  3  U6-crRNA靶向质粒测序结果

Figure  3.  Sequencing results of U6-crRNA targeting plasmids

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2.2   U6-crRNA和Cas13b质粒共转染Vero细胞抑制PEDV的增殖

2.2.1   IFA检测细胞中PEDV增殖情况

由于Vero细胞转染效率有限，我们在预试验中以相同大小的带荧光蛋白的质粒进行脂质体共转染，确定优化的转染参数。然后我们以相同的转染条件对U6-crRNA和Cas13b质粒进行Vero细胞共转染。将 PEDV ST2(10^−3.6 TCID₅₀/mL)以MOI=0.001的稀释度接种于转染48 h后的Vero细胞，24 h后用IFA检测细胞的病毒感染情况。结果显示在24 h后，转染U6-crRNA3和U6-crRNA4打靶质粒的细胞中红色荧光团(代表PEDV感染细胞)与对照组(转染空白crRNA和Cas13b质粒细胞)相比明显减少(图4)，而U6-crRNA1和U6-crRNA2组的荧光强度则和对照组差异不大。

图  4  PEDV感染Vero细胞24 h的病毒免疫荧光检测

Vero细胞与PEDV抗体和红色荧光标记的二抗反应(红色)，并以DAPI进行细胞核复染(蓝色)

Figure  4.  Viral immunofluorescence assay of Vero cells infected with PEDV for 24 h

Vero cells were labelled with anti-PEDV antibody and further incubated with red fluorescence conjugated secondary antibody (Red); Cell nuclei were counter stained with DAPI (Blue)

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2.2.2   定量PCR检测细胞上清中病毒增殖情况

细胞转染48 h后以MOI=0.001的PEDV感染，24 h后收取上清用定量PCR检测细胞上清中的病毒增殖情况。定量PCR结果显示转染U6-crRNA3和U6-crRNA4打靶质粒的细胞组其PEDV Ct值明显大于对照组Ct值，显示了有效的PEDV抑制效果；而U6-crRNA1和U6-crRNA2组Ct值与对照组无明显差异。通过2^−△△Ct计算，如图5所示，U6-crRNA3、U6-crRNA4组和对照组相比，PEDV病毒含量减少了约50%，差异显著(P<0.05)；U6-crRNA1和U6-crRNA2组与对照组病毒含量差异不显著(P>0.05)。

图  5  病毒感染细胞上清中PEDV病毒RNA定量PCR检测

柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’ s 法)

Figure  5.  Quantitative PCR result of PEDV RNA in the supernatant of cells infected by the virus

Different lowercase letters on bars indicate significant difference (P<0.05，Duncan’ s test)

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3.   讨论与结论

3.1   CRISPR/Cas13b系统

在CRISPR/Cas13可编辑RNA的功能未被发现之前，RNAi被广泛使用在基因沉默中，即可以通过靶向同源mRNA实现真核生物靶基因沉默的方式^[14]，但是其脱靶率高一直被广为诟病，而Cas13b酶可以在高效敲低RNA表达量的同时实现零脱靶效率，Cox等^[10]指出Cas13b与shRNA干扰相比，前者零脱靶，后者的脱靶位点近200个。Cas13酶与Cas9、Cpf1酶等相比，DNA编辑会造成细胞基因组彻底的改变，而Cas13酶则拥有可以敲低RNA而不改变基因组的特性^[15]，且相较于RNA干扰具有更特异更高效的优势，这为我们在研究各种RNA病毒引起的疾病时提供了新的技术选择。但Cox等^[10]发现Cas13a的打靶效率不如Cas13b效果高，通过设计双荧光素酶报告基因法，将荧光素酶表达载体、Cas13a/crRNA和荧光素酶表达载体、Cas13b/crRNA分别转入293细胞中，探测Cas13a和Cas13b对荧光信号的敲低作用，结果表明，PspCas13b的平均敲低率为92.3%，LwaCas13a的平均敲低率为40.1%。在此基础上，为了了解Cas13a和Cas13b在靶向内源转录物上的差异，设计了靶向293细胞KRAS基因的crRNA，PspCas13b的敲低率在60%以上。Wolter等^[16]认为是因为Cas13b在与核输出信号(Nuclear export signal，NES)结合后打靶效率更高，因为NES调节许多来自细胞核的蛋白质的输出^[17]。近来也有Cas13a系统抑制植物RNA病毒的报道，针对TuMV设计crRNA证明了Cas13a拥有可以干扰TuMV的能力^{[10, 12, 18]}。然而目前仍鲜见文章报道Cas13b在动物RNA病毒上的编辑。

3.2   影响CRISPR/Cas13b切割效率的原因

本研究中我们以CRISPR/Cas13b系统对Vero细胞进行瞬时转染，验证其对PEDV病毒感染的敲低能力。但结果显示只有部分靶向crRNA能够有效抑制PEDV的增殖。例如U6-crRNA3和U6-crRNA4在PEDV增殖过程中起到了抑制作用，但U6-crRNA1和U6-crRNA2没有达到预期中的效果。研究认为CRISPR-Cas13b中crRNA-cas(crRNP)效应因子复合体工作时受到靶向RNA的邻间隔序列基序(Protospacer flanking sequence，PFS)序列调节^{[9, 19]}，但现在优化后的LwaCas13a、PspCas13b并不需要PFS调节，从结构上看Cas13b和Cas13a都有2个HEPN区用以切割靶向RNA，当Cas13a没有和靶标RNA结合时是失活状态，而在向导RNA和靶标RNA相互配对后，向导RNA和Cas13a蛋白构象发生变化引起Cas13a切割效应激活，所以我们猜测不同的crRNA在与Cas13b形成复合体时会影响Cas13b的活性，现行研究者们根据打靶位点会设置多个打靶crRNA以筛选有效的crRNA；又因为Cas13a在切割靶标RNA的同时也会切割非靶标的RNA^{[11, 20]}，基于Cas13b和Cas13a同源性和结构相似性，我们推测可能发生了一些非特异的切割导致不同crRNA的切割效率差异；另外，PEDV感染后的增殖速度极快，这也限制了CRISPR/Cas13b系统对PEDV基因组的高效切割进而抑制PEDV的增殖。因此CRISPR/Cas13b系统对RNA病毒的切割作用仍然需要进一步的优化以提升其靶向RNA的干扰效率。

3.3   CRISPR/Cas13b系统的应用

不同于CRISPR/Cas9系统在打靶植物番茄黄叶病毒和人乳头瘤病毒等DNA病毒的应用^[21-22]，CRISPR/Cas13b系统提出一种新的抗RNA病毒的策略。本研究对Cas13b系统抑制动物RNA病毒进行了报道，其对PEDV的有效抵抗可以为开发新的PEDV治疗手段、制备PEDV抗性动物提供了新途径。同时本研究采用的RNA抑制策略可推广到其他多种RNA病毒的防控上，为Cas13b系统的实际应用提供了广阔的前景，具有广泛的适应性。