Regulation mechanism of Mycobacterium bovis PtpA protein on NF-κB signaling pathway
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摘要:目的
研究牛分枝杆菌Mycobacterium bovis PtpA蛋白对免疫应答相关的NF-κB信号通路的影响，以揭示PtpA蛋白在机体免疫应答中的作用。
方法构建PtpA基因真核表达载体FLAG-PtpA，并将其转染到HEK293T中，进行SDS-PAGE分析及Western blot检测。激活NF-κB信号通路后，通过双荧光素酶试验和qPCR方法探究PtpA蛋白对NF-κB信号通路的影响。
结果成功构建PtpA基因真核表达载体FLAG-PtpA，转染HEK293T后经SDS-PAGE分析，相对分子质量约为22 000处可见特异性蛋白条带。Western blot结果显示，表达产物可与一抗特异性结合，证明该蛋白是PtpA蛋白。双荧光素酶试验中，转染2~24 h，试验组与对照组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光强度的比值差异显著(P<0.05)；转染2 h后，对照组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光值是试验组的2.93倍，说明PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活早期具有显著的抑制作用。qPCR结果显示，转染2 h后，对照组的IL-6、GM-CSF、BIRC-2和BIRC-3的表达量分别是试验组的3.93、3.42、2.17和2.30倍(P<0.01)；转染4 h后，对照组的IL-6、GM-CSF、BIRC-2和BIRC-3的表达量分别是试验组的4.26、3.93、2.36和2.50倍(P<0.01)，说明PtpA蛋白对NF-κB信号通路相关的细胞因子(IL-6、GM-CSF、BIRC-2、BIRC-3)在免疫早期具有显著抑制作用。
结论qPCR结果与双荧光素酶试验结果一致，表明牛分枝杆菌PtpA蛋白对NF-κB信号通路的影响主要发生在早期。本研究为后续研究有效的结核病防控药物提供了理论基础。
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Mycobacterium bovis PtpA protein on NF-κB signaling pathway which is related to immune response, and reveal the role of PtpA protein in the body's response to immunity.
MethodThe PtpA gene eukaryotic expression vector FLAG-PtpA was transfected into HEK293T for SDS-PAGE analysis and Western blot detection. After activation of NF-κB signaling pathway, the effects of PtpA protein on NF-κB signaling pathway were investigated by dual luciferase assay and qPCR.
ResultThe eukaryotic expression vector FLAG-PtpA of PtpA gene was successfully constructed, transfected into HEK293T and analyzed by SDS-PAGE. The specific molecular band was visible with relative molecular mass of 22 000. Western blot results showed that the expression product specifically bound to the primary antibody, demonstrating that the protein was a PtpA protein. In the double luciferase assay, the ratios of the relative fluorescence intensities of firefly luciferase and Renilla luciferase in the test group and the control group were significantly different from 2 to 24 h after transfection (P<0.05). The relative fluorescence values of firefly luciferase and Renilla luciferase in the control group were 2.93 times higher than those in the experimental group 2 h after transfection, indicating that PtpA protein had a significant inhibitory effect on the early activation of NF-κB signaling pathway. qPCR results showed that the expression levels of IL-6, GM-CSF, BIRC-2 and BIRC-3 in the control group were 3.93, 3.42, 2.17 and 2.30 times respectively of those in the test group 2 h after transfection(P<0.01), and were 4.26, 3.93, 2.36 and 2.50 times respectively of those in the test group 4 h after transfection(P<0.01). These results indicated that PtpA protein had a significant inhibitory effect on NF-κB signaling pathway-associated cytokines (IL-6, GM-CSF, BIRC-2 and BIRC-3) in the early stage of immunization.
ConclusionqPCR results are consistent with the results of dual luciferase assay, indicating that the effect of M. bovis PtpA on NF-κB signaling pathway mainly occurs in the early stage. This study provides a theoretical basis for the follow-up study of effective tuberculosis prevention and control drugs.
