Molecular detection of PRRSV and variation analysis of ORF5 gene in Fujian province in 2017
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摘要:目的
研究2017年福建地区中小规模猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的分子流行情况。
方法从福建地区中小规模猪场收集83份疑似蓝耳阳性病料,对编码GP5蛋白的ORF5基因进行了RT-PCR检测和遗传进化分析。
结果采集的83份疑似蓝耳病料中阳性率为73%,测得的序列之间ORF5的核苷酸相似性达80.3%~100.0%,其中所测的各个分支毒株与其所属分支的代表毒株NADC30、GM2和JXA1的核苷酸相似性分别为92.6%~93.9%、89.8%~93.0%和93.4%~99.3%,检测到新分支中新出现的毒株与JXA1的核苷酸相似性为91.0~93.0%。GP5氨基酸比对结果显示不同亚群GP5信号肽区、诱导表位、主要中和表位及高变区等功能区发生了显著变异。
结论福建地区出现了PRRSV新分支,使福建PRRSV变异种类更加多样化,建议加强PRRSV流行及变异的监测。
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关键词:
- 猪繁殖与呼吸道综合征 /
- 蓝耳病 /
- 分子流行病学 /
- ORF5基因 /
- 遗传变异
Abstract:ObjectiveTo study the molecular prevalence of the porcine peproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) strain in small and medium-sized pig farms of Fujian province in 2017.
MethodWe collected 83 suspected blue ear positive disease materials from small and medium-sized pig farms in Fujian province. RT-PCR detection and genetic evolution analysis of ORF5 gene which encoded GP5 protein was performed.
ResultThe positive rate of 83 suspected blue ear disease samples was 73%, and the nucleotide similarity among the measured ORF5sequences was 80.3%−100.0%. The nucleotide similarities between tested strains of different branches and the representative strains of those branches, NADC30, GM2 and JXA1, were 92.6%−93.9%, 89.8%−93.0% and 93.4%−99.3%, respectively. The new identified strain in the new branch had nucleotide similarity of 91.0%−93.0% to JXA1. The GP5 amino acid alignment showed significant variation in functional regions such as GP5 signal peptide region, induction epitope, principal neutralizing epitope and hypervariable region in different subgroups.
ConclusionA new branch of PRRSV has emerged in Fujian area, making the PRRSV variants in Fujian more diverse. It is necessary to strengthen the monitoring of PRRSV epidemics and mutations.
