Cloning of porcine LPAR3 gene and its expression in endometrial cells
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摘要:目的
获得猪LPAR3基因完整mRNA及基因结构，研究其启动子活性；探究LPAR3基因在子宫内膜的转录调控及可能影响母猪产仔的机制。
方法应用5'RACE和3'RACE技术获取LPAR3基因完整mRNA序列；预测5'调控区潜在的启动子转录因子结合位点及CpG岛，构建不同长度的启动子双荧光素酶报告基因重组载体，与pRL-TK质粒共同转染至猪子宫内膜细胞，检测启动子活性；应用RT-qPCR比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的相对表达量；应用亚硫酸氢钠修饰后测序比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的甲基化状态。
结果猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp，其中5'UTR和3'UTR的长度分别为202和860 bp，CDS区为1 065 bp。克隆获得包括LPAR3转录起始位点上游3 080 bp (–2 430/+650 bp)的5'调控序列，分析预测显示该调控区不存在TATA box，存在GC元件、CPBP及糖皮质激素受体IR3等调控因子结合位点，且在–190/–84和–44/+651 bp处存在2个潜在CpG岛。成功构建9个不同长度的5'缺失报告重组载体并转染猪子宫内膜细胞。双荧光素酶活性检测结果显示，启动子P4(+454/+80 bp)的转录活性最高，其次是P6(–123/+80 bp)。RT-qPCR结果显示，妊娠第12天二花脸猪LPAR3基因在子宫内膜的表达量高于在其他组织的表达量，且极显著高于在妊娠第12天长大二元猪子宫内膜的表达量，LPAR3在2个猪种子宫内膜均处于低甲基化状态且差异不显著。
结论猪LPAR3mRNA全长为2 127 bp，妊娠第12天LAPR3基因在二花脸猪子宫内膜表达高于其在长大二元猪子宫内膜的表达，显示LPAR3可能参与了猪早期妊娠并影响产仔数。
Abstract:ObjectiveTo obtain the complete mRNA sequence and structure of porcine LPAR3gene, study the gene promoter activity, and explore the transcriptional regulation of LPAR3 gene in endometrium and the mechanisms which may affect sow farrowing.
MethodThe 5'RACE and 3'RACE techniques were used to obtain the complete LPAR3mRNA sequence. The potential promoter transcription factor binding sites and CpG islands in the 5' regulatory region were predicted. Recombinant vectors with different length of promoters and dual-luciferase reporter gene were constructed, then were transfected with pRL-TK plasmid into pig endometrial cells, and the promoter activities were detected. RT-qPCR was used to compare the relative expression of LPAR3 gene in Erhualian(ER) and Landrace×Large White (LL) pigs on the 12th day of gestation. Sodium bisulfite modified sequencing was used to compare the methylation status of LPAR3 gene in endometrial tissues of ER and LL pigs on the 12th day of gestation.
ResultThe full length of pigLPAR3 mRNA was 2 127 bp, the 5'UTR and 3'UTR were 202 and 860 bp respectively, and the CDS region was 1 065 bp. The 5' regulatory sequence, including 3 080 bp (–2 430/+650 bp) upstream of the LPAR3gene, was cloned. The online prediction results of the 5' regulatory region showed that there was no TATA box in the LPAR3promoter, but there were GC element and binding sites for CPBP and other regulatory factors. Two potential CpG islands were found at –190/–84 and –44/+651 bp. Nine recombinant vectors with 5' deletions of the promoter were constructed and transfected into pig endometrium cells. The dual-luciferase assay showed that the activity of promoter P4 (+454/+80 bp) was the highest, followed by P6 (–123/+80 bp). RT-qPCR results showed that the expression of LPAR3 gene in the endometrium of ER pigs on the 12th day of gestation was higher than that in other tissues, and it was extremely significantly higher than that in the endometrium of LL pigs on the 12th day of gestation. The methylation status of LPAR3 gene was low in the endometrium of two breeds and had no significant difference between two breeds.
