套种是指在同一块土地上先种植一种作物，然后再种植另一种作物的种植方式，这种方式有助于充分利用土地资源并提高作物生产力^[1]。研究表明，套种可增加土壤微生物的多样性^[2]，通过调节微生物和土壤酶活性来调节氮、磷和有机质周转，进而减少土壤养分流失并保持稳定的作物产量^[3]。土壤微生物在维持地上地下生命活动和驱动植物生长上有着重要作用^[4]，因微生物通常以植物根系分泌物和凋落物为主要营养来源，而不同的植被组成通过改变凋落物和根系分泌物的数量与质量进而影响土壤碳循环^[5]，导致土壤微生物的结构和功能发生改变^[6]。不同的植物组成会引发不同的种间作用，表现为相互促进或抑制的效应^[1]。这种相互作用通过土壤和微生物的调节活动间接发生^[7-8]，而土壤微生物在养分循环中的作用对于生产力和生物多样性至关重要，因此，深入了解套种模式下植被组成与土壤微生物之间的关系对于实现林分的可持续经营具有重要意义。

微生物群落结构变化不仅表现为物种组成上，也体现在各个分类群之间的相互作用上。微生物通常拥有复杂的生态网络，其相互作用主要有正向的积极作用(如共生)和负向的消极作用(如竞争)^[9]。共现性网络分析已被用来揭示微生物群落内部相互作用^[10]，杉木与闽楠混交后影响了土壤微生物群的共生模式，土壤微生物群落的多样性得以提高、连接得到加强^[11]。甘蔗与大豆套种后促进了固氮菌的富集，形成了更加紧密的根际网络结构^[12]。而在植物多样性较低的生态系统中，土壤微生物网络结构则相对没有那么复杂，这可能跟物种多样性有关^[13]。但植被组成的转变是否改变了微生物网络结构仍需进一步探索。

对于其他林下套种药用植物的研究，如苍术^[14]、三七^[15]和黄精^[16]等，表明林下套种可以为药用植物提供健康的微生物环境，促进其生长。柚木Tectona grandis是较昂贵的热带硬木树种之一，原生于缅甸、泰国、老挝和印度^[17-18]，在我国热带亚热带地区亦有分布，目前关于柚木的研究主要集中于无性系选育^[19-20]、栽培技术^[21-22]和木材材性^[23]等方面。柚木生长周期较长，前期投入需要较长时间才能收回^[24]，因而为了获得短期收入，在其林下套种草豆蔻Alpinia katsumadai 这一南药作物^[25]以实现“以短养长”。但林下套种草豆蔻后对柚木土壤环境尤其是微生物的影响目前尚不明晰。因此本研究以前期柚木与草豆蔻套种林分为研究对象，以未套种林分为对照，开展套种对根际土壤真菌群落结构、多样性和共现性网络影响研究，探明柚木与草豆蔻套种下根际土壤真菌群落结构、功能和网络变化特征，以期从微生物角度为柚木人工林培育和绿色发展提供新的思路。

1.   材料与方法

试验地位于海南尖峰岭中国林业科学研究院热带林业研究所试验站(18°20′—18°57′N，108°41′—109°20′E)，海拔60~100 m，研究地属热带季风气候区，年均气温24.5 ℃，年降水量1650 mm，土壤类型为砖红壤。

1.1   样地设置

以前期1982年营建的柚木无性系人工林为研究对象，株行距为5.0 m×2.5 m。2018年将草豆蔻套种于柚木林下，草豆蔻株行距为1.0 m×1.0 m，详见图1。 2021年12月开始调查试验，柚木与草豆蔻套种林分为套种处理(T)，选择附近未套种的柚木林作为对照组(CK)。套种组和对照组各选择4块样地，每块样地水平距离间隔10 m以上，样地大小为10 m×5 m，研究地基本情况见表1。

图  1  柚木林下套种草豆蔻示意图

Figure  1.  Diagram of intercropping Alpinia katsumadai within a Tectona grandis forest palntation

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表  1  研究样地基本概况

Table  1.  Basic information of the research plot

	坡度/(°) Slope	海拔/m Altitude	树高/m Height	胸径或地径/cm DBH or ground diameter
柚木 Tectona grandis	0	61	12.6	33.5
草豆蔻 Alpinia katsumadai	0	61	2.27	2.03

