Insect-resistant identification and heterosis of transgenic Bt maize
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摘要:目的
研究转Bt基因玉米Zea may材料表达、产量潜力及杂种优势表现，为转基因材料遗传改良提供参考。
方法以Reid群骨干系PH6WC及育成的自交系J1490、J1495、4DH10和外引系PH1CPS作母本，以Non-Reid为基础的转Bt基因材料6DH85、J1401、6DH222、8DH273和8DH279以及自选系J9D207、J1628、J1668为父本，按NCⅡ设计组配40(5×8)个杂交组合，对转Bt基因材料抗虫表现和产量潜力进行研究。
结果通过回交转育系谱法处理后代获得转基因材料中的部分Bt基因丢失或者沉默，没有在子代中成功表达出相应蛋白。转Bt基因的杂交组合在一定程度上可以避免因虫害造成的产量损失，与对照品种相比，组合4DH10×8DH279表现最好，增产31.10%；组合J1495×J1401虽然含有Bt基因，且与其不含Bt基因的同父本组合相比增产效果明显，最高可增产65.77%，但与对照品种相比，仅增产10.04%。
结论玉米转基因育种与常规育种相结合，对其跟踪测配，才有望培育出高产、抗虫优良品种。
Abstract:ObjectiveTo study the material expression, yield potential and heterosis of transgenic Bt maize(Zea may), and provide references for genetic modification of transgene materials.
MethodThe Reid group elite line PH6WC, the bred inbred lines J1490, J1495 and 4DH10, as well as the introduced line PH1CPS were used as female parents. The Non-Reid based transgenic Bt materials, including 6DH85, J1401, 6DH222, 8DH273 and 8DH279, as well as the self-selected lines J9D207, J1628 and J1688 were used as male parents. Totally 40(5×8) cross combinations according to the NCⅡ design were assembled. The insect-resistant performance and yield potential of transgenic Bt materials were studied.
ResultPart of the Bt genes were deleted or silenced in transgene materials obtained through backcrossing pedigree method, and no corresponding protein was successfully expressed in the filial generations. The cross combination of transgenic Bt materials could partially avoid yield loss due to pest. Comparing to the control variety, combination 4DH10×8DH279 had the best performance with 31.10% yield increase. For combination J1495×J1401, although it contained the Bt gene and it displayed obvious yield increase (65.77% at the highest) compared with the combination without Bt gene of the same male parent, however, it only had 10.04% yield increase compared with the control variety.
ConclusionHigh-yield and insect-resistant maize varieties can be bred through combining transgene breeding with conventional breeding as well as tracking and testing.
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Keywords:
- maize /
- Bt gene /
- transgenic /
- insect resistance /
- yeild /
- heterosis