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Keywords:
- bovine tuberculosis /
- Mycobacterium bovis /
- PtpA protein /
- NF-κB signaling pathway /
- cytokine /
- immune response
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甜、糯玉米是世界上非常重要的鲜食玉米类型，其产量和产值均位居蔬菜作物前列。甜、糯玉米是广东省具有优势和特色的农作物，经济效益高，已形成重要的产业[1]，至2014年，甜玉米种植面积已增至22.0 万hm2，产量为310.2万t，分别占全国甜玉米种植面积的66.1%和产量的62.1%[2]。经过多年的发展，我国已成为全球最大的鲜食玉米种植国、生产国、加工国和消费国，据2016年统计，全国鲜食玉米总种植面积达133.33万hm2，其中糯玉米80万hm2，甜糯玉米13.33万hm2，甜玉米40万hm2[3]。
甜玉米由控制胚乳碳水化合物转化的一个或多个相关基因发生隐性突变形成，是隐性胚乳突变体。迄今为止，世界范围内已发现多个玉米胚乳隐性突变体基因，如su1、su2、sh1、sh2、bt1、bt2、se等[4]。在灌浆期和乳熟期，这些突变体基因可以使胚乳中淀粉合成受阻，从而使籽粒中可溶性糖大量积累，淀粉则显著减少。糯玉米起源于我国西南地区的西双版纳和广西亚热带地区，由普通玉米中的wx基因发生隐性突变形成[5]，其淀粉由95%~100%的支链淀粉组成，具有较强的黏性和糯性，果穗成熟后呈非透明、无光泽的蜡质状，所以糯玉米也被称作蜡质玉米。
随着经济的持续发展和生活水平的提高，人们对鲜食玉米需求量增加的同时，对其品质也提出了更高要求，出现了一种新的鲜食玉米类型，即甜加糯型鲜食玉米。甜加糯玉米最早由著名玉米育种家谢孝颐先生提出，利用糯玉米与甜玉米杂交分离出糯超甜双隐性株系，再与糯玉米杂交可收获包含糯与甜糯2种籽粒类型的新型玉米[6-7]。甜加糯型玉米表现为同一果穗上既有甜玉米籽粒也有糯玉米籽粒，兼有甜、糯2种口味，市场份额逐年上升[8-9]。
wx基因和其他多个胚乳隐性基因间存在互作，ae、du和wx 3个基因隐性纯合时蔗糖含量高达23.7%，但它们单独存在时蔗糖累积很少，su和wx双基因隐性纯合时可溶性糖高达47.5%[10]。李新海等[11]报道，3对SSR引物phi022、phi027、phi061与糯玉米隐性基因wx紧密连锁，杨耀迥等[12]利用这3对SSR引物进行分子标记辅助选择，成功选育出9个甜糯双隐性纯合自交系。本研究探索应用分子标记辅助育种技术快速选育甜糯双隐性玉米自交系的技术和方法，并对选育的甜糯双隐性基因玉米材料进行品质鉴定与评价，旨在提高甜糯玉米育种效率，为促进甜糯玉米育种提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料
选用由华南农业大学农学院甜玉米课题组选育的1份甜玉米骨干系M01(sh2sh2)和3份糯玉米自交系L33、L35和L38(wxwx)为亲本材料，于2013年春季杂交得到F1代，2013年秋季F1代种子自交获得F2代，果穗籽粒性状分离，表现为甜(sh2sh2)、糯(wxwx)和普通(wxsh2)3种玉米籽粒类型，表型为皱缩和非皱缩籽粒分离，选择皱缩籽粒留种。2014年春季，选择F2种子中留种的皱缩籽粒播种，在苗期取幼嫩叶片提取全基因组DNA，用SSR标记鉴定基因型为wxwxsh2sh2的甜糯双隐性单株，挂牌并自交，获得甜糯双隐性基因型F3代种子。2014年秋季种植F3代种子，选择表型相对一致的株系自交，得11个F4代甜糯双隐性基因型自交系。2015年春，将这11个F4代甜糯双隐性自交系与甜、糯玉米亲本采用随机区组试验设计种植于华南农业大学增城试验基地，每个小区行长2 m，宽0.67 m，株距0.3 m，行距0.5 m，每个自交系种植2行，3次重复，采用常规大田管理技术，于乳熟期检测籽粒可溶性糖含量、总淀粉含量及果皮厚度，并与亲本进行比较分析。
1.2 试剂
主要试剂Taq DNA聚合酶、dNTPs、Buffer、MgCl2等均购自广州东盛生物科技有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1.3 DNA提取
于大喇叭口期采集F2代单株幼嫩叶片，采用改良CTAB法[13]提取叶片全基因组DNA，用1×TE稀释至25 mg·L–1，于–20 ℃冰箱中保存备用。
1.4 引物及PCR反应体系
用于扩增wx基因的SSR引物引自前期研究[11-12]，序列来源于Maizegdb网站http://www.maizegdb.org，引物序列详见表1。PCR反应通过PTC-100TM型PCR仪完成，反应总体系为20 μL[14]：50~60 ng·μL–1的玉米材料基因组DNA 2.00 μL，10× PCR Buffer(含Mg2+)2.00 μL，25 mmol·L−1的 dNTPs 1.20 μL，2 U·μL–1的Taq酶0.50 μL，30 ng·μL−1的Primer(Primer F和Primer R)各0.60 μL，ddH20 13.10 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min，引物phi022、phi027和phi061的退火温度分别为57、60和61 ℃。