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1.2   土壤取样

2022年12月，采用S型5点取样法，在每块样地内从一端开始向另一端以“S”型移动，每个点之间间隔相等，对于未套种处理，用工具铲去落叶层，从树干基部挖去上层覆土，沿根系伸展方向，铲除根系生长区外的土壤，去除根系松散土壤后，使用无菌刷从根表刷取根际土，充分混合均匀；柚木套种草豆蔻的处理，于柚木靠近草豆蔻侧同样方法取根际土。每样地取5个点混合为一份样品后用 0.5 mm的无菌不锈钢网筛过筛装入 2 mL微量离心管保存于−80 ℃冰箱，套种组和对照组分别取4个样品，用于真菌群落结构的测定。

1.3   土壤DNA提取和高通量测序

利用 E.Z.N.A. Soil DNA Kit试剂盒(Omega Bio-tek, 美国)从新鲜土壤样品中提取基因组DNA，使用NanoDrop 2000紫外−可见分光光度计(ThermoFisher Scientific, 美国)检测抽提的基因组DNA质量浓度和纯度，土壤DNA样本在−20 ℃储存备后续试验用。利用引物ITS5F (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2R (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增根际土壤真菌ITS基因。在上游和下游引物的 5′末端各添加 8 bp 的 barcode 序列，以区分不同的样本。最后合成带有barcode 序列的通用引物在ABI 9700 PCR热循环仪(Applied Biosystems, 美国)进行PCR扩增，PCR 扩增条件如下：95 ℃预热 5 min；然后在 95 ℃变性 45 s，55 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 45 s，共 28个循环；最后于 72 ℃终止延伸 10 min。PCR 产物使用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小，并用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒(Beckman Coulter, 美国)纯化。扩增子测序使用Illumina MiSeq PE300平台(Illumina, 美国)，测序委托北京奥维森基因科技有限公司进行。

1.4   生物信息学和统计分析

测序数据利用奥维森云平台(http://cloud.allwegene.com/login)分析，利用Trimmomatic对下机原始fastq文件进行质量控制，并利用FLASH(v1.2.7)拼接序列数据，利用UPARSE(v 7.1)软件对纯化后的序列数据进行聚类，并以97%的相似性将其聚类为操作分类单元(Operational taxonomic units, OTU)，使用RDP Classifier (v2.2)对每个OTU代表序列在Sliva数据库的分类进行分析，置信阈值为0.9。Alpha多样性通过Chao1、Shannon、Observed_species 和PD_whole_tree 4个指数来分析样本物种多样性的复杂性，其计算如下：

Chao1：

式中，S_chao1为估计的OTU数，S_obs为观测到的OTU数，n₁为只有一条序列的OTU数，n₂为只有2条序列的OTU数；

Shannon：

式中，P_i为样品中属于第i种的个体的比例；

Observed_species：随测序深度的增加，实际观测到的OTU数。

PD_whole_tree：谱系多样性，是基于系统发育树来计算的一种多样性指数，是用各个样品中OTU的代表序列构建出系统发育树的距离，将某一个样品中的所有代表序列的枝长加和得到的数值。

多样性和相对丰度数据(X)在进行比较前用 lg(X+1)进行标准化转换。采用非度量多维尺度(Non-metric multidimensional scaling, NMDS)分析林药套种下真菌群落之间的关系。利用网络分析方法，对土壤真菌群落中100个最丰富的OTU进行相关性分析，基于Pearson相关分析的共现性网络以强相关(相关系数R>0.6)和显著相关(P<0.01)研究土壤真菌群落的共现格局，并以Gephi交互平台进行网络可视化和网络拓扑参数计算。

2.   结果与分析

2.1   林药套种对根际土壤真菌群落多样性的影响

所有根际土壤样品高通量测序并通过97%相似度水平聚类为1 806个OTU，其中，545个OTU为林药套种处理所独有，作为对照的未套种处理独有509个OTU，其余的752个OTU为套种和未套种处理共有。真菌多样性指数结果见图2，其中，群落丰富度指数(Chao1、Observed_species)和群落多样性指数(PD_whole_tree、Shannon)均表现为套种处理高于未套种，但是差异不显著(P>0.05)，表明林药套种对真菌群落的丰富度和多样性没有显著影响。

图  2  林药套种(T)与未套种(CK)根际土壤真菌多样性指数

Figure  2.  Rhizosphere soil fungal diversity index of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)