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植物和人类的生长和发育都需要矿质元素。土壤中的矿质元素被植物的根部吸收，并通过不同的转运蛋白运输到其他部位[1]。矿质营养不仅影响植物正常的生长发育，还以多种方式直接或间接参与抵抗生物和非生物胁迫。矿质元素通过调节氧化还原酶活性直接影响植物的健康，或通过改变根系分泌物、微生物种群动态、根际土壤养分含量、土壤pH、木质素沉积以及植物抗性化合物合成等间接影响植物的抗性[2]。水稻Oryza sativa是人类的主要粮食来源，也是单食性昆虫褐飞虱Nilaparvata lugens的主要食物来源。褐飞虱若虫、成虫通过刺吸水稻茎基韧皮部细胞汁液致使植株流失大量水分和矿质营养，导致水稻减产甚至绝收[3]。生产实践表明，褐飞虱的暴发与过度施肥有关[4]，实际水稻生产中以产量为导向，田间管理多为“大水大肥”。研究表明褐飞虱侵害不同抗性水平的水稻品种，引起氮、磷、钾营养物质含量在体内的不同变化，根系对水培营养液营养元素氮、磷、钾的吸收响应也存在差异[5-6]。此外，氮、磷、钾元素的施加会交互影响水稻和褐飞虱体内氮、磷、钾的含量[7]。因此，探究不同氮磷钾浓度处理下水稻对褐飞虱的抗性响应，可为氮磷钾合理施用防控褐飞虱危害提供理论基础。总结前人研究发现，大量营养元素氮、磷和钾；中量营养元素钙、镁和硫以及微量营养元素硼、锰、铁、锌、铜和硅等在调控植物抗病性和生长发育方面具有重要意义[2]。Gupta等[8]研究发现，钙、镁、钾、磷、钠和氯元素喷雾处理番茄叶片后能有效降低灰霉病和细菌性斑点病的严重程度，并诱导免疫反应。Ballini等[9]研究发现，高氮供应会降低籼稻/粳稻亚种对稻瘟病的抗性，并称这种现象为氮诱导敏感性(Nitrogen-induced susceptibility)。研究不同钾水平处理下蓟马对苜蓿的危害，结果表明钾元素可通过提高苜蓿中碳氮比降低游离氨基酸的含量来提高苜蓿对蓟马的耐害性[10]。Wu等[11]研究指出，水稻中氮和硅存在相互作用影响褐飞虱的抗性，高浓度氮 (5.76 mmol/L)可减少水稻叶片中硅的积累，而外施硅时，高浓度氮条件下的叶片氮素积累会减少。He等[12]研究发现，水稻水培条件下，高质量浓度硅(240 mg/L，SiO2)会降低褐飞虱的存活率和寄主选择数。Yang等[13]通过水培试验发现，低质量浓度氮(4 mg/L的N，NH4NO3)或低质量浓度磷(1 mg/L的P，NaH2PO4·2H2O)处理的水稻植株也能降低褐飞虱的存活率、增质量率、蜜露排泄量以及寄主选择数，呈现出明显的抗生性和趋避性。此外，还发现硅元素在褐飞虱抗性方面有着积极作用，Lin等[14]研究发现施加硅可以提高水杨酸的含量从而激活植物对刺吸式昆虫的防御反应，并增强抗氧化酶系统的活性，使防御反应更迅速。施氮会增加水稻植株的可溶性蛋白含量并降低硅含量，导致褐飞虱取食量增加，植株相对含水量急剧下降，最终导致植株感虫，而磷的施加增加了植物的磷含量，但对氮、钾、硅、可溶性糖和可溶性蛋白的含量没有影响，对褐飞虱抗性的影响不明显[7]。已有研究表明，单独的氮、磷和硅营养元素处理会影响褐飞虱的存活率、增质量率和蜜露排泄量以及寄主选择性等抗性指标。在水稻生产过程中，降雨或灌溉之后，多种营养元素(复合肥)往往是一并施用的，极易造成“大水大肥”的现象。然而高浓度或低浓度的氮磷钾复合处理对水稻植株抗褐飞虱的响应却鲜有研究。此外，先前的单独营养元素处理研究多集中于氮、磷和硅元素，对钾营养的研究也相对较少。本研究以感褐飞虱水稻品系‘9311’和抗性品系‘BPHR96’为供试材料，观察有无水源/食物条件下褐飞虱的死亡率，测定并比较不同质量浓度氮磷钾处理和不同质量浓度钾处理下水稻幼苗的分蘖数、株高、根长、地上部鲜质量和根鲜质量等表型性状，并进一步探究不同营养条件下褐飞虱的存活数量、增质量率和蜜露排泄量等抗生性指标以及寄主选择数量趋避性指标的差异，以期为合理应用水肥管理综合防治褐飞虱提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 水稻材料与褐飞虱虫源
抗褐飞虱水稻品系是来源于野生稻Oryza rufipogon Griff的‘BPHR96’，其携带有Bph24(t)而对多种褐飞虱生物型具有高抗性[15]；感虫水稻品系为籼稻‘9311’。褐飞虱虫源最初从广西南宁市水稻田收集，并在广西大学农科综合实验基地温室种植的‘9311’上饲养和繁殖，自然光照下设定平均温度26~30 ℃，相对湿度(w)75%，取2~3龄期的褐飞虱若虫用于后续试验。
1.2 抗性等级评价
褐飞虱对水稻品系‘9311’和‘BPHR96’的抗性等级评价采用苗期集团法，具体方法：每个品系设3次重复，每次试验重复取25粒种子，浸种催芽后, 分别播种于装有8 cm水稻土的塑料杯(直径8 cm、高10 cm)。在温室条件下生长至三叶期，去除病弱苗后仅保留20株大小长势基本一致的幼苗。按每株8头的密度接入2~3龄的褐飞虱若虫，当‘9311’死苗率达到90%以上时(约接虫后15 d)，参照Qiu等[16]采用的评价标准统计参试品系的褐飞虱平均抗性等级，分1~9级，级别越低，抗性越强。
1.3 褐飞虱饥饿死亡率试验
取塑料杯分别放入10头2龄褐飞虱若虫，设4个处理，处理一：塑料杯中每天更换新鲜的‘9311’茎段；处理二：每天更换新鲜的‘BPHR96’茎段；处理三：加入少许自来水，形成有水源的饥饿胁迫；处理四：不作任何操作，形成无水源的饥饿胁迫。塑料杯用尼龙细网封口后，放入同一个透光性良好的尼龙网箱中。观察接虫后2、5、12、24、48、72、96、120、168和216 h的褐飞虱死亡数目，设10次生物学重复，试验重复3次。
1.4 水稻幼苗水培与生长表征
