猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是单股正链RNA病毒，有囊膜，直径在50~70 nm，全基因组1.5 kb左右^[1-3]。PRRSV是猪繁殖与呼吸道综合征(PRRS)的主要病原，PRRS是一种在世界范围内广泛存在的烈性传染病，对全球养猪业造成了重大危害。1987年首次在美国被发现，之后在加拿大及其他北美地区出现。2006年夏季由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)引起的“无名高热”综合征，相较2006年之前的毒株可引起仔猪的高发病率与高死亡率，给我国养猪业带来了沉重的经济损失^[4-6]。 感染猪通常会产生免疫抑制，从而继发感染其他细菌和病毒。临床表现主要有两方面：一是母猪严重的繁殖障碍，包括流产死胎、木乃伊胎及弱仔；二是各年龄段猪感染后均出现呼吸系统症状，常伴随非特异性的间质性肺炎^[7]。

福建地处沿海，生猪产业发展迅速。在全国生猪优势区域布局规划中，福建确定为我国生猪产业的优势区域布局和发展重点区域，在生猪产业中具有生产基础、市场竞争、产品加工等优势，与此同时福建也是我国的生猪主销区之一，养猪业的健康发展对福建省的经济发展起着重要的作用^[8]。PRRSV新现毒株与国内经典毒株的重组导致出现新的高致病性PRRSV，这让我国PRRS的防治工作更是雪上加霜^[9]。在福建地区陆续有PRRSV新毒株的出现，如NADC30-like和欧洲I型毒株^[10-11]，尤其NADC30-like毒株，已有研究证明现有商业化蓝耳病疫苗不能对其提供完全保护^[12]。近年来福建省陆续出台相关政策，对畜禽养殖要求提高门槛，同时将大力支持可养区生猪养殖场实施标准化改造^[13-14]。这种趋势有助于提升猪场生物安全防控能力，对于猪场疫病防控起到一定的促进作用。

中小型养猪场与大型规模化、标准化养猪场相比，因其规模小、设施和管理相对比较落后、生物安全措施较薄弱，往往是疫病高发区。通过有针对性地对福建地区各中小型养猪场进行PRRSV流行病学调查，有助于了解PRRSV在该地区的流行情况，为PRRSV的防控提供借鉴。因PRRSV的GP5蛋白是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白，编码GP5蛋白的ORF5基因在一定程度上能反映PRRSV的遗传变异情况，所以本试验主要是以GP5蛋白的流行程度来反映PRRSV的流行情况。

1.   材料与方法

1.1   样品收集

2017年83份疑似感染PRRSV的病料收集于福建龙岩、南平、漳州、福州、宁德等县市各中小型猪场。样品类型包括猪肺脏、淋巴结等，其中龙岩地区收集了12份，南平21份，漳州17份，福州9份，泉州5份，三明15份，宁德4份。将采集的组织样品研磨并于–70 ℃条件下保存，由国家生猪种业工程技术研究中心实验室留存。

1.2   主要试剂

RNA抽提试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司，RNA酶抑制剂、dNTP混合物(2.5 mmol/L)、TaKaRa ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000和克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；感受态细胞大肠埃希菌DH5α购自北京天根生化科技有限公司。

1.3   引物设计与合成

根据 GenBank中收录的JXA1的基因序列(EF112445.1)与国内外流行的PRRSV毒株基因序列的比对结果，设计2套扩增PRRSVORF5基因的引物，引物序列见表 1。

表  1  引物和扩增片段长度

Table  1.  Primer and amplified fragment length

引物名称 Primer name	引物序列(5'→3') Primer sequence	长度/bp Length
ORF5-1-F	TGAGACCATGAGGTGGGC	726
ORF5-1-R	GAAAACGCCAAAAGCACC
ORF5-2-F	TGCTCCATTTCATGACAC	974
ORF5-2-R	GCATCTGGAGGTGATGAAT

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1.4   病毒总 RNA 的提取

取–70 ℃保存备用的病料处理上清液，按上海飞捷生物技术有限公司的RNA抽提试剂盒操作说明书提取病毒RNA，用适量RNase free水溶解，–20 ℃条件下保存备用。