ConclusionThe full length of pigLPAR3mRNA is 2 127 bp. The endometrial expression level of LAPR3 gene in ER pigs is higher than that in LL pigs on the 12th day of gestation, indicating that LPAR3 gene may be involved in early gestation of pigs and affects litter size.
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Keywords:
- pig /
- LPAR3 gene /
- promoter /
- endometrium /
- gestation /
- methylation
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双季稻两熟制是保障广东省粮食安全的最重要种植制度，2022年全省双季稻面积和产量分别占粮食作物总量的82.3%和85.8%[1]。由于常住人口数量多，全省口粮自给率和食用油自给率分别为60%和20%左右[2-3]，提高粮油产能是保障全省粮油安全和经济社会高质量发展的迫切需求。油菜是唯一适合冬季种植的油料作物，可以利用冬闲田种植，不与双季稻争地；同时，油菜生长过程可以优化土壤结构、增加土壤养分、培肥土壤地力、提高周年光温资源利用率，具有用地养地的特征优势，长期冬种油菜可实现土壤有机质、全氮、有效磷、速效钾含量年均增幅分别达到1.2%、0.7%、3.0%和4.0%[4-5]。因此，建立“稻稻油”模式并进行大面积应用对实现粮油兼丰和乡村振兴具有重要战略意义。
广东省“稻稻油”模式的应用由来已久[6]。2022年广东油菜播种面积为5.07×103 hm2[1]，而冬闲超过100 d的耕地有3×105~3.74×105 hm2[7]，利用冬闲田种植油菜潜力巨大。由于广东在冬油菜品种评价、筛选方面的研究较为缺乏，导致目前生产上引进外省油菜品种多，且大多不能与当地水稻生产实际匹配，三熟制轮作冬油菜与早稻茬口矛盾突出，冬油菜尚未成熟就需腾田，无法收获菜籽。因此，评价、筛选适宜广东“稻稻油”轮作的冬油菜品种是实现粮油兼丰的关键。
根据广东省最新稻作区划分，与水稻安全生育期相匹配的冬种作物的全生育期为130~155 d[8]。在2018—2023年中国种业大数据平台中，广东登记的油菜品种有8个，‘粤油28’生育期最短，为155 d[9]，基本满足粤北与山地种植区三熟轮作的生育期需求，但在生产上其产量和品质表现并不清楚。前人于2006—2008年在广东湛江开展了甘蓝型冬油菜Brassica napus L.的评价、筛选，甘蓝型冬油菜生育期158~173 d，产量可达1 238~1 951 kg·hm−2，明确了华南生态气候适宜种植甘蓝型油菜[10]，但筛选品种的生育期与该区域双季稻生产存在茬口矛盾。虽然前人在三熟制油菜品种评价、筛选方面开展了大量工作，但多集中在长江流域各生态区[11-13]，尽管也在广西桂林开展了评价[14]，但品种筛选试验的播期和油菜品种的生育期等大多与广东各稻作区的茬口衔接时间和耕地冬闲天数不匹配，而且油菜生长易受光、温、降水等环境因素影响[15-16]。油菜品种选育不断取得突破，生育期逐年缩短，产量稳步提升，含油量不断提高[17-18]。针对广东省气候资源特点，评价、筛选出适合本省“稻稻油”三熟制的早熟高产油菜新品种，一方面可以丰富不同稻作区早熟油菜品种选择，扩大冬油菜生产，另一方面可确保周年顺利接茬，实现粮油周年高产。
本研究根据广东省双季稻的晚稻和再生稻收获期，引进短生育期甘蓝型冬油菜新品种25个，明确广东冬闲稻田种植条件下油菜生育期、产量、品质等性状特征及其与主要气象因子的关系，为广东省三熟制早熟高产油菜新品种的引种提供数据参考，也为广东不同区域扩大冬种油菜面积和提升产量提供用种依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