水培试验于玻璃温室中进行，用去离子水制备试验营养液[12]。营养液pH 5.0~6.0，1周更换1次。对照组营养液质量浓度为40 mg/L的N，由NH4NO3提供；10 mg/L的P，由NaH2PO4·2H2O提供；40 mg/L 的K，由K2SO4提供。营养液还包含有40 mg/L的Ca，由CaCl2提供；40 mg/L的 Mg，由MgSO4·7H2O提供；120 mg/L的SiO2，由Na2SiO3·9H2O提供；0.5 mg/L的Mn，由MnCl2·4H2O提供；0.05 mg/L的Mo，由(NH4)6Mo7O24·4H2O提供；2.0 mg/L的Fe，由EDTA-Fe提供；0.2 mg/L的B，由H3BO3提供；0.01 mg/L的Zn，由ZnSO4·7H2O提供，以及0.01 mg/L的Cu，由CuSO4·5H2O提供。其中低质量浓度氮磷钾营养液为4 mg/L的N、1 mg/L的P和4 mg/L的K；高质量浓度氮磷钾营养液为100 mg/L的N、40 mg/L的P和100 mg/L的K；低质量浓度钾营养液为4 mg/L的K；高质量浓度钾营养液为100 mg/L的K，其余均一致。
将在粗河沙中生长10 d、长势一致的幼苗分别移入有营养液的塑料箱(长58 cm、宽38 cm、高9 cm)，每箱20株。不同营养液处理30 d后测定水稻植株分蘖数、株高、根长、地上部鲜质量和根鲜质量等5个幼苗表型性状，试验设10次重复。
1.5 褐飞虱存活试验
将生长10 d 的水稻幼苗分别移入装有不同营养液的塑料杯中，每杯1株水稻幼苗，每处理5次重复，自然条件培养10 d。然后罩上底部剪口的透明塑料杯，用吸虫器吸取10头2龄的褐飞虱若虫从剪口处接入植株，用脱脂棉封住剪口以防褐飞虱逃跑。接虫24 h内观察褐飞虱的虫数与状况，若有损伤死去的需及时补充并保持10头存活数，分别记录1、2、3、4、5、6、7、8和9 d植株上存活的褐飞虱。
1.6 褐飞虱增质量率
将生长10 d的水稻幼苗分别移栽于装有不同营养液的塑料桶(直径29 cm、高20 cm)中，每桶移栽4株水稻幼苗，每处理5次重复， 生长30 d后的幼苗用于测定褐飞虱的增质量率。将Parafilm封口膜裁剪成3.5 cm × 3.0 cm大小的长方形蜡袋，其一角边留1 cm长度的口径，用于接入褐飞虱并绑在水稻茎部。用精度为十万分之一的电子天平称量接虫褐飞虱前、后的质量，预称10头2~3龄褐飞虱若虫的体质量，接虫5 d后，再次称量存活褐飞虱的体质量，存活褐飞虱的虫体增质量率(M)计算公式[17]为：
$$ M=(m_{{\rm{f}}}-m_{{\rm{o}}})/ m_{{\rm{o}}} \times 100{\text{%}}\text{，}$$ (1) 式中，mo和mf分别为每桶处理中存活褐飞虱的初始和最终平均质量。
1.7 褐飞虱蜜露排泄量
将生长10 d的单株幼苗用轻质塑料板固定在塑料杯中，不同浓度营养液处理10 d后，接入20头2~3龄褐飞虱若虫。接虫5 d后，可以看到褐飞虱排泄的蜜露附着在植株周围的塑料板上。根据蜜露在轻质塑料板上排出蜜露的半径大小[0, 0.1)、[0.1, 0.5)、[0.5, 1.0)、[1.0, 2.0)、[2.0, 3.0)、[3.0, 4.0)和[4.0, 5.0 )cm，分别给予0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0的分值。其中，分值0表示没有蜜露排出。分值越低，说明昆虫排出的蜜露越少。每个处理试验重复5次。
1.8 褐飞虱寄主选择试验
为测定褐飞虱在不同营养液培养的寄主选择行为，将生长10 d的单株水稻幼苗固定在塑料杯中的轻质塑料板，不同质量浓度营养液处理10 d后，分别将低质量浓度、对照和高质量浓度营养液处理的1杯幼苗放入同一个尼龙网箱中，将45头2~3龄褐飞虱若虫投放入网箱内塑料杯上齐平的塑料板中，密封网箱防止褐飞虱外逃。接虫后12、24、48、96和120 h统计每株水稻植株上褐飞虱的附着数量，每个处理试验重复10次。
2. 结果与分析
2.1 水源是影响褐飞虱生存的重要因素
多次苗期集团法抗虫鉴定结果(图1)表明，水稻品系‘BPHR96’对来源于广西南宁市水稻田的混合生物型褐飞虱群体表现出高抗性。水稻幼苗三叶期植株接虫15 d后进行抗性等级评级，水稻品系‘9311’和‘BPHR96’的平均抗虫等级为8.6和2.3 (图1A)。
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图 1 水稻品系抗褐飞虱评级(A)和不同水源和食物处理下褐飞虱的死亡率(B)“****”表示‘BPHR96’与‘9311’的褐飞虱抗性等级差异显著(P < 0.0001，t检验)Figure 1. Resistance grade of rice lines to brown planthopper (A) and mortality rate of brown planthopper under different water and food treatments (B)“****” indicates significant difference in resistance grade between ‘BPHR96’ and ‘9311’ (P < 0.0001, t test)为探究水源和食物对褐飞虱死亡率的影响，在有‘9311’茎段、‘BPHR96’ 茎段、少许水源和无水源的塑料杯中分别接入10头2龄褐飞虱，记录接虫后褐飞虱的死亡率。结果(图1B)发现，饥饿处理的褐飞虱死亡率上升迅速，无水饥饿处理的褐飞虱在接虫48 h后完全死亡，与此同时，取食‘BPHR96’和‘9311’的褐飞虱死亡率仅为19.7%和20.7%。到接虫216 h时，有水饥饿处理的死亡率达到96.8%，取食‘BPHR96’的死亡率也达到85.0%，而取食‘9311’的褐飞虱死亡率始终维持在较低水平(44.3%)。上述结果表明，环境有无水源是影响褐飞虱死亡速率的重要因素，而食物的适口性也最终会影响褐飞虱的死亡速率。
2.2 不同质量浓度氮磷钾对水稻幼苗生长及褐飞虱取食的影响
