作为高等植物最重要的激素之一，脱落酸(Abscisic acid, ABA)不但在植物的开花^[1]、果实成熟^[2]、种子休眠等^[3]等生长发育过程中发挥重要的作用，而且在植物响应逆境中扮演着不可替代的角色。前人研究发现，生物胁迫和非生物胁迫都可以引起植物体内ABA含量的变化^[4-6]，而外源ABA可以不同程度地提高植物的抗逆性^[7-8]。

植物中ABA对多种胁迫响应的分子机制是复杂的，但人们开展对植物响应逆境时ABA含量变化的研究发现，ABA生物合成中的主要限速酶9–顺式−环氧类胡萝卜素双加氧酶(Nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)在期间起着关键的作用，且NCED基因表达量与ABA的含量变化有直接关系^[9]。

植物中的NCED多以家族基因形式存在，自从该家族首个成员自玉米Zea mays的ABA缺失突变体vp14中克隆得到后^[10]，人们从拟南芥Arabidopsis thaliana^[11]、叶子花Bougainvillea glabra^[12]、茶树Camellia sinensis^[13]等植物中也陆续克隆到了NCED基因，且研究发现，在烟草Nicotiana plumbaginifolia中转入菜豆Phaseolus vulgaris的PvNCED1基因，提高了植物体内ABA的积累及对干旱的耐受性^[14]，在拟南芥中转入油菜Brassica napus的BnNCED3基因也可以提高植株的抗逆性^[15]。这些研究表明NCED基因对植物抗旱性具有正调控的功能，在作物抗旱分子育种中具有潜在的应用价值。

梨是我国的大宗水果之一，其产量和品质备受人们关注。随着全球干旱气候的加剧，水分短缺成为我国北方梨园生产的限制性因素之一^[16]。通过基因工程的方法提高梨树的抗旱性则是一条提高水分生产率的有效途径。本研究在前期转录组研究的基础上^[17]，以生产中发现的抗旱性较强的黄冠梨Pyrus bretschneideri‘Xuehuali’ × P. pyrifolia ‘Shinsseiki’叶片为试验材料，克隆其NCED基因，并分析该基因在不同水分条件下的表达模式及与梨叶片内源ABA合成的关系，以期为后续的梨树分子育种奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料与处理

2014年7月上、中旬于安徽农业大学生物科技楼人工气候室采集2年生黄冠梨嫁接盆苗(杜梨为砧木)叶片为供试材料，用于PbpNCED3基因克隆；对黄冠梨树盆苗进行不同水分处理：正常浇水(对照)，干旱处理和旱后复水处理，其中对照和旱后复水的土壤含水量(w)均为70%±5%，干旱处理的土壤含水量(w)为20%±5%；分别采集对照、干旱处理的第1天、第4天、第7天和复水第3天的梨叶片用于ABA含量及不同水分条件下基因表达量的测定。

上述叶片均采自梨树梢部从上往下第4~6片成熟功能叶，每个处理3株苗，每株梨树所采的叶片为1个重复，共3个生物学重复。叶片采下后置于50 mL离心管，迅速用液氮处理后放置于–80 ℃冰箱保存备用。

1.2   测定指标与方法

1.2.1   叶片内源ABA的测定

不同处理下梨叶片ABA的含量参考Zhao等^[18]的方法，用酶联免疫吸附法测定。

1.2.2   总RNA提取和cDNA合成

各供试材料用液氮研磨后取100 mg，按照天根(TIANGEN，天根生化科技有限公司，北京)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型)说明书方法提取梨叶片总RNA。RNA的浓度采用微量核酸浓度检测仪检测，RNA的完整性通过8.82 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。符合质量要求的总RNA 放置在–80 ℃冰箱备用。

以梨叶总RNA为模板，参照宝生物公司(大连)的反转录试剂盒(FastQuant RT Kit)说明书的方法获得cDNA第1链，用于后续的RT-PCR扩增和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定。