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浆果,是一种外表层较为脆弱的肉质果。截至2020年6月,全球浆果的产量约为9932 t,包含小番茄、葡萄、蓝莓、猕猴桃等。随着智能农业装备的发展,为了提升生产效率,越来越多的智能机械被应用于浆果采摘、分拣等生产环节。智能机械末端在夹持果实过程中对浆果造成的损伤程度,将直接影响后续的加工、储存等作业质量,以致影响产品的鲜销价值;因此,智能机械末端的夹持机构是决定浆果智能化生产加工品质的关键部件[1-3]。近年来,国内外学者对浆果的夹持机构进行了大量研究,如柔顺梁[4]、多关节[5]、四叶片软体[6]、三指气动软体[7-9]等夹持机构(图1)。上述四类新型夹持机构结合材料科学,利用柔软材料自身具备的大变形和多自由度特性,增强了末端夹持机构的灵活性和顺应性,这正是末端夹持机构设计的主要发展趋势[10-11]。然而,由于浆果夹持工艺特点,采用单一材料难以同时满足承载能力和变形能力对末端夹持机构刚度的差异化要求。现有夹持机构往往由不同材料的多组件装配而成,不仅动力学建模设计复杂,后期组件的加工、装配等繁杂操作也对机构的动作精度有极大影响[12-14]。因此,如何在保证柔性夹具稳固夹持的前提下,获得易加工、易驱动的轻质柔性夹持装置,实现低损甚至无损完成浆果自动夹持,是有效推进农业机器人在浆果生产领域推广应用所面临的关键问题。
柔性机构是一种少构件、无装配设计的驱动结构,可通过机构自身的弹性形变传递运动至输出端产生驱动响应[15-16]。结合以增材制造技术[17-19]为代表的先进制造技术,可快速成型集驱动连接和柔性夹具为一体的柔性夹持机构。同时,为适应不同种类和不同外形浆果,需调整夹持机构不同区域的刚度来提高其顺应性,以达到稳固、无损地夹持采摘的目的。已有研究通过引入形状记忆聚合物[20]、电活性聚合物智能材料[13]等方法来调整结构不同区域的刚度,但上述2类方法需对结构进一步分段或分层设计,加大了设计和加工难度。而在柔性夹持机构中引入梯度点阵结构[21-23],可以根据设计需求在设计域内实现刚度的梯度变化。本研究前期提出一种同时优化宏观结构拓扑和介观单胞分布的多层级点阵结构优化方法,实现了具有刚度梯度变化的连续体结构优化设计[23]。鉴于梯度点阵结构在结构变刚度设计中体现出的优异性能,将其引入到以上的柔性夹持机构设计中,通过优化机构整体拓扑构型和内部不同刚度单胞的分布,即可在一体化结构中同时实现高刚度的驱动连接和低刚度的无损夹持。这不仅大大缩短了结构优化设计的时间,并且优化后的多层级结构还具备改善结构整体刚度、可靠性高和局部稳定性好等多方面的优点[24-25]。
综上,本文将针对典型浆果——小番茄,引入多层级拓扑优化理论,提出基于梯度点阵结构的变刚度柔性夹持机构设计方法,分析小番茄夹持过程对夹持机构的性能需求,选取特定的点阵单胞构型并建立其特征尺寸与等效刚度的调控模型,构建变刚度柔性夹持机构的优化设计模型,获得可实现浆果无损夹持的变刚度柔性夹持机构的设计。同时,通过Polyjet增材制造技术加工优化设计获得柔性夹持机构样件,进行茂名‘千禧’小番茄夹持试验,验证设计方法的可行性和柔性夹持机构的有效性。
1. 浆果夹持机构的性能需求
小番茄作为典型的浆果,受损后具备明显的浆果损伤特性,能直观反映夹持机构的夹持效果。以下将通过分析小番茄对夹持机构的性能需求,来体现浆果采摘对末端夹持机构的性能需求。
1.1 夹持机构的可夹持范围
测量随机挑选的100颗茂名‘千禧’小番茄,统计得到该品种小番茄的外形规格为:径向直径平均值为31 mm,样本方差为3.92;横向直径平均值为30 mm,样本方差为2.19,即果实的横径向直径比约为1∶1。夹持机构可从径向和横向2个方向夹持小番茄(图2):若夹持机构从径向夹持小番茄,夹持口可张开最大距离需大于31 mm;若从横向夹持,夹持口可张开最大距离需大于30 mm。
图 2 不同加载方式下小番茄的压缩载荷与压缩率的关系CL、CR分别为横向、径向压缩率,RL2、RR2分别为横向、径向决定系数Figure 2. The relationship between compression load and compression ratio of small tomatoes under different loading modesCL and CR are lateral and radial compression ratios respectively, RL2 and RR2 are lateral and radial determination coefficients respectively1.2 夹持机构的材料要求
夹持机构材料首先应具备一定刚度且轻质,既能保证夹持时的可承载度,也可降低夹持机构的自身质量,提高工作的灵活度和准确度。本研究采用新型环保TPU材料作为夹持结构的基体材料,其具有轻质、高强度、高弹性以及良好的耐磨损性。另外,浆果的外果皮薄,且其中果皮和内果皮肉质多汁,不易区分。夹持机构最低损伤地夹持浆果时,应保证果实软接触,即在接触区域设置特殊的缓冲材料,降低浆果的损伤程度。根据常见缓冲材料的弹性模量[26],指端与果实的缓冲层弹性模量应设置为2.5~11.5 MPa的点阵单胞构型。
1.3 夹持机构的驱动力控制