不同质量浓度氮磷钾营养可显著影响水稻品系‘9311’和‘BPHR96’的分蘖数、株高、根长、地上部鲜质量和根鲜质量。与低质量浓度氮磷钾处理相比，水稻品系‘9311’和‘BPHR96’在对照和高质量浓度氮磷钾处理的分蘖数分别增加41.7%~108.3%和107.7%~161.5%，株高分别增加53.2%~58.4%和31.0%~31.5%，根长分别增加80.7%~103.5%和75.7%~89.6%，地上部鲜质量分别增加259.3%~379.1%和217.3%~371.2%。而对照的根鲜质量则显著高于低和高质量浓度氮磷钾的，其中‘9311’分别增加109.6%和93.9%，‘BPHR96’分别增加79.8%和70.8%。以上结果说明氮磷钾作为植物生长必须的大量元素，对照和高质量浓度氮磷钾营养液能提供水稻幼苗生长发育所需的营养，长势显著增强(图2A、2B)。 图2C、2D分别显示了‘9311’和‘BPHR96’在不同氮磷钾质量浓度处理下褐飞虱存活数量的时间变化。低质量浓度氮磷钾处理的‘9311’褐飞虱存活数量在8 和9 d显著低于对照和高质量浓度的，平均分别少了1.3~1.4和1.1~1.2头。而低和对照质量浓度氮磷钾的‘BPHR96’褐飞虱存活数量在7、8和9 d显著低于高质量浓度的，平均分别少了1.6~2.4，1.9~2.0和1.7头。由图2E可知，取食对照和高质量浓度氮磷钾的褐飞虱增质量率显著高于低质量浓度的。对于‘9311’，对照和高质量浓度氮磷钾的增质量率分别是低质量浓度的1.6和2.1倍，对于‘BPHR96’，分别为1.5和1.8倍。由图2F可知，取食对照和高质量浓度氮磷钾‘9311’的褐飞虱蜜露排泄量显著高于低质量浓度的，分别为其2.1和2.6倍，而取食高质量浓度氮磷钾‘BPHR96’的褐飞虱蜜露排泄量显著高于低/对照质量浓度的，为低质量浓度的3.5倍和对照质量浓度的5.0倍。可见，低质量浓度氮磷钾培养的水稻幼苗不利于褐飞虱的取食和消化行为，表现出更强的抗生性；而对于高抗性水稻，提高营养条件也能促进褐飞虱的生长发育，从而降低植株的抗性。图2G、2H分别显示了‘9311’和‘BPHR96’在不同质量浓度氮磷钾处理下寄主选择的褐飞虱数量的时间变化。对于‘9311’，72、96和120 h低质量浓度氮磷钾处理的褐飞虱数量均显著低于对照和高质量浓度的，并且高质量浓度氮磷钾处理的褐飞虱数量在12、24和48 h显著低于对照的。对于‘BPHR96’，接虫后12 至120 h的6个观察时间点，低质量浓度氮磷钾处理的褐飞虱数量均低于对照和高质量浓度的，对照的褐飞虱数量仅在120 h处显著高于高质量浓度氮磷钾处理的。有趣的是，结果还发现2个水稻品系的6个观察时间点，对照的平均寄主选择褐飞虱数量都是最多的。可见，褐飞虱更倾向取食正常质量浓度氮磷钾的幼苗，而对低质量浓度氮磷钾处理的幼苗表现较强的趋避性，这种现象在抗性水稻品系尤为明显。
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图 2 不同氮磷钾质量浓度对水稻品系‘9311’和‘BPHR96’苗期生长与褐飞虱取食的影响各小图中同一指标图柱上不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)；TN：分蘖数；PH：株高(cm)；RL：根长(cm)；AFW：地上部鲜质量(g)；RFW：根鲜质量(g)Figure 2. Effects of different nitrogen, phosphorus and potassium mass concentration on seedling growth and brown planthopper feeding of rice lines ‘9311’ and ‘BPHR96’Different lowercase letters on the same indicator bar indicate significant difference among treatments (P < 0.05, DMRT method); TN: Tiller number; PH: Plant height (cm); RL: Root length (cm); AFW: Aboveground fresh weight (g); RFW: Root fresh weight (g)2.3 不同钾质量浓度对水稻幼苗生长与褐飞虱取食的影响
综合水稻品系‘9311’和‘BPHR96’分析，与对照相比，低质量浓度钾抑制水稻幼苗生长，高质量浓度钾促进水稻幼苗生长(图3A、3B)。对于‘9311’，低质量浓度钾对水稻幼苗的株高、根长、地上部鲜质量和根鲜质量起到显著抑制作用，与对照相比分别降低了26.9%、30.3%、39.6%和56.2%。对于‘BPHR96’，与对照相比，低质量浓度钾同样起到了显著抑制作用，分蘖数、株高、根长、地上部鲜质量和根鲜质量分别降低了53.1%、14.9%、20.8%、59.8%和57.2%；高质量浓度钾促进株高、根长和根鲜质量的增加，分别显著提高了13.8%、22.2%和32.1%。可见，钾是水稻生长发育极其重要的营养元素之一。