1.2.3   PbpNCED3基因全长cDNA克隆

根据转录组数据得到的PbpNCED3基因序列，在NCBI网站Blastx比对结果显示具有完整开放阅读框。在该序列上下游的起始、终止密码子附近设计全长引物PbpNCED3-F和Pbp NCED3-R进行同源序列扩增(表 1)。RT-PCR扩增体系为：模板1.0 μL, abm Kodaq 2×PCR master mix 聚合酶12.5 μL，正反向引物各1.0 μL, ddH₂O补足至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环。PCR扩增产物利用10.59 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，使用生工Sangon Biotech SanPrep 柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化，然后使用北京全式金Transgen生物公司生产的Blunt-zero T载体试剂盒进行连接，质粒转入TaKaRa公司生产的T1大肠埃希菌感受态细胞并扩繁，对多个阳性单克隆菌落进行PCR检测，挑选3个阳性克隆菌液送至上海桑尼生物有限公司进行测序。

表  1  引物名称和序列

Table  1.  Primer name and sequence

引物名称 Primer name	序 列 Sequences (5′→3′)
PbpNCED3-F	CAACTC TTCCAAAAGCACCC
PbpNCED3-R	ACCGTTCTATCTATGCCTGATTTAC
qPbpNCED3-F	AGGTTACATTCTGACGTTCGTT
qPbpNCED3-R	CCGTTCTATCTATGCCTGATTT
Actin173-F	TTCGTTTTGCGTTTTAGTCCC
Actin173-R	GGGAACAAAAGGAATAAAGAGGC

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1.2.4   PbpNCED3基因生物信息学分析

基因全长序列的开放阅读框(Open reading frame，ORF)查找和同源性分析在NCBI网站进行；序列使用DNAMAN6.0软件进行多序列比对；经过ClustalX1.81比对后的序列利用MEGA5.2软件采用邻近相连法构建系统发育进化树；这条基因所编码的蛋白疏水性和理化性质通过ExPASy在线软件( https://web.expasy.org)预测，而磷酸化位点、糖基化位点及亚细胞定位的预测则通过ProP在线程序( http://www.cbs.dtu.dk)完成，二级结构和三级结构的模拟运用SOPMA和SWISS-MOLDEL软件完成。

1.2.5   PbpNCED3基因表达分析

根据PbpNCED3基因全长，使用Primer Premier 5.0软件设计出荧光特异引物qPbp NCED3-F和qPbpNCED3-R，内参为Actin173(引物见表1)。采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒，按照说明书操作，在STEPONE荧光定量PCR仪上检测PbpNCED3基因表达，分析PbpNCED3基因在不同水分条件下的相对表达模式。试验结果利用SPSS13.0 按照２^–ΔΔCt方法^[19]进行计算。

2.   结果与分析

2.1   黄冠梨PbpNCED3基因克隆与序列分析

以黄冠梨叶片为材料提取总RNA，反转录得第1链，并以此为模板，利用特异性引物PbpNCED3-F和PbpNCED3-R进行同源序列扩增，获得了长度为1 831 bp的cDNA序列(图1)。经过在NCBI网站的Protein Blast的分析发现，该基因的蛋白与多种植物的NCED蛋白同源，其中与砂梨P. pyrifolia NCED3蛋白(GeneBank: AJO53638.1)和中国白梨P. bretschneideri NCED5蛋白(GeneBank:XP_009369000.1)的序列相似性都达到了99%。

图  1  PbpNCED3基因PCR扩增结果

M：2 000 bp DNA Marker；N：PbpNCED3基因片段

Figure  1.  The result of PbpNCED3 PCR amplification

M：2 000 bp DNA Marker；N：PbpNCED3 gene fragment

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利用NCBI网站的ORF finder对获得的cDNA进行分析发现，该片段包含1 812 bp的ORF，16 bp的5′非翻译区和3 bp的3′非翻译区，其编码的蛋白质含有603个氨基酸(GeneBank登录号为：MH749461)。

2.2   PbpNCED3蛋白结构域分析

将PbpNCED3蛋白通过在NCBI网站进行Protein BLAST，发现其与砂梨等11种植物的NCEDs蛋白序列相似性都达到85%以上(图2)，将这些蛋白序列运用DNAMAN6.0进行多序列比对发现，1~87的氨基酸并不保守，但此后的序列保守性很强，且PbpNCED3具有NCED家族特有的2个保守结构域序列MIAHPKxDP和HDFAITE以及４个保守的组氨酸残基。进一步使用SMART服务器分析PbpNCED3蛋白的结构功能域，结果表明PbpNCED3蛋白第131~595氨基酸之间是一个高度保守的结构功能域RPE65，这是参与类胡萝卜素生物合成的NCED酶的典型特征，说明PbpNCED3属于NCEDs家族基因。