机械进行夹持作业时,小番茄与夹持指端发生接触部位的皮下组织易变形和积聚液体,对小番茄的品质造成影响,该现象称为小番茄受到机械损伤[27]。在夹持机构驱动力控制下,影响小番茄机械损伤程度的因素主要是夹持载荷、加载位置和压缩率[28]。果实压缩率为压缩变形量与其压缩方向上果实初始直径的比值。通过以下2个试验确定以上驱动力控制下3个因素对小番茄的实际影响。
1) 选择若干个未受损、符合试验条件的小番茄,通过SC-500N数显推拉力计试验机(深测智能有限公司,量程:0~500 N,精度:0.1 N)分别采取横向和径向2种加载方式压缩果实至表皮破裂,测量并处理数据得到2种加载位置下不同压缩载荷的小番茄压缩率线性拟合直线(图2)。由图2可知,从横向加载压缩小番茄对其压缩率的影响比采取径向加载更为敏感;夹持机构的设计将侧重考虑横向加载时驱动力对小番茄夹持品质的影响。
2) 选择若干个未受损、符合试验条件的小番茄,通过深测智能有限公司数显推拉力计试验机,采取横向加载方式,压缩载荷Fp于小番茄的赤道面从0开始压缩小番茄,每间隔0.3 N为1组,每组重复3次“加载—卸载”操作,至其表皮出现裂纹时停止,期间测量并记录每个被压缩果实的初始横向直径和压缩变形量。所有果实完成压缩操作后,均将其置于同一环境(室温26 ℃)的货架进行储藏,定期观察并记录被测小番茄(选择其中1个未被压缩的小番茄为对照)的货架期(t)[29]。被测小番茄的货架期为小番茄完成压缩后置于同一环境货架的储藏时间,若表皮出现裂纹,小番茄货架期为0;若表皮没有裂纹,小番茄货架期从加载试验后开始计算至出现皱痕的那一刻结束,试验小番茄的货架期均记录于表1。最终根据公式(1)(2)计算得到各个小番茄的横向压缩率(CL)和机械损伤度(η)。
表 1 试验结果Table 1. Test result压缩载
荷/N
Compression
load横向压缩率/%
Lateral
compression
ratio货架
期/d
Shelf
life机械损伤度/%
Degree of
mechanical
damage0 0 8.0 0 0.3 0.22 8.0 0 0.6 1.36 8.0 0 0.9 1.91 8.0 0 1.2 2.37 7.5 6.25 1.5 3.39 7.5 6.25 1.8 3.52 7.0 12.50 2.1 4.28 7.0 12.50 2.4 4.55 7.0 12.50 2.7 5.01 6.0 25.00 3.0 6.15 5.5 31.25 3.3 6.30 5.0 37.50 3.6 6.17 3.0 62.50 3.9 7.26 1.0 87.50 4.2 7.82 0 100.00 $$ C_{\rm{L}}=横向压缩变形量/初始横向直径\times 100{\text{%}}, $$ (1) $$ \eta = \dfrac{{t - {t_1}}}{t} \times 100{\text{%}}, $$ (2) 式中,t为对照组果实的货架期;t1为被压缩果实的货架期。
由表1可知,横向加载下,当小番茄受到压缩载荷为0.9 N时,其横向压缩率为1.91%,货架期与未被压缩的样本相同,此时机械损伤度为0;当小番茄受到压缩载荷超过4.2 N后,表皮出现了裂纹,其横向压缩率为7.82%,此时机械损伤程度为100.00%,该值又称小番茄的组织损伤阈值。因此,小番茄末端夹持机构的设计若要实现无损夹持,需控制小番茄末端夹持机构驱动力所引起的小番茄压缩率不超过1.91%。
针对以上对小番茄末端夹持性能需求的分析可知:小番茄柔性夹持机构的设计,将从横向位置加载夹持小番茄,且其夹持口可张开最大距离需大于30 mm;将选用新型环保TPU材料加工机构,设计指端弹性模量为2.5~11.5 MPa的中密度缓冲结构,以制作出满足夹持需求的轻质高品质夹持机构;需控制机构的输入驱动力范围,以保证横向夹持输出载荷对果实的压缩率为0~1.91%,实现无损夹持。
2. 基于梯度点阵结构的浆果变刚度柔性夹持机构的优化设计
2.1 浆果变刚度柔性夹持机构的优化模型
针对典型的浆果夹持工况,浆果变刚度柔性夹持机构优化模型的设计方法如图3所示。柔性机构采用单输入−单输出模型[30],设计域左端为输入端,输出位移位于右边界,设计域上下部分固定。鉴于该模型具有对称性,取下半部分优化区域进行设计。在设计域内考虑几何非线性大变形情况[31-32],从输入端施加驱动载荷(Fin),通过机构的弹性变形传递运动,在输出端产生与驱动方向垂直的虚拟激励位移(Uout)。夹持接触区域设置弹性模量为Eb的中密度缓冲层,以实现指端与果实的软接触。输入、输出弹簧刚度分别设为kin、kout,以模拟输入驱动端和夹持果实端的刚度。点阵单胞构型采用O形构型,其特征尺寸(xi)为孔洞壁厚在水平方向上的宽度,通过数值均匀化方法[33](公式3)建立特征尺寸与单胞等效刚度的调控模型(图4)。