表 1 鉴定wxwx基因型的3个SSR引物序列Table 1. The sequences of three SSR primers for wxwxgenotype identification引物名称
Primer name序列(5′→3′)
Primer sequencephi022 F-TGCGCACCAGCGACTGACC R-GCGGGCGACGCTTCCAAAC phi027 F-GCGTACGTACGACGAAGACAC R-CACAGCACGTTGCGGATTTCTCT phi061 F-AAACAAGAACGGCGGTGCTGATTC R-GACGTAAGCCTAGCTCTGCCAT 1.5 乳熟期籽粒可溶性糖及淀粉含量检测
雌穗套袋控制授粉时间，于授粉后22 d，11个自交系株系和每份亲本材料取3个果穗，用镊子或刀片剥取完好的玉米籽粒，并选取大小相对一致的籽粒为试验材料。准确称取20 g玉米籽粒，匀浆，加入20 mL蒸馏水，搅拌均匀后10 000 r·min–1离心10 min，取上清液。向离心管剩余的固体中添加20 mL蒸馏水，搅拌均匀后再次10 000 r·min–1离心10 min，合并2次上清液，移至250 mL容量瓶中定容，制成玉米可溶性糖提取液。按照蒽酮法[15]测定甜玉米籽粒中可溶性糖含量，淀粉含量测定按照NY/T 11—1985标准[16]进行。
1.6 鲜玉米籽粒果皮厚度的测量
套袋授粉22 d后，每份材料取3个果穗，每个果穗取中部5颗籽粒，每颗籽粒分别取顶部和背胚部2 mm×2 mm大小的果皮，采用常规石蜡组织切片技术制片，果皮取材后立即放入FAA固定液，固定后经体积分数为50%、70%、85%、95%和100%的乙醇逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片，展片，染色和封片，在Primo Star光学显微镜(Zeiss，德国) 400×下观察并拍照。
1.7 数据统计与分析
PCR扩增结果有带记为1，无带记为0，采用Excel 2007进行χ2分析。可溶性糖及淀粉含量：在波长620 nm下比色，分别记录光密度值(D620 nm)，查标准曲线得知对应的葡萄糖质量(m/μg)，用以下公式计算甜玉米籽粒中可溶性糖及淀粉含量：
$$ \begin{aligned} w \left({ \text{可溶性糖}} \right) =km/10^6 M \times 100{\text{%}}, \end{aligned}$$ (2) $$ \begin{aligned} w \left({\text{淀粉}} \right) ={KD_{620\; {\rm{nm}}}}/203LM\times 100{\text{%}}, \end{aligned}$$ (1) 式中：k和K为稀释倍数；M为样品质量，g；L为比色管长度，dm。
果皮厚度在显微镜下测量3次，取平均值，精确到1 μm。采用Excel 2007进行统计分析，用SAS V8.0进行t检验。
2. 结果与分析
2.1 wx基因的功能标记筛选
对与糯玉米隐性基因wx紧密连锁的3对SSR引物phi022、phi027、phi061在1份甜玉米骨干系M01和3份糯玉米自交系L33、L35和L38之间进行多态性筛选(图1)，发现引物phi022和phi027在甜玉米和糯玉米亲本间表现无差异，引物phi061的扩增条带清楚完整且差异明显，表现为共显性，因此选择引物phi061鉴定3个F2分离群体中的甜糯双隐性植株(图2)。由于引物phi061为共显性标记，可以鉴定出WxWx显性纯合基因个体、Wxwx杂合基因个体和wxwx隐性纯合基因个体，由图2看出，在来自杂交L35×M01的F2群体中与糯玉米亲本L35条带处于同一位置且仅为单带的共有4个单株(泳道1、8、11和12)，这4个单株的基因型为wxwxsh2sh2，仅对含有甜糯双隐基因的单株自交以减少工作量。
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图 1 引物phi022、phi027、phi061在甜玉米自交系和糯玉米自交系之间的多态性筛选Figure 1. The polymorphism screenings between sweet corn line (M01) and wax corn lines (L33, L35 and L38) by phi022, phi027 and phi061 primers![]()