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2.2   根际土壤真菌群落组成和结构的变化

由图3可得本研究在门水平共检测出相对丰度大于1%的12门真菌，其中以担子菌门Basidiomycota(37%~56%)和子囊菌门Ascomycota(19%~50%)丰度最高，两者相对丰度合计占比约90%，表明其主要是真菌门，而霉菌门Mortierellomycota、梳霉门Kickxellomycota和壶菌门Chytridiomycota等相对丰度较低。在套种和未套种处理中也以子囊菌门和担子菌门丰度最高，其中，套种处理子囊菌门占比39.37%，担子菌门占比47.28%，而未套种处理中子囊菌门占比37.73%，担子菌门占比53.08%。

图  3  林药套种(T)与未套种(CK)根际土壤物种在门水平的组成

Figure  3.  Rhizosphere soil species composition of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK) at phylum level

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由图4可以看出，担子菌门和子囊菌门2个处理间的丰度表现有所差异，子囊菌门套种处理的相对丰度要高于未套种处理，而担子菌门套种处理的相对丰度则低于未套种处理，但都未有显著性表现(P>0.05)。

图  4  林药套种(T)与未套种(CK)担子菌门和子囊菌门相对丰度归一化指数

Figure  4.  Normalized index of relative abundance of Basidiomycota and Ascomycota of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)

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NMDS分析反映了不同处理间的微生物结构差异，如图5所示，可以得出根际土壤分为2个部分，其群落组成分离明显，表明了不同处理间的根际真菌群落结构存在显著差异。PCA分析结果同样显示套种和未套种处理分离明显，两者微生物构成差异明显，解释了真菌群落总变异的47.23%。

图  5  林药套种(T)与未套种(CK)根际土壤非度量多维尺度法(NMDS) 分析和主成分分析(PCA)

Figure  5.  Nonmetric multidimensional scaling (NMDS) analysis and principal component analysis (PCA) of rhizosphere soil of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)

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LEfSe分析结果见图6，从根际土壤中共检测出87种生物标志物，其中套种处理中有57个类群，富集最多的是子囊菌门爪甲团囊菌目的科(Onygenales fam Incertae sedis)，子囊菌门在纤维素等有机物分解上具有高效率；而未套种处理中生物标志物相对少于套种处理，一共有30种类群富集，以担子菌门小皮伞属下的Marasmius sp.种更为丰富，担子菌门分泌的酶可以有效地水解木质素，而木质素在森林生态系统中更易获得。

图  6  林药套种(T)与未套种(CK)根际土壤线性判别(LEfSe)分析

Figure  6.  Linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis of rhizosphere soil of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)

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2.3   林药套种下土壤真菌群落共现网络分析

图7为基于斯皮尔曼相关分析的根际土壤真菌共现性网络分析，其拓扑属性值如表2所示。结果(图7)表明，柚木林下套种草豆蔻改变了真菌群落之间的相互作用，未套种处理中的高连接点枢纽属于担子菌门，而套种处理的土壤样品中子囊菌门是响应的中心类群。

图  7  林药套种(T)和未套种(CK)根际土壤真菌在门水平的共现性网络分析

Figure  7.  Network analysis of rhizosphere soil fungi co-occurrence for forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK) at phylum level

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表  2  林药套种(T)和未套种(CK)根际土壤真菌共现网络拓扑结构特征

Table  2.  Topological characteristics of fungal co-occurrence networks in rhizosphere soil of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)

处理 Treatment	边 Edge	节点 Note	正向边比例/% Positive edge proportion	负向边比例/% Negative edge proportion	平均度 Average degree	图密度 Graph density	模块化 Modularity
T	367	192	69.88	30.12	3.904	0.021	1.336
CK	332	188	48.77	51.23	3.458	0.018	0.830

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由表2可知，共现性网络图中未套种处理和套种处理分别有332和367条边，连接的节点有188和192个，相对未套种处理，林药套种处理的正向边比例增加，负向边比例减少，平均度和图密度都优于未套种，模块化程度也高于未套种，说明柚木套种草豆蔻增加了真菌群落复杂性。

3.   讨论与结论

林下套种对土壤微生物会产生重要影响，针对柚木套种草豆蔻后土壤真菌群落的变化特征，本研究开展了真菌群落结构和共现性网络结构分析研究，以探究林药套种下土壤真菌群落的影响规律。