图 3 浆果变刚度柔性夹持机构设计图Fin:输入端驱动载荷;Uout:输出端位移;kin、kout:输入、输出端弹簧刚度;Eb:中密度缓冲层的弹性模量Figure 3. The design diagram of berry compliant clamping mechanism with variable stiffnessFin: Drive load at input end; Uout: Displacement at output end; kin, kout: Spring stiffness at input and output ends; Eb: Elastic modulus of medium density buffer layer$$ \begin{split} &\displaystyle\int_{{\Omega ^{{\rm{MA}}}}} {\varepsilon \left( u \right)} :D\left( {{x_i}} \right):\varepsilon \left( \nu \right){\rm{d}}{\Omega ^{{\rm{MA}}}} = \displaystyle\int_{{\Gamma ^{{\rm{MA}}}}} F_{\rm{t}} \nu {\rm{d}}{\Gamma ^{{\rm{MA}}}} +\\ &\quad \quad \displaystyle\int_{{\Gamma ^{{\rm{MA}}}}} {F_{\rm{b}} \nu {\rm{d}}{\Omega ^{{\rm{MA}}}}} ,\nu \in {U_{{\rm{ad}}}} , \end{split} $$ (3) 式中,ε是应变场,u是宏观下产生的应变,υ是动态空间Uad内虚位移场,Ft与Fb分别是作用于机构的面力与体力,ΩMA为宏观设计域,D(xi)是每个单元的弹性张量。
设机构输出端位移(Uout)与夹持区域宽度(L)的比值为其输出端的变形率。以机构输出端变形率的最大化为目标,其优化列式如下:
$$ \left\{ \begin{array}{l}find:{x}_{i}\left(i=1,2,\cdots ,N\right)\\ \underset{{x}_{i}}{\mathrm{max}}:\dfrac{{U}_{{\rm{out}}}}{L}=\dfrac{{U}^{{\rm{T}}}{{\boldsymbol{l}}}_{{\bf{out}}}}{L}\\ {\rm{s.t.}}:G\left({x}_{i}\right)={ {\displaystyle\int }_{{\Omega }^{{\rm{MA}}}}V\left({x}_{i}\right){\rm{d}}{\Omega }^{{\rm{MA}}}-{V}_{\mathrm{max}}\leqslant 0}\\ KU={F}_{{\rm{in}}}\\ 0 < {x}_{\mathrm{min}} < {x}_{i}\leqslant 1 \end{array} \right.,$$ (4) 式中,xi为介观单元的特征尺寸,max为函数值最大化,xmin为最小介观单元的特征尺寸,N为设计域内单元总数,lout为输出自由度处值为1的单位矢量,G(xi)为设计域内材料使用量,Vmax为材料使用总量上限值,V(xi)为第i个单元的材料使用量,K为总刚度矩阵,U为设计域位移。
2.2 小番茄变刚度柔性夹持机构的优化
通过Matlab代码构建二维的基于点阵结构的小番茄变刚度柔性夹持机构优化设计。优化模型中具体参数设定为:TPU材料的弹性模量E=29 MPa、泊松比=0.4(各向同性的假设材料),设计域大小为60 mm × 120 mm,单胞数目为15 × 30,夹持区域为20 mm × 40 mm,缓冲层区域宽度为8 mm、弹性模量Eb=10.15 MPa,输入端驱动载荷Fin=1 N,设计域内材料使用总量上限值Vmax=30%,输入弹簧刚度kin=0.1 N/mm、输出弹簧刚度kout=2.0 N/mm。迭代过程采用优化准则法[34],其目标函数的迭代过程如图5A所示。结合图5B可知,当迭代次数为20~27时,得到的二维拓扑构型机构的输出端压缩率最大,则该拓扑构型为小番茄柔性夹持机构的最优二维拓扑构型。值得注意的是:夹持机构的设计域和优化参数可根据实际场景需求定义,再通过优化算法求得当前参数下的优化构型,但指端接触区域的刚度是根据果实特征提前设置,因此,即使优化得出的夹持机构构型会随设计域和参数发生改变,依然可以保证其无损夹持的特性。
3. 浆果变刚度柔性夹持机构性能试验
3.1 小番茄柔性夹持机构试验过程
采用Polyjet增材制造技术设计小番茄柔性夹持机构。将“2.2”得到的最优二维拓扑构型(图5)对称操作得到完整的小番茄柔性夹持机构的二维拓扑构型(图6A)。整体尺寸为120 mm × 120 mm,单胞大小为4 mm × 4 mm,夹持区域为40 mm × 40 mm,缓冲层区域宽度为8 mm。柔性夹持机构采用柔性TPU材料进行打印,考虑到样品厚度对结构在变形过程中的屈曲影响,选择沿Z轴打印厚度为15 mm,使其与整体结构尺寸相匹配,最终获得质量约45 g的小番茄柔性夹持机构样件(图6B)。