图 2 利用引物phi061鉴定L35×M01得到的F2群体中的双隐性植株1~21为以L35×M01得到的F2群体全基因组DNA为模板的PCR扩增产物，其中1、8、11和12为双隐性纯合单株；M01：甜玉米亲本，L35：糯玉米亲本Figure 2. The identifications of double recessive sweet-waxy plants by primer phi061 in F2 populations obtained from L35×M01From one to 21 indicate the PCR amplification products from F2 population genomic DNA obtained from L35 × M01. 1, 8, 11 and 12 indicate their corresponded plants with double recessive sweet-waxy genotype; M01: Sweet corn parental line, L35: Waxy corn parental line2.2 功能标记在F2代群体中的χ2分析
对3个F2群体后代中糯质基因的分离比例进行χ2分析(表2)，糯质隐性纯合植株与非隐性纯合植株的理论比例为1︰3。L33×M01的F2代群体的χ2为0.03，L35×M01的F2代群体的χ2为0.40，L38×M01的F2代群体的χ2为0.01，其对应的概率P均大于0.05，差异不显著，表明糯质基因的分离比例符合理论比例。以上结果显示3个分离世代基因型的分离比例均符合孟德尔遗传定律，表明运用该功能标记对3个F2代群体隐性纯合单株的选择有效，甜质基因与糯质基因间不存在连锁关系。在3个F2群体中成功鉴定出基因型为wxwxsh2sh2的甜糯双隐性纯合植株分别为3、4和8株，共计15株，经两代自交，实际得到11个甜糯双隐性基因型自交系。
表 2 引物phi061在F2代群体中的χ2分析Table 2. The chi-square analysis of primer phi061 in F2 populations杂交组合
Hybrid combination植株总数量
Total plant number甜糯双隐性植株数量
No. of plants with wxwxsh2sh2非甜糯双隐性植株数量
No. of plants with Wx_sh2sh2χ2 P L33×M01 11 3 8 0.03 0.86 L35×M01 21 4 17 0.40 0.53 L38×M01 33 8 25 0.01 0.92 2.3 甜糯双隐性自交系材料的可溶性糖含量分析
F4代甜糯双隐性自交系L1~L11及甜、糯质亲本可溶性糖含量测定结果如表3显示。11份自交系材料的可溶性糖质量分数平均为12.27%，标准差平均为1.61%，变异系数平均为0.13，可溶性糖质量分数平均变幅为8.65%~16.77%；甜质亲本的可溶性糖质量分数平均为9.72%，标准差平均为0.67%，变异系数平均为0.07，可溶性糖质量分数平均变幅为9.25%~10.49%；3个糯质亲本的可溶性糖质量分数平均为3.51%，标准差平均为0.86%，变异系数平均为0.25，可溶性糖质量分数平均变幅为1.15%~6.78%。11份甜糯双隐性自交系材料的可溶性糖质量分数均高于对应的甜、糯质亲本，其中质量分数最高的是株系L6，为14.15%，最低的是L38，为1.64%。
表 3 11份甜糯双隐性自交系材料与甜、糯质亲本可溶性糖含量Table 3. Soluble sugar contents in 11 double recessive sweet-waxy inbred lines and their parents株系
Strain材料来源
Material sourcew(可溶性糖)1)/%
Soluble sugar content标准差/%
Standard deviation变异系数
Coefficient of variation变幅/%
RangeL1 L33×M01 13.44±1.63 2.82 0.21 11.03~16.54 L2 L33×M01 9.74±0.55 0.94 0.10 8.65~10.30 L3 L33×M01 12.04±1.02 1.76 0.15 10.00~13.08 L4 L35×M01 13.76±1.91 3.31 0.24 9.96~15.97 L5 L35×M01 10.73±1.01 1.74 0.16 8.95~12.43 L6 L35×M01 14.15±0.48 0.84 0.06 13.43~15.07 L7 L38×M01 13.88±1.45 2.51 0.18 12.27~16.77 L8 L38×M01 10.07±0.30 1.05 0.10 9.25~11.25 L9 L38×M01 12.42±0.29 0.50 0.04 11.89~12.87 L10 L38×M01 11.11±0.61 1.06 0.10 9.89~11.81 L11 L38×M01 13.59±0.69 1.19 0.09 11.25~14.49 M01 甜质亲本 9.72±0.39 0.67 0.07 9.25~10.49 L33 糯质亲本 3.76±0.35 0.60 0.16 3.08~4.19 L35 糯质亲本 5.13±0.85 1.48 0.29 3.97~6.78 L38 糯质亲本 1.64±0.51 0.51 0.31 1.15~2.18 1) 该列数据为平均值 ± 标准误