1.5   RT-PCR 扩增

以20 μL为反转体系，分别加入制备好的RNA 9.5 μL，5×MLV Buffer 4.0 μL，MLV反转录酶 1.0 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4.0 μL，RNase Inhibitor (20 U/μL) 0.5 μL，反转录随机引物1.0 μL，混匀后，置于恒温水浴锅中42 ℃反应1 h后获得 cDNA 模板。将cDNA用于 PCR 反应。采用50 μLPCR体系，分别加入TaKaRa Ex -Taq DNA聚合酶25 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物(20 pmol/μL)各2 μL，加ddH₂O至终体系50 μL。反应参数：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s (ORF5片段为1 min)，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应结束后，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。

1.6   ORF5基因的克隆和测序

参照DNA Purification Kit说明书回收扩增的目的片段后，于16 ℃将目的基因与pMD18-T载体过夜连接，连接产物转化到 DH5a感受态细胞，37 ℃条件下倒置培养10~16 h，挑菌，经PCR鉴定为阳性的菌液送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序列测定。

1.7   ORF5基因的进化树以及GP5蛋白的氨基酸序列分析

将各片段的测序结果，利用DNAStarLasergne软件进行人工拼接，得到PRRSV ORF5基因序列。从GenBank已上传毒株序列中选择具有代表性的26株PRRSV毒株，其中1株欧洲毒株，7株美国毒株和18株中国毒株。用MEGA6.0软件进行遗传进化树的绘制，用DNA Star 7.0软件进行氨基酸序列相似性的比较。

2.   结果与分析

2.1   2017年福建地区PRRSV样品检测结果

2017年在福建南平、宁德、三明、漳州、福州、泉州、龙岩等地区70个中小规模猪场采集83份疑似蓝耳阳性样品，阳性检出率为73%(置信度为95.0%，置信区间为62.1%~82.2%)，在NCBI上比对GP5遗传进化树显示分离毒株仍以JXA1亚群为主，占61%，GM2为代表毒株的分支检出率为17%，出现新的分支占15%，NADC30分支毒株占7%。南平、宁德、三明、福州、龙岩、泉州和漳州市的阳性率分别为26.50%、9.56%、15.47%、11.45%、12.58%、8.38%和17.76%。

2.2   PRRSV GP5氨基酸序列分析

比较不同PRRSV毒株的氨基酸序列，结果如图1所示。GP5各个区域的功能依次为信号肽区1~26 aa、诱导表位[27A(I/V)VLV29]、主要中和表位[37 H(F/L)QLIYNL45]、高变区、转膜区以及细胞表位，毒力相关位点为R13和 R151^[15-16]。本试验NADC30为参考毒株亚群，以R13Q为主，其他分离株亚群以R13为主，仅有2株R13H突变，而R151氨基酸位点在各个分离株亚群中不变，以JXA1毒株为参考毒株的第I亚群和第II亚群出现了广泛的位点突变，包括信号肽区(L14S、F16S、 A26T)、诱导表位(L28P、 V29A)，高变区1 (S32N、 N33Q)和高变区2 (A28N/K)等突变位点，在细胞表位功能区的突变与其他亚群基本保持一致。GM2亚群大部分毒株与参考毒株相比在主要中和表位发生了H28Y和L29S突变，同时新出现的亚群与其他亚群相比在信号肽区(C10Y、L17S)、诱导表位区(A21V)、高变区1(N23T/A D24S)、主要中和表位(L41S)和高变区2(A57V)等具有特征性的位点，在其他位点仅少数存在氨基酸置换。通过糖基化分析预测，不同亚群糖基化位点也存在着一定的差异，JXA1亚群I有4个糖基化位点，亚群II只有3个，GM2和NADC30据推测也只有3个糖基化位点，新出现的亚群存在4个糖基化位点。

图  1  PRRSV GP5氨基酸序列比对分析结果

PS：信号肽；D：诱导表位；PNE:主要中和表位；HVR1、HVR2：高变区；T1、T2：T细胞表位；B：B细胞表位；TM1、TM2、TM3：跨膜区域；黄色高亮部分表示糖基化位点