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图 3 不同钾质量浓度对水稻品系‘9311’和‘BPHR96’苗期生长与褐飞虱取食的影响各小图中同一指标图柱上不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)；TN：分蘖数；PH：株高(cm)；RL：根长(cm)；AFW：地上部鲜质量(g)；RFW：根鲜质量(g)Figure 3. Effects of different mass concentration potassium on seedling growth and brown planthopper feeding of rice lines ‘9311’ and ‘BPHR96’Different lowercase letters on the same indicator bar indicate significant difference among treatments (P < 0.05, DMRT method); TN: Tiller number; PH: Plant height (cm); RL: Root length (cm); AFW: Aboveground fresh weight (g); RFW: Root fresh weight (g)从图3C、3D可知，在观察的9 d内，水稻品系‘9311’和‘BPHR96’在低质量浓度钾，对照及高质量浓度钾处理的褐飞虱存活数量均未表现出显著差异，说明无论抗、感水稻品系，不同质量浓度的钾营养不影响褐飞虱的存活数量。图3E显示了对于感性品系‘9311’，不同质量浓度的钾营养对褐飞虱增质量率没有产生显著的影响。而对于抗性品系‘BPHR96’，与对照相比，高质量浓度钾的褐飞虱增质量率显著增加91.7%，但与低质量浓度钾相比没有显著差异。图3F显示了不同质量浓度的钾处理不影响褐飞虱的蜜露排泄量，水稻品系‘9311’和‘BPHR96’均未表现出显著性差异。综合分析认为钾营养浓度不影响褐飞虱的存活数量、增质量率及蜜露排泄量，没有改变水稻对褐飞虱的抗性作用。
从图3G、3H可知，水稻品系‘9311’和‘BPHR96’在观察的120 h内，低质量浓度钾、对照以及高质量浓度钾处理之间均未出现显著差异。可见，钾营养也不会对褐飞虱的寄主选择行为造成影响，即钾营养浓度不改变水稻幼苗对褐飞虱的趋避作用。
3. 讨论与结论
褐飞虱性喜阴湿，水分胁迫能显著降低褐飞虱在感性和抗性水稻品种上的蜜露排泄量、虫体增质量率和产卵数量[18]。于莹等[19]在31 ℃高温条件下，用PEG 6000模拟干旱胁迫时发现，褐飞虱若虫发育历期随PEG 6000质量浓度的升高而延长，褐飞虱的若虫存活率、体质量、孵化率和群体增长倍数随着PEG 6000质量浓度的升高而下降。转录组分析发现，褐飞虱取食水胁迫处理的水稻，体内乙酰辅酶A与线粒体ATP合成酶表达量显著上调，表明水分胁迫导致褐飞虱体内的能量代谢加强，需要消耗更多能量去适应水分胁迫[20]。水稻生产上，可以通过合理灌溉调节田间水分含量，避免大水漫灌，精确用水达到调控褐飞虱危害的目的[21]。本研究的饥饿试验发现，在无饮用水源的条件下对褐飞虱进行饥饿胁迫，其死亡率上升迅速，在接虫后48 h就达到了100%，并远高于有水源的饥饿胁迫及取食抗性水稻品系，表明水源是影响褐飞虱死亡率的重要因子。
矿质元素与植物防御反应有着紧密的联系，许多矿质营养直接参与植物对病虫害的免疫过程。矿质营养增强植物抗病性的机制主要表现为两方面，一方面矿质营养可以促进细胞壁增厚，形成机械障碍；另一方面矿质营养促进植物抗氧化物和多酚类等防御化合物的分泌[22]。例如，硅元素在降低禾本科作物病虫害的严重程度方面有着突出的表现，硅酸盐通过减少植物体内有毒物质的产生，增强木质化，促进病程相关蛋白(Pathogenesis related protein，PR)及酚类物质的产生，从而诱导植物的防御反应。硅元素还在植物表皮细胞积累，形成物理屏障防止真菌类菌丝的渗透蔓延[23]。植物寄主−病原物−矿质营养存在复杂的相互作用，通过调节矿质营养这一重要环境因子，可改善植物生长发育和降低病虫的为害程度。均衡的营养条件可以带来健康的植物，被认为是最有效的病虫害防控措施[2]。氮、磷和钾是水稻所必需的大量营养元素，为保持土壤的肥力，生产上会施用不同形式的肥料到稻田中，过量氮肥可能会引起褐飞虱暴发。有研究表明，100和200 kg/hm2的施氮量能明显缩短水稻受褐飞虱侵染至死亡(抗性等级9级)所需的时间，钾的施用可延长达到完全死亡所需的时长，该研究同时发现磷的施用水平不影响水稻达到9级损死所需要的时长[15]。郑许松等[24]研究表明，施用高水平氮肥提高了褐飞虱对逆境条件的生态适应性，温度和氮肥对褐飞虱存活率、若虫历期和产卵量有显著的交互作用。另有研究指出，低质量浓度氮处理(4 mg/L)或低质量浓度磷处理(1 mg/L)虽对水稻幼苗的生长有显著抑制作用，但与此同时低氮或低磷能显著减少褐飞虱增质量、蜜露排泄量以及存活率，并能显著增强趋避性，氮营养胁迫比磷营养胁迫对褐飞虱趋避作用更为明显[13]。磷营养的有效管理在减轻水稻稻瘟病和黄瓜白粉病方面也有着显著的效果[25-26]。本研究的结果与前人的结论基本一致，高质量浓度氮磷钾处理能显著降低褐飞虱的抗生性，与低质量浓度氮磷钾相比，褐飞虱存活数平均多出1.1~2.0头，增质量率和蜜露排泄量高出1.5~5.0倍，且低质量浓度氮磷钾的寄主选择数量在观察时间12 ~120 h均显著低于高质量浓度或对照的。由此推测，选择在营养更丰富的植株取食，可能是褐飞虱出于繁殖并产生下一代而做出的最佳选择，并且该现象在抗性水稻品系上尤为明显。
钾肥的施用在大多数情况下可以降低病害的发生率，但也有相反的报道，也有在植物与病原物的互作中影响不显著的报道[27-29]。本研究试验结果表明，钾营养的质量浓度与水稻幼苗的长势呈现明显的正相关，但不同质量浓度钾处理下水稻对褐飞虱的抗性没有显著变化，认为钾施用浓度对水稻与褐飞虱互作关系不造成影响。其原因可能是水稻植株体内的钾浓度高于昆虫体内，水稻能满足褐飞虱任何生长时刻的钾需求。也有研究认为，钾的施用降低了植株体内可溶性糖和可溶性蛋白的含量，同时减低了硅的含量，使得褐飞虱的蜜露分泌量没有出现明显变化[7]。在本研究的基础上，未来可以进一步加强氮素和磷素在调控褐飞虱抗性机制的基础研究，为优化稻田水肥管理综合防治褐飞虱提供更多理论依据。