1) Data in this column are average value ± standard error对11份甜糯双隐性自交系与对应亲本的可溶性糖含量差异进行t检验，结果如表4所示。除了株系L2、L5和L8外，其余8份自交系的可溶性糖含量均显著高于甜质亲本(P<0.05)；11份自交系的可溶性糖含量均极显著高于糯质亲本L33、L35和L38(P<0.01)。
表 4 11份甜糯双隐性自交系材料与甜、糯质亲本可溶性糖含量差异t检验1)Table 4. The t test of differences in soluble sugar contents between 11 double recessive sweet-waxy inbred lines and their parents株系
Strain甜质亲本 Sweet parent 糯质亲本 Waxy parent t P t P L1 3.14* 0.02 8.23** <0.01 L2 0.04 0.97 13.07** <0.01 L3 3.02* 0.02 7.37** <0.01 L4 2.93* 0.03 5.84** <0.01 L5 1.33 0.23 6.01** <0.01 L6 10.12** <0.01 31.23** <0.01 L7 3.91** <0.01 11.69** <0.01 L8 0.68 0.52 17.69** <0.01 L9 7.91** <0.01 36.88** <0.01 L10 2.72* 0.03 19.74** <0.01 L11 6.94** <0.01 22.57** <0.01 1) “*” 和 “**” 分别表示在 0.05 和 0.01 水平差异显著
1) “*” and “**” indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively2.4 甜糯双隐性自交系材料的淀粉含量分析
甜糯双隐性自交系L1~L11及甜、糯质亲本的淀粉含量如表5所示。11份自交系材料的淀粉含量(w)平均为19.73%，标准差平均为1.50%，变异系数平均为0.08，淀粉含量平均变幅为15.67%~23.78%；甜质亲本的淀粉含量(w)平均为23.50%，标准差平均为1.71%，变异系数平均为0.07，淀粉含量平均变幅为21.92%~25.31%；3个糯质亲本的淀粉含量(w)平均为47.34%，标准差平均为5.25%，变异系数平均为0.11，淀粉含量平均变幅为41.59%~57.08%。11份自交系淀粉含量均低于对应的甜、糯质亲本，其中含量(w)最高的是株系L6，为22.50%，含量最低的是株系L8，为16.60%。
表 5 11份甜糯双隐性自交系材料与甜、糯质亲本淀粉含量Table 5. Starch contents in 11 double recessive sweet-waxy inbred lines and their parents株系
Strain材料来源
Material sourcew(淀粉)1)/%
Starch content标准差/%
Standard deviation变异系数
Coefficient of variation变幅/%
RangeL1 L33×M01 21.97±1.07 1.86 0.08 19.92~23.51 L2 L33×M01 19.03±0.84 1.46 0.08 17.42~20.20 L3 L33×M01 21.13±1.18 2.04 0.10 18.89~22.88 L4 L35×M01 21.80±1.63 2.83 0.13 19.82~23.78 L5 L35×M01 17.90±0.78 1.35 0.08 16.77~23.04 L6 L35×M01 22.50±0.42 0.72 0.03 21.92~23.30 L7 L38×M01 19.23±1.05 1.81 0.09 17.33~20.88 L8 L38×M01 16.60±0.47 0.82 0.05 15.70~18.32 L9 L38×M01 20.63±0.75 1.31 0.06 18.60~22.11 L10 L38×M01 18.47±0.52 0.91 0.05 15.67~19.24 L11 L38×M01 17.80±0.79 1.37 0.08 16.30~19.01 M01 甜质亲本 23.50±0.99 1.71 0.07 21.92~25.31 L33 糯质亲本 50.20±4.10 7.11 0.14 42.92~57.08 L35 糯质亲本 46.33±1.86 3.22 0.07 42.88~49.03 L38 糯质亲本 45.50±3.13 5.43 0.12 41.59~51.72 1) 该列数据为平均值 ± 标准误
1) Data in this column are average value ± standard error对11份甜糯双隐性自交系与对应亲本的淀粉含量差异进行t检验，结果如表6所示。除了株系L1、L3、L4、L6和L9外，其余6份自交系的淀粉含量显著低于甜质亲本M01(P<0.05)；11份自交系的淀粉含量均极显著低于3个糯质亲本(P<0.01)。