图  2  PbpNCED3氨基酸序列与其他植物NCEDs的多重序列比对

方框表示NCED家族特有保守结构域序列MIAHPKxDP和HDFAITE；▼表示4个活性保守的组氨酸位点；1：砂梨NCED3，2：中国白梨NCED5，3：苹果和海棠杂交种NCED， 4：苹果NCED1，5：海棠果NCED，6：苹果NCED5，7：湖北海棠变种NCED，8：日本杏NCED5，9：甜樱桃NCED5，10：桃NCED5，11：甜樱桃NCED5，12：PbpNCED3

Figure  2.  Multiple alignment of amino acid sequences of PbpNCED3 and NCEDs in other plants

The NCED motifs of MEAHPKXDP and HDFAITK are boxed; Four conserved histidines required for activity are marked by ▼;1: Pyrus pyrifolia NCED3，2: P. × bretschneideri NCED5，3: Malus domestica × M. honanensis NCED，4: M. domestica NCED1，5: M. prunifolia NCED，6: M. domestica NCED5，7: M. hupehensis var. Mengshanensis NCED，8: Prunus mume NCED5，9: P. avium NCED5，10: P. persica NCED5，11: P. avium NCED5，12: PbpNCED3

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2.3   PbpNCED3基因系统发育分析

利用ClustalX(1.81)和MEGA5.2软件，通过与拟南芥中 NCEDs家族的氨基酸序列比对发现，PbpNCED3和拟南芥中的几个 NCED 蛋白分聚在了同一聚类簇中(图3)，并且与AtNCED3的序列相似度最高，达到了68.65%。

图  3  PbpNCED3 蛋白系统发育树

Figure  3.  Phylogenetic tree of PbpNCED3 protein

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2.4   PbpNCED3蛋白空间结构预测

利用SOPMA在线预测PbpNCED3蛋白质二级结构，该结构57.55%为无规则卷曲，24.21%为延伸链，13.60%为α螺旋，4.64%则是β转角，其中无规则卷曲和延伸链是该蛋白最大量的结构元件(图4)，进一步通过Protscale在线软件分析该蛋白疏水性发现，位于序列上游的95~111的一段氨基酸序列KAAAMAIDVVEGALVSR是一段具有两亲性的α螺旋区，疏水值在–1.164~2.056之间。使用SWISS-MODEL软件预测了PbpNCED3蛋白的三维立体结构(图5)，且该软件以玉米vp14蛋白(PDB ID: 3npeA)(NCED家族基因)为比对模板，比对率为70%，GEQE为0.77(说明预测结果的准确性和可靠性高)，进一步证明该基因属于NCEDs基因家族。

图  4  PbpNCED3 蛋白二级结构

α螺旋和β转角分别用垂直的长蓝线和短绿线表示, 不规则卷曲和延伸链分别用短紫线和长红线表示, 100 aa附近长蓝线为一段具有两亲性的α螺旋

Figure  4.  Secondary structure of PbpNCED3 protein

Long blue line represents α helix and short green line represents β turn, short purple line represents random coil, long red line represents extended strand, long blue lines near 100 aa represent an amphiphilic α helix region

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图  5  PbpNCED3蛋白三维结构

Figure  5.  Three-dimensional structure of PbpNCED3 protein

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2.5   PbpNCED3蛋白基本性质分析

2.5.1   理化性质分析

使用Expasy的在线ProtParam软件分析预测出这条基因编码的蛋白分子式为 C_{2 979}H_{4 649} N₈₁₅O₈₈₃S₂₁，相对分子质量为66 700，等电点(pI)为6.56。该蛋白中数量最多的氨基酸分别是亮氨酸(8.1%, 49个)和丝氨酸(8.1%, 49个)，其次是缬氨酸(7.6%, 46个)，丙氨酸(7.5%, 45个)，甘氨酸(7.0%，42个)和脯氨酸(6.8%，41个)。脂肪族氨基酸指数(Aliphatic index)为81.33，总平均疏水指数(Grand average of hydropathicity ，GRAVY)为–0.309，该蛋白为亲水蛋白。

2.5.2   亚细胞定位

通过TargetP软件进行亚细胞定位预测，发现PbpNCED3含有的叶绿体转运肽(Chloroplast transit peptide，cTP)、线粒体靶向肽(Mitochondrial targeting peptide，mTP)和分泌途径的信号肽(Signal peptide，SP)的决定性系数分别是0.824、0.128和0.009(其界限值均设定为0.00~1.00)，由此可见PbpNCED3在细胞中的亚细胞定位有可能是靶向叶绿体。