褐飞虱对水分胁迫极为敏感，在无水源的饥饿试验中，褐飞虱死亡率迅速上升，并在48 h达到峰值，说明水分对褐飞虱存活极为重要，在水稻生产中可以结合水稻生长发育需水特点，通过优化田间水分管理有效抑制褐飞虱暴发。低质量浓度氮磷钾处理能显著减低褐飞虱的存活数、增质量率、蜜露排泄量和寄主选择性，并观察到褐飞虱取食高质量浓度氮磷钾处理水稻幼苗有着更高的取食量和消化效率，这预示着通过对水稻氮磷钾营养的调控减轻田间褐飞虱为害是可行的。钾肥的施加可以促进水稻幼苗的长势，但未发现其可在水稻与褐飞虱互作中发挥作用。综上，水分和氮磷钾营养对水稻和褐飞虱的生长都重要，本研究可为优化水分和养分管理措施防治褐飞虱提供一定的参考。
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图 1 转Bt基因自交系检测
1：阳性对照Positive control，2：阴性对照Negative control，3：6DH85，4：6DH222，5：J1401，6：8DH273，7：8DH279，8：DL2000 DNA marker
Figure 1. Detection of transgenic Bt maize inbred lines
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图 2 转Bt基因杂交种检测
1：DL2000 DNA marker，2：阳性对照Positive control，3：阴性对照Negative control，4：PH6WC×J1401，5：J1490×J1401，6：4DH10×J1401，7：PH1CPS×J1401，8：J1495×J1401，9：PH6WC×8DH273，10：J1490×8DH273，11：J1495×8DH273，12：PH1CPS×8DH273，13：4DH10×8DH273，14：PH6WC×8DH279，15：PH6WC×8DH279，16：J1495×8DH279，17：PH1CPS×8DH279，18：4DH10×8DH279
Figure 2. Detection of transgenic Bt maize hybrid lines
表 1 转Bt基因材料苗期、腊熟期田间抗虫表现
Table 1 Insect-resistance performance of transgenic Bt gene material at seedling stage and wax stage
组合
Combination苗期 Seedling stage 腊熟期 Maturation stage 食叶级别
Leaf-feeding
level虫害级别1)
Pest
level茎秆折断率/%
Stem breakage
rate雌穗被害级别
Ear damage level虫害级别1)
Pest
level茎秆折断率/%
Stem breakage
ratePH6WC×J1401 6.84 S 0 5.14 S 0 J1490×J1401 6.33 S 0 5.21 S 0 J1495×J1401 0 HR 0 1.00 HR 0 PH1CPS×J1401 6.98 S 0 5.27 S 0 4DH10×J1401 4.92 MR 0 5.29 S 0 PH6WC×8DH273 0.23 HR 0 1.00 HR 0 J1490×8DH273 0.89 HR 0 1.00 HR 0 J1495×8DH273 0 HR 0 1.00 HR 0 PH1CPS×8DH273 0 HR 0 1.00 HR 0 4DH10×8DH273 0 HR 0 1.00 HR 0 PH6WC×8DH279 0 HR 0 1.00 HR 0 J1490×8DH279 0 HR 0 1.00 HR 0 J1495×8DH279 0 HR 0 1.00 HR 0 PH1CPS×8DH279 0 HR 0 1.00 HR 0 4DH10×8DH279 0 HR 0 1.00 HR 0 8DH273 0 HR 0 1.00 HR 0 8DH279 0 HR 0 1.00 HR 0 6DH85 6.75 S 0 5.14 S 0 J1401 0.57 HR 0 1.00 HR 0 6DH222 6.41 S 0 5.05 S 0 PH6WC 6.23 S 0 5.13 S 0 J9D207 6.12 S 0 5.16 S 0 1) HR：高抗，R：抗，MR：中抗，S：感，高感：HS[16]
1) HR：High resistance，R：Resistance，MR：Medium resistance，S：Susceptivity，HS: High susceptivity
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表 2 转Bt基因材料室内抗虫表现1)
Table 2 Indoor identification of insect resistance of transgenic Bt gene material
组合
Combination平均单头虫质量/mg
Average weight of each insect死亡率/%
Mortality组合
Combination平均单头虫质量/mg
Average weight of each insect死亡率/%