表 6 11份甜糯双隐性自交系材料与甜、糯质亲本淀粉含量差异t检验1)Table 6. The t test of differences in starch contents between 11 double recessive sweet-waxy inbred lines and their parents株系
Strain甜质亲本 Sweet parent 糯质亲本 Waxy parent t P t P L1 –1.05 0.35 –6.65** <0.01 L2 –3.44* 0.03 –7.44** <0.01 L3 –1.54 0.20 –11.45** <0.01 L4 –0.83 0.45 –10.84** <0.01 L5 –4.46* 0.01 –14.11** <0.01 L6 –0.93 0.40 –7.27** <0.01 L7 –2.96* 0.04 –7.95** <0.01 L8 –3.96* 0.02 –9.42** <0.01 L9 –2.31 0.08 –7.71** <0.01 L10 –4.51* 0.01 –8.51** <0.01 L11 –4.50* 0.01 –8.56** <0.01 1) “*” 和 “**” 分别表示在 0.05 和 0.01 水平差异显著
1) “*” and “**” indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively2.5 甜糯双隐性玉米材料的果皮厚度分析
11份甜糯双隐性自交系与甜、糯质亲本的果皮厚度如表7所示。11份自交系材料籽粒冠部果皮厚度平均为40.83 μm，标准差平均为5.37 μm，变异系数平均为0.07，冠部果皮厚度平均变幅29.95~52.01 μm；甜质亲本冠部果皮厚度平均为28.07 μm，标准差为0.11 μm，变异系数平均为0.12，冠部果皮厚度平均变幅为24.19~32.89 μm；3个糯质亲本冠部果皮厚度平均为60.34 μm，标准差为5.13 μm，变异系数平均为0.04，冠部果皮厚度平均变幅为50.71~65.93 μm。3个杂交组合(L33×M01、L35×M01和L38×M01)双亲籽粒冠部果皮厚度平均分别为45.38、45.97和41.26 μm，11份自交系籽粒冠部果皮厚度与对应亲本的果皮厚度均值相近。11份自交系籽粒背胚侧果皮厚度平均为59.68 μm，标准差平均为10.43 μm；甜质亲本背胚侧果皮厚度平均为38.02 μm，标准差为0.10 μm；糯质亲本背胚侧果皮厚度平均为81.17 μm，标准差为15.39 μm。甜糯双隐性自交系材料背胚侧果皮厚度多介于双亲背胚侧果皮厚度之间。
表 7 11份甜糯双隐性自交系与甜、糯质亲本籽粒冠部和背胚侧果皮厚度1)Table 7. The pericarp thickness on the crown and dorsal embryo side of the grain in 11 double recessive sweet-waxy inbred lines and their parents株系
Strain材料来源
Material Source冠部 Crown 背胚侧 Dorsal embryo side 果皮厚度/μm
Pericarp thickness变幅/μm
Range果皮厚度/μm
Pericarp thickness变幅/μm
RangeL1 L33×M01 46.93±1.98 40.59~52.01 58.08±2.61 52.20~66.22 L2 L33×M01 35.29±0.81 33.09~37.53 43.07±1.51 39.32~46.86 L3 L33×M01 32.48±0.83 29.95~34.22 43.30±0.85 41.34~46.23 L4 L35×M01 43.02±1.19 39.49~46.77 52.56±0.63 50.26~53.94 L5 L35×M01 39.17±0.85 37.08~42.18 78.33±0.62 76.80~80.22 L6 L35×M01 39.04±0.31 38.06~40.03 61.04±0.92 58.29~63.37 L7 L38×M01 34.08±1.44 31.48~39.33 66.87±0.83 64.62~68.73 L8 L38×M01 46.75±1.60 41.97~51.20 64.23±0.66 62.53~66.17 L9 L38×M01 40.98±0.91 38.94~44.31 61.01±1.10 58.68~64.38 L10 L38×M01 43.17±2.46 38.66~49.35 60.23±2.49 52.98~65.81 L11 L38×M01 48.17±1.99 40.60~51.52 67.76±1.84 61.53~73.06 M01 甜质亲本 28.07±1.56 24.19~32.89 38.02±0.45 37.02~39.24 L33 糯质亲本 62.69±0.68 61.24~64.76 82.91±3.70 75.56~95.81 L35 糯质亲本 63.87±0.76 62.12~65.93 95.63±1.86 89.29~100.35 L38 糯质亲本 54.45±1.43 50.71~57.60 64.98±1.68 59.95~69.55 1) 表中数据为平均值 ± 标准误