3.1   林药套种对土壤真菌群落结构的影响

在本研究中，套种处理和未套种处理的土壤主要真菌门相对丰度值与土壤真菌多样性指数(Chao1、Observed_species、PD_whole_tree和Shannon)均无显著差异。Chen等^[26]在对云杉林下套种五味子的研究也发现微生物多样性差异不显著的现象，Li等^[27]在对不同套种模式的小麦的研究中指出，土壤Alpha多样性并未受到显著影响。这一现象可能的解释是一方面物种丰度受环境影响较物种组成相对偏弱，影响通常可能发生在个别类群中，而不是整个群落^[27]，同时群落结构的变化并非一定会造成物种多样性的改变，因为不同真菌类群的变化会产生补偿效应，某些类群发生变化后可能会被其他类群的变化相补偿^[11]。另外一种原因可能是森林生态系统为土壤微生物提供了多样化的碳源，导致微生物群落的Alpha多样性与植被组成的相关性较低，因而同一地区不同森林类型之间通常没有显著差异^[28-29]。

在本研究中，NMDS和PCA分析发现柚木套种草豆蔻的林分相对于未套种林分土壤真菌群落结构有显著差异，且LEfSe分析中套种林分和未套种林分的真菌群落类别富集程度也不相同。可能的原因是，一方面套种增加了植物多样性从而产生更多的凋落物，导致更多的营养元素释放到土壤中，通过参与养分循环改变微生物结构^[30]。另一方面，植物会通过根系分泌物影响土壤环境，而林下套种改变了原有的根系分泌物种类，这些分泌物释放到根际土壤中也会对微生物群落产生影响^[31-32]。值得注意的是在本研究中柚木套种草豆蔻提升了子囊菌门的富集，先前类似的研究证实子囊菌门在分解纤维素上有着更出色的表现^[11]，这一改变可能是由于相对柚木纯林套种增加了凋落物的输入，使得子囊菌门在套种处理后更加丰富，也间接印证了上述理论分析。

3.2   林药套种对土壤真菌网络结构的影响

除了改变群落结构外，套种对真菌共现网络格局也有影响，节点间的联系是微生物共现网络的重要特征^[33]，本研究中发现套种处理根际土壤网络拥有更多的正向边比例，而未套种处理则负向边比例较高。Ding等^[11]在对杉木纯林引入闽楠的林下套种研究中也发现森林类型转换增加了微生物网络正向边比例，而杉木纯林则拥有更多的负向链接。Faust等^[34]认为节点间积极联系可归因于微生物类群间潜在的生态位重叠，微生物网络之间关系更为紧密和聚集，也意味着微生物类群间的潜在合作可能，这有利于高效率的资源利用；而消极联系则反映了微生物群落内部存在竞争，微生物类群可能在争夺有限的资源。因此，本研究中套种土壤网络正向边比例提升表明套种有利于真菌类群之间的潜在合作，有助于高效利用林地土壤养分资源。

本研究中套种处理的土壤真菌网络平均度、图密度和模块化程度皆高于未套种处理，表明套种增加了根际土壤真菌网络的复杂性。Mougi等^[35]认为高度连接的网络可能会提高微生物群落之间的相互作用，从而提供更多的功能冗余，提高应对环境干扰的能力^[36]。在生产中这一现象可能有利于提升柚木对环境变化的抵抗力，这在柚木的生产实践上具有重要的指导意义。另外之前一项关于根际微生物的研究表明，微生物网络复杂性的增加与多样性的增加相关^[37]，而我们的研究中套种处理与对照之间的真菌多样性并无显著差异，这可能与树种选择有关。

在本研究中，套种林分和未套种的土壤真菌网络中的重点类群是不同的，套种处理的中心类群为子囊菌门，而未套种处理为担子菌门。以往关于微生物功能的研究指出，担子菌门在水解木质素方面更加高效，而子囊菌门通常使用相对容易分解的有机物，因而在凋落物分解的早期阶段起着重要作用。这可能意味着柚木套种草豆蔻根际土壤真菌群落内物种相互作用发生了重新调整^[38]，套种处理可能由于草豆蔻的生长带来凋落物的增加，进而促进了子囊菌门的富集。进一步了解套种影响下微生物共生网络之间的关系对于柚木经营管理至关重要。

3.3   结论

柚木林下套种草豆蔻与未套种处理相比，未显著改变根际土壤真菌群落的多样性，但引起了群落结构和组成的变化。子囊菌门和担子菌门是主要的真菌门，分别在套种处理和未套种处理中发挥着重要的作用，并且是其中心响应类群。套种处理下根际土壤真菌网络结构更为复杂，节点间的连接更加紧密。研究结果可为柚木人工林经营和管理提供科学依据，从土壤微生物角度设计更合理的套种措施进而富集更多有益微生物，从而有利于林分生产力的提升。