进一步通过TMHMM-2.0和Signal P4.1软件分别对PbpNCED3蛋白的跨膜结构和信号肽序列进行预测，结果显示，PbpNCED3蛋白无跨膜结构，亦无信号肽，进一步证明该蛋白为非分泌型蛋白。

2.5.3   潜在磷酸化位点和糖基化分析

利用在线软件Net Phos3.1进行磷酸化位点预测，结果表明有65个丝氨酸、24个苏氨酸和8个酪氨酸可能是蛋白激酶磷酸化的位点(图6)。利用在线分析软件DictyOGlyc进行糖基化位点预测，结果表明PbpNCED3不存在潜在的糖基化位点。

图  6  PbpNCED3蛋白磷酸化位点预测

Figure  6.  Prediction of phosphorylation site of PbpNCED3 protein

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2.6   PbpNCED3基因表达分析

由图7中可见，随着干旱胁迫的加重，PbpNCED3基因的表达量与叶片内源ABA的含量都出现逐步增加的趋势，复水后二者都急剧下降。进一步通过相关分析发现，二者的动态趋势关系密切(R=0.914)，表明该基因的表达与ABA的合成成正相关。

图  7  PbpNCED3基因的RT-qPCR验证及黄冠梨叶片中ABA含量的动态变化

1：对照，2：干旱1 d，3：干旱4 d，4：干旱7 d，5：复水3 d

Figure  7.  RT-qPCR validation of PbpNCED3 gene and the dynamic change of ABA content in leaves of ‘Huangguan’ pear

1: Control, 2: One day of draught, 3: Four days of drought, 4: Seven days of drought, 5: Three days of re-watering

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3.   讨论与结论

在本研究的前期研究中，我们发现黄冠梨中的PbpNCED3基因在干旱处理前后差异表达，推测该基因参与了黄冠梨的抗旱响应^[17]。在此基础上，我们以黄冠梨的叶片为供试材料，克隆得到了PbpNCED3基因的cDNA序列，对其氨基酸序列进行分析发现：该序列具有NCED发挥功能所依赖的4个保守的组氨酸，多序列比对分析发现其有NCED家族特有保守结构域序列MIAHPKxDP和HDFAITE，且其具有RPE65结构域，亚细胞定位分析发现其N−端含有靶向叶绿体的转运肽，蛋白结构预测发现其与玉米vp14比对相似性为70%，且含有两亲性的α螺旋结构。这些都是NCEDs家族基因典型的特征^[20-24]，说明试验所得到的cDNA序列确实属于NCEDs家族基因。

目前，在拟南芥中已经克隆到了7个AtNCEDs基因( https://www.arabidopsis.org/)，而在对干旱的研究中，AtNCED3基因表现很突出^[25-26]，且在逆境中其表达量与ABA含量成正比。人们将AtNCED3基因转入水稻发现，转基因植株的抗旱性明显提升^[27-28]。同时，人们在对其他作物如油菜^[17]，甘草Glycyrrhiza^[29]、水稻Oryza sativa^[30]中都克隆到了NCED3基因，且进一步证明ABA含量的变化与NCED3基因有直接关系，且水稻nced3突变体中ABA含量低于野生型植株，在转基因植株中过表达OsNCED3基因可以提高植株的耐水胁迫能力，且促进叶片衰老、提高ABA含量。本研究中的PbpNCED3基因在进化树比对中与AtNCED3聚在一支，推测二者在基因功能上有相似之处，且在不同土壤水分的处理中，PbpNCED3基因的表达量与黄冠梨叶片内源ABA的含量成正向关系，所以我们推断PbpNCED3基因可能是通过调控ABA的含量来应对黄冠梨的干旱胁迫。

总之，ABA生物合成及其调控虽然是一个多因素参与的复杂过程，但NCED作为其合成途径中的限速酶之一，可以作为ABA生物合成分子调控研究的重要切入点。本研究从黄冠梨叶中克隆到了一个NCED同源基因，并分析了该基因表达与内源ABA含量之间的内在联系，推测其在调控植物抗旱过程中的作用，这些结果为了解黄冠梨中ABA的生物合成机制以及进一步通过转基因工作培育抗旱梨树品种奠定了基础。