1) Data in the table are average value ± standard error3. 讨论与结论
随着人们生活水平的提高，对鲜食玉米的营养和口味提出了更高的要求。近年来，一种兼有甜、糯2种风味的新型鲜食玉米品种，即甜糯玉米应运而生，成为鲜食玉米市场的新宠[17]。甜糯玉米一般以糯玉米自交系为母本，甜糯双隐性玉米自交系为父本，F2代果穗中有1/4的甜糯玉米籽粒，3/4的糯玉米籽粒[6-7]。选育甜糯双隐性玉米自交系是培育甜糯玉米品种的关键，由于甜质基因sh2和糯质基因wx要均为隐性纯合时方能表达，因此存在选育过程长、效率低的问题。sh2基因隐性纯合时，种子皱缩凹陷，表型明显，但2个基因均隐性纯合时，种子淀粉含量少，通过碘–碘化钾染色法判断甜糯双隐性材料存在一定的困难，利用分子标记辅助选择可以较好地解决这一问题。
分子标记辅助选择是利用分子标记对作物进行改良的一种手段[18]，其基本原理是通过与目标基因紧密连锁或共分离的功能标记锁定目标基因，利用其他分子标记进行全基因组的筛选，以便快速恢复轮回亲本的背景基因，减少连锁累赘，迅速获得期望个体[19-20]。目前该技术已广泛应用于各种作物的品种改良[21-22]和聚合育种[23-24]。应用分子标记辅助选育甜糯双隐性材料由李新海等[11]在2003年提出，发现3对SSR引物与糯玉米隐性基因紧密连锁。杨耀迥等[12]应用分子标记辅助选择从3个甜糯玉米品种的杂交组合中选育了9份甜糯纯合双隐性玉米材料，引物phi022在亲本间检测出多态性，连续自交4代得到了甜糯双隐性材料。本研究中引物phi061在甜、糯玉米亲本间检测出多态性，以甜、糯玉米自交系为材料，后代的分离相对于品种间杂交较小，在F4代得到了纯合的甜糯双隐性自交系。
目前已有一些关于甜糯双隐性玉米材料品质评价的报道[25]。郝小琴等[25]分析了甜糯双隐性基因玉米材料的农艺性状和可溶性糖含量，发现大部分双隐性材料在授粉后15~30 d可溶性总糖含量高于对应的甜玉米和糯玉米亲本。郝小琴等[26]研究发现双隐性纯合体的可溶性糖含量最高，其次为甜糯玉米杂交种，单隐性纯合体最低。本研究发现甜糯双隐性玉米材料的可溶性糖平均含量高于甜玉米亲本，远高于糯玉米亲本，与前人研究结果一致；淀粉的平均含量低于甜玉米亲本，远低于糯玉米亲本；乳熟期籽粒冠部和背胚部的果皮厚度介于两亲本之间。
甜糯玉米作为一种鲜食玉米类型，营养品质和柔嫩度品质均非常重要，可溶性糖和淀粉是其主要的营养成分，柔嫩度与果皮厚度呈显著负相关[27]。本研究利用sh2基因的表型和wx基因的紧密连锁标记，对甜玉米和糯玉米自交系杂交F2代进行选择并自交选育11个甜糯玉米双隐性材料，并对其品质进行了较为全面的评价。应用分子标记辅助选育甜糯双隐性玉米种质明显缩短了育种周期，减少了田间工作量，对双隐性材料的品质评价以及开展甜糯玉米自交系选育时的亲本选择提供了参考，这对优质甜糯玉米育种有重要的指导意义。
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图 1 PtpA基因的PCR扩增
1：PtpA基因的PCR扩增产物；M：DL2000 DNA marker；2：阴性对照
Figure 1. PCR amplification of the PtpA gene
1: PCR product of PtpA gene; M: DL2000 DNA marker;2: Negative control
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图 2 FLAG-PtpA重组质粒中PtpA基因的PCR扩增
1：阴性对照；M：DL2000 DNA marker；2：PtpA基因的PCR扩增产物
Figure 2. PCR amplification of PtpA gene in FLAG-PtpA recombinant plasmid
1: Negative control; M: DL2000 DNA marker; 2: PCR product of PtpA gene
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图 3 真核表达载体转染293T细胞
A1：293T未转染质粒(白镜)；A2：293T未转染质粒(荧光)；B1：293T转染FLAG-PtpA载体质粒+pEGFP-N1质粒(白镜)；B2：293T转染FLAG-PtpA载体质粒+pEGFP-N1质粒(荧光)
Figure 3. Eukaryotic expression vector transfected 293T cells