如图7所示,将柔性夹持机构样件固定于数显推拉力计试验机上进行试验。本试验采用不锈钢圆柱形压头施加驱动载荷,机构样件上方的中心区域作为驱动载荷输入端(图7A)。当柔性夹持机构夹持小番茄时,一对方向相反的法向力施加于指端,即从小番茄的赤道面的2个接触点(图7B)进行夹取。将型号为DF9-16、量程为20~500 g、精度为0.01 N的柔性压力传感器安装于柔性夹持机构的指端(图7C),用于测试指端压力。
选择20个未受损、符合试验条件的小番茄进行试验。试验前,测量每个小番茄的横向直径(L0)。试验期间,测量夹持机构不同的驱动力载荷以及对应夹持口两端的距离(L1),此时小番茄的压缩率为(L0−L1)/L0。以夹持机构夹持住果实,且机构受到轻微晃动果实不掉落的情况,记为成功夹持果实。夹持机构的驱动力载荷继续增大至小番茄的压缩率为1.91%,此时对应指端柔性压力传感器的数值为1.2 N。试验后,计算并记录该夹持过程中小番茄压缩率为0~1.91%时机构对应的输出端驱动力载荷。
3.2 试验结果与分析
所有被测小番茄的压缩率为0~1.91%时,对应夹持机构在输入端施加的驱动载荷为0~14.56 N(图8)。当小番茄的压缩率为0.90%时,输入端施加驱动载荷为11.00 N,夹持机构可成功夹持果实;当小番茄的压缩率为0.90%~1.91%,对应输入端施加驱动载荷范围为11.00~14.56 N,夹持机构可稳固无损夹持果实。因此,根据小番茄变刚度柔性夹持机构设计,为达到作业时稳固且几乎无损夹持小番茄,在设置夹持机构的驱动装置时,驱动力应当大于11.00 N,但不能超过14.56 N。由于小番茄尺寸差异较小,不同尺寸样本下成功夹持与无损夹持对应的压缩率具有重叠区域,可根据该重叠区域对应的驱动力确定夹持机构的驱动力控制区间。若夹持对象的尺寸差异较大,将出现成功夹持与无损夹持对应的压缩率无单一的重叠区域;此时,可根据重叠区域的分布情况选取若干驱动力控制区间及其对应的果实尺寸区间,但需要借助其他辅助装置对果实的尺寸进行预判。
4. 结论
本文以夹持外表层较为脆弱的浆果类果实为研究背景,在柔性机构设计中引入梯度点阵结构,通过构建柔性夹持机构优化模型,获得可无损夹持浆果类果实的变刚度柔性夹持机构设计。以茂名‘千禧’小番茄为例,通过加工获得质量约45 g的小番茄变刚度柔性夹持机构样件,并进行试验得出:该夹持机构样件在输入端驱动载荷为11.00~14.56 N时,小番茄的压缩率为0.90%~1.91%,对应的机械损伤度为0。若将样件应用于智能机械末端以实现浆果的智能化高效无损夹持,在设置夹持机构的驱动装置时,驱动力应当大于11.00 N,但不能超过14.56 N。
本文提出了基于梯度点阵结构的浆果变刚度柔性夹持机构设计方法,可得到轻质、易驱动、顺应性强且几乎无损夹持的浆果夹持机构,在一定程度上促进了浆果自动化采摘、分拣等环节中夹持装备设计的发展。
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图 1 PRRSV GP5氨基酸序列比对分析结果
PS:信号肽;D:诱导表位;PNE:主要中和表位;HVR1、HVR2:高变区;T1、T2:T细胞表位;B:B细胞表位;TM1、TM2、TM3:跨膜区域;黄色高亮部分表示糖基化位点
Figure 1. Comparison analysis of amino acid locus variation in PRRSV GP5
PS: Peptide signal; D: Decoy epitope; PNE: Principal neutralizing epitope; HVR1, HVR2: Hypervariable region; T1, T2: T cell epitope; B: B cell epitope; TM1, TM2, TM3: Transmembrane regions; Yellow highlighted region refers to glycosylation site
表 1 引物和扩增片段长度
Table 1 Primer and amplified fragment length
引物名称
Primer name引物序列(5'→3')
Primer sequence长度/bp
LengthORF5-1-F TGAGACCATGAGGTGGGC 726 ORF5-1-R GAAAACGCCAAAAGCACC ORF5-2-F TGCTCCATTTCATGACAC 974 ORF5-2-R GCATCTGGAGGTGATGAAT -
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