Figure  1.  Comparison analysis of amino acid locus variation in PRRSV GP5

PS: Peptide signal; D: Decoy epitope; PNE: Principal neutralizing epitope; HVR1, HVR2: Hypervariable region; T1, T2: T cell epitope; B: B cell epitope; TM1, TM2, TM3: Transmembrane regions; Yellow highlighted region refers to glycosylation site

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2.3   PRRSV ORF5遗传进化分析和基因的相似性

GeneBank上选取PRRSV的参考毒株与2017年测得的序列进行遗传进化分析，结果如图2所示，所有毒株均属于美洲型毒株，与参考毒株划分为不同的亚群，其中以JXA1毒株为代表的高致病性亚群仍为主要检出毒株，并与以往不同的是进化为2个不同的分支。以GM2为代表毒株的分支检出7株，且有新的进化分支形成。有3株分布在NADC30毒株为代表的分支上。经典株 CH-1a、美洲型疫苗株VR2332 和高致病性与经典毒株过渡株亚群未检出。其中共有6株毒株分布于新出现的分支中，与以往国内报道的毒株不同。

图  2  ORF5基因遗传进化分析

采用NJ法建树，自举值检验为1 000

Figure  2.  Genetic evolution analysis of the ORF5 gene

The tree is built using the NJ method, and the bootstrap value test is 1 000

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ORF5的核苷酸序列分析显示，ORF5的核苷酸序列相似性达80.3%~100.0%，通过遗传进化树可以看到，各分支毒株与其所属分支的代表毒株NADC30、GM2 和JXA1的核苷酸序列相似性分别为92.6%~93.9%、 89.8%~93.0%和 93.4%~99.3%。其中新出现的分支与CH-1a、JXA1和GM2的核苷酸序列相似性分别为91.7%~92.1%、92.4%~93.0%和81.9%~82.2%。在遗传进化树上独立形成分支的毒株 FJNP-LRX-04与以上参考毒株相比核苷酸序列相似性为82.7.%~87.2%，其中相似性最高的参考毒株是JXA1，相似性为87.2%。

3.   讨论与结论

本试验采集了福建地区几个市县PRRSV疑似蓝耳阳性病料，且收集了来源于福建地区中小规模养殖场的病料，所以本次试验覆盖地区广，有一定的代表性。福建地区送检猪场阳性率为73%，根据ORF5基因遗传进化分析显示，福建地区的毒株具有多样性，分布在5个大的分支上，检出以JXA1亚群为主，且分化呈两大分支的形式存在。以GM2为代表的lineage 3分支毒株在多地猪场都有检出，该支系毒株90年代最早出现在中国香港和台湾。有研究表明：GM2毒株在一些猪场长期存在，并且有不断扩大流行的趋势^[17-18]。通过临床观察和统计，流行GM2毒株的猪场怀孕母猪流产率在10%左右，仔猪临床表现以高热为主，死亡率在10%~25%之间。以类NADC30为参考毒株的亚群检出率为7%，推测可能类NADC30毒株在福建地区尚未成为流行毒株。

通过遗传进化分析显示，新出现的毒株亚群分支的GP5氨基酸位点出现了一些新的特征，这些氨基酸变化在其他亚群中没有出现，其对毒株的生物学特征的影响需要进一步试验验证。该类型毒株分布于福建部分县市猪场，且没有呈现明显的地域特征。其中检测到FJNP-LRX-04等新毒株与流行参考毒株JXA1 ORF5基因序列相似性为92%~93%，是否会成为流行毒株需要进一步研究。病毒囊膜上的糖基化位点，会屏蔽相关的抗原表位，造成免疫逃逸^[19]，以JXA1为代表的高致病性毒株存在4个糖基化位点，而新出现的分支亚群也有同样特点，所以可能会出现对现有疫苗免疫逃逸。

本研究通过对福建地区中小规模猪场PRRSV的分子检测及ORF5基因的变异分析，初步了解了福建地区中小规模猪场PRRSV毒株流行情况，并且对引种或跨区域传播引起的风险提供了一定的参考。