A1: 293T untransfected plasmid (white mirror); A2: 293T untransfected plasmid (fluorescent); B1: 293T transfected FLAG-PtpA plasmid and pEGFP-N1 plasmid (white mirror); B2: 293T transfected FLAG-PtpA plasmid and pEGFP-N1 plasmid (fluorescence)
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图 4 HEK293T细胞中FLAG-PtpA表达产物鉴定
M：低相对分子质量蛋白质标准；1:空白对照；2：HEK293T细胞中转染p3×FLAG-CMV-10质粒；3：HEK293T细胞中转染FLAG-PtpA质粒
Figure 4. Identification of FLAG-PtpA expression product in HEK293T cells
M: Low molecular weight protein standard; 1: Blank control; 2: p3×FLAG-CMV-10 plasmid transfected into HEK293T cells; 3: FLAG-PtpA plasmid transfected into HEK293T cells
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图 5 HEK293T表达FLAG-PtpA蛋白特异性分析
M：低相对分子质量蛋白质标准；1：HEK293T表达的FLAG-PtpA蛋白
Figure 5. HEK293T expression FLAG-PtpA protein specificity analysis
M: Low molecular weight protein standard; 1: FLAG-PtpA protein expressed by HEK293T
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图 6 PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活的影响
“*”、“**”和“***”分别表示差异达到0.05、0.01和0.001的显著水平(t检验)
Figure 6. Effect of PtpA protein on activation of NF-κB signaling pathway
“*”, “**” and “***” indicate the difference reaches 0.05, 0.01 and 0.001 significance levels respectively (t test)
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图 7 细胞因子的mRNA表达量
“*”、“**”和“***”分别表示差异达到0.05、0.01和 0.001的显著水平(t检验)
Figure 7. mRNA expression of cell factors
“*”，“**” and “***” indicate the difference reaches 0.05，0.01 and 0.001 significance levels respectively (t test)
表 1 引物名称及序列
Table 1 Primer name and sequence
引物名称
Primer name引物序列(5′→3′)1)
Primer sequence产物大小/bp
Product sizeFLAG-PtpA-F AAGGAAAAAA GCGGCCGCGGTGTCTGATCCGCTGCACG 492 FLAG-PtpA-R CTAG TCTAGATCAACTCGGTCCGTT IL-6-F GGTGTTGCCTGCTGCCTTCC 100 IL-6-R GTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGTC GM-CSF-F TCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGC 100 GM-CSF-R CAGGTCGGCTCCTGGAGGTC BIRC-2-F AGACACATGCAGCTCGAATGAGAAC 100 BIRC-2-R AACACCTCAAGCCACCATCACAAC BIRC-3-F CTGTGATGGTGGACTCAGGTGTTG 100 BIRC-3-R TGGCTTGAACTTGACGGATGAACTC 1) 有下划线的序列为Not I、Xba I酶切位点
1) Sequences with underlines are Not I and Xba I restriction sites
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