Mortality0 d 3 d 6 d 9 d 0 d 3 d 6 d 9 d PH6WC×J1401 8.50 17.10 41.50 60.40 0 J1490×8DH279 8.29 100 37.10 42.10 60.10 80.30 0 40.83 40.19 41.49 43.84 0 88.20 93.40 120.40 140.50 0 91.92 94.87 95.54 96.32 0 J1490×J1401 7.70 12.30 27.50 44.90 0 J1495×8DH279 7.84 100 44.20 49.80 65.70 87.30 0 39.16 38.94 39.61 42.59 0 88.40 95.10 116.90 130.10 0 89.60 91.51 94.35 94.89 0 J1495×J1401 8.30 100 PH1CPS×8DH279 6.93 100 42.00 44.60 47.30 49.60 0 39.48 39.51 41.26 42.11 0 84.40 99.10 96.50 98.40 0 87.52 90.46 92.13 95.62 0 PH1CPS×J1401 8.46 14.90 25.70 41.90 0 4DH10×8DH279 7.61 100 37.30 43.20 56.70 77.20 0 38.42 39.46 39.91 42.53 0 89.40 93.40 107.90 114.60 0 88.46 93.16 95.29 98.89 0 4DH10×J1401 8.76 11.70 19.60 36.80 0 8DH273 9.14 100 33.40 39.40 56.10 74.10 0 40.13 39.16 40.13 42.59 0 90.20 98.60 110.10 119.90 0 90.29 91.95 91.26 93.19 0 PH6WC×8DH273 8.37 100 8DH279 8.61 100 36.87 37.23 37.41 38.56 0 42.84 43.19 44.62 44.89 0 93.48 95.29 96.94 98.26 0 90.16 91.16 93.56 93.89 0 J1490×8DH273 7.89 100 6DH85 9.33 14.10 23.10 48.90 0 37.52 38.19 40.53 41.61 0 38.40 41.70 57.80 67.60 0 92.87 94.51 95.16 97.19 0 89.20 94.50 115.30 123.10 0 J1495×8DH273 8.06 100 J1401 9.70 100 34.13 33.81 34.13 36.45 0 34.50 36.40 35.10 37.20 0 88.24 91.19 93.46 94.60 0 85.50 87.60 97.80 97.50 0 PH1CPS×8DH273 9.23 100 6DH222 7.91 14.70 28.60 64.90 0 36.95 37.51 39.48 39.89 0 39.10 44.80 65.10 78.90 0 89.51 91.46 92.51 95.49 0 84.20 94.10 109.70 119.60 0 4DH10×8DH273 9.12 100 PH6WC 7.82 11.40 19.90 47.90 0 37.23 36.26 38.13 39.49 0 35.60 45.70 59.00 77.90 0 89.62 93.61 96.13 98.60 0 84.30 94.30 113.60 123.90 0 PH6WC×8DH279 8.16 100 J9D207 6.72 13.50 24.60 56.70 0 41.25 43.62 43.89 46.91 0 36.40 44.50 68.90 89.40 0 93.12 94.29 94.13 95.36 0 87.20 96.50 114.70 130.80 0 1) 表中数据空白处表示玉米螟虫已被转Bt基因玉米叶片毒死
1) Blank data in the table indicate that the corn locusts had been poisoned by the Bt gene maize leaves
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表 3 玉米植株各性状方差分析1)
Table 3 Variance analysis of different characters of maize plant
变异来源
Variance sourceDF 穗长
Ear length穗粗
Ear coarse秃尖长
Baretop length穗质量
Ear weigh百粒质量
100-grain weight产量
Yield组合 Combination 29 656.71** 8.85** 203.30** 855.39** 417.84** 622.40** 亲本 Parent 28 229.00** 5.36** 166.63** 254.39** 115.37** 296.03** 误差 Error 39 0 0.99 0 3.55 0.05 0.01 1) “*”和“**”分别表示影响达到0.05和0.01的显著水平
1) “*” and “**” indicate the effect reaches 0.05 and 0.01 significance levels, respectively
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表 4 不同组合产量多重比较
Table 4 The multiple comparisons of area yield in different combination
组合
Combination产量1)/
(×103 kg·hm−2)
Yield增产/%
Yield
increase是否含Bt基因
Whether or not containing
Bt gene组合
Combination产量1)/
(×103 kg·hm−2)
Yield增产/%
Yield
increase是否含Bt基因
Whether or not containing
Bt gene4DH10×8DH279 15.20a 31.10 是 Yes PH6WC×6DH85 13.15hi 13.36 否 No PH6WC×8DH279 14.90ab 28.45 是 Yes J1490×J1628 12.88ij 11.03 否 No 4DH10×8DH273 14.67bc 26.48 是 Yes J1495×J1401 12.76ijk 10.04 是 Yes J1490×8DH279 14.47bcd 24.75 是 Yes J1490×6DH85 12.75ijk 9.88 否 No PH6WC×8DH273 14.36cde 23.83 是 Yes 4DH10×J1668 12.55jk 8.20 否 No J1490×8DH273 14.11def 21.68 是 Yes PH1CPS×6DH222 12.50jk 7.79 否 No PH1CPS×8DH279 14.02defg 20.87 是 Yes PH1CPS×J9D207 12.39ljk 6.84 否 No J1495×J9D207 13.97defg 20.39 否 No PH6WC×J1668 12.32lk 6.17 否 No J1495×8DH279 13.89efg 19.70 是 Yes J1495×J1628 11.72l 1.05 否 No J1495×8DH273 13.66fgh 17.73 是 Yes 先玉335(CK) 11.60l 否 No 4DH10×J1628 13.58gh 17.11 否 No 4DH10×J1401 9.65m −16.81 否 No 4DH10×J9D207 13.52gh 16.52 否 No PH1CPS×J1401 8.48n −26.91 否 No PH1CPS×8DH273 13.25hi 14.22 是 Yes J1490×J1401 7.99no −31.10 否 No PH6WC×J1628 13.24hi 14.14 否 No PH6WC×J1401 7.70o −33.62 否 No 1) 同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05, Tukey法)
1) Different lowercase letters of the same column indicate significant difference (P < 0.05, Tukey method)
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表 5 转Bt基因材料产量性状的杂种优势
Table 5 Heterosis of transgenic Bt gene materials
% 组合
Combination平均优势
Average
heterosis对照优势
Control
heterosis组合
Combination平均优势
Average
heterosis对照优势
Control
heterosis组合
Combination平均优势
Average
heterosis对照优势
Control
heterosisPH6WC×6DH85 115.56 14.63 PH6WC×J9D207 71.61 −5.11 4DH10×8DH273 124.85 26.48 J1490×6DH85 102.29 11.11 J1490×J9D207 58.61 −9.53 PH6WC×6DH222 61.77 −11.84 J1495×6DH85 36.63 −26.65 J1495×J9D207 118.17 21.74 J1490×6DH222 46.64 −17.53 PH1CPS×6DH85 81.01 0.93 PH1CPS×J9D207 86.66 8.04 J1495×6DH222 33.85 −26.38 4DH10×6DH85 59.55 −15.75 4DH10×J9D207 114.55 17.83 PH1CPS×6DH222 90.97 9.00 PH6WC×J1401 37.51 −32.88 PH6WC×J1628 88.18 15.42 4DH10×6DH222 47.65 −20.09 J1490×J1401 37.81 −30.32 J1490×J1628 77.99 12.27 PH1CPS×8DH279 98.48 20.87 J1495×J1401 125.60 11.27 J1495×J1628 65.24 2.19 4DH10×8DH279 126.13 31.10 PH1CPS×J1401 43.81 −26.09 PH1CPS×J1628 53.46 −1.92 PH6WC×J1668 100.43 7.36 4DH10×J1401 73.67 −15.88 4DH10×J1628 94.26 18.42 J1490×J1668 80.47 −0.19 PH6WC×8DH273 118.69 23.83 PH6WC×8DH279 120.15 28.45 J1495×J1668 75.73 −4.98 J1490×8DH273 108.53 21.67 J1490×8DH279 107.67 24.75 PH1CPS×J1668 63.35 −8.29 J1495×8DH273 106.10 17.73 J1495×8DH279 103.41 19.70 4DH10×J1668 105.71 9.41 PH1CPS×8DH273 93.03 14.22
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