25个早熟甘蓝型冬油菜品种分别为1：‘中油925’、2：‘中油298’、3：‘中油107’、4：‘中油995’、5：‘中油112’、6：‘中油916’、7：‘中油295早’、8：‘中油988’、9：‘希望226’、10：‘希望599’、11：‘希望799’、12：‘希望299’、13：‘希望759’、14：‘希望2191’、15：‘大地95’、16：‘希望422’、17：‘湘油420’、18：‘湘油168’、19：‘中油早1号’、20：‘湘油078’、21：‘湘油228’、22：‘湘油608’、23：‘湘油656’、24：‘阳光131’、25：‘希望990’；其中，1~16、19、24~25来自中国农业科学院油料作物研究所，17~18、20~23来自湖南农业大学；7、13、15~18、20~23、25为常规种，其余14个为杂交种。
1.2 大田试验
1.2.1 试验设计
试验于2023—2024年在广东省农业科学院大丰试验基地(23°08'N、113°20'E)进行。土壤pH 5.66、有机质27.11 g·kg−1、全氮1.23 g·kg−1、全磷0.71 g·kg−1、全钾15.18 g·kg−1、碱解氮104.59 mg·kg−1、有效磷18.83 mg·kg−1、速效钾107.98 mg·kg−1、有效硼0.21 mg·kg−1。试验地块平整且灌排便利。10月27日播种，播种量8.0 kg·hm−2，条播，行距33 cm，每个品种3次重复，随机区组排列，共75个小区，小区面积6 m2 (2 m×3 m)， 于三叶期间苗，补苗，统一密度为每公顷45万株。
1.2.2 肥料管理
总施肥量分别为N150.0 kg·hm−2、P2O5 60.0 kg·hm−2 、K2O 75.0 kg·hm−2、B2O3 2.25 kg·hm−2。氮肥为尿素(N质量分数为46%)，磷肥是过磷酸钙(P2O5质量分数为12%)，钾肥为氯化钾(K2O质量分数为60%)，硼肥为硼砂(B2O3质量分数为15%)。肥料分2次施用，第1次为基肥，施用70%(w)的氮肥、80%(w)的钾肥和全部的磷、硼肥；剩余的氮、钾肥在播种2个月后统一追施。
1.2.3 病虫草害防治
播种覆土后用乙草胺进行杂草防治。按照品种生育期进行病虫害防治：苗期用高效氯氟氰菊酯喷雾防治蚜虫、菜青虫，用虫螨腈防治黄曲条跳甲；初花期及初花期后1周用多菌灵防治菌核病；终花后15 d用高效氯氟氰菊酯喷雾防治蚜虫、菜青虫。
1.2.4 生育期调查
生育期记载标准参照油菜品种区域试验品种考查项目统一调查记载标准和娄洪祥等[19]的方法。分别记录播种期、初花期(小区有25%植株开始开花)、盛花期(小区有75%以上花序已经开花)、终花期(小区有75%以上花序完全谢花)和成熟期(小区75%以上角果转黄色，且种子呈成熟色泽)。
1.2.5 成熟期考种与测产
各小区选取长势均匀的区域连续取样10株，测定株高、一次分枝数、分枝高度、单株有效角果数及每角粒数等指标。在每株主轴和上、中、下部的分枝花序上，随机摘20个有效角果，统计每角果饱满种子数，计算每角粒数。避开边行每小区实收2 m2，晒干后脱粒称质量，作为实收产量。将晒干后的油菜籽[含水量不高于10%(w)]去杂后，用四分法取样4份，用数粒板计数1 000粒并称质量，计算4份样品的平均值，即为千粒质量。
1.2.6 油菜籽品质测定
采用近红外光谱仪(Foss，NIRsystem 5000)测定油分、蛋白质、油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、芥酸、硫代葡萄糖苷含量等品质指标[20]。
1.3 气象数据
气象数据来源于田间小型气象站(Onset Hobo U30自动气象站)，记录的气象因子数据包括每15 min的最高温、最低温、平均温度、空气湿度、降雨量、光合有效辐射等，并通过公式(1)计算油菜生育期内≥0 ℃积温(AT0)。
$$ {\text{AT}}_0 = \displaystyle\sum\limits_{{{i}} = {\text{1}}}^{{n}} {{{({{T}}_{{i}} - 0)}}} \text{，} $$ (1) 式中，Ti为第i天平均气温，若Ti<0，则Ti−0以0计算；n为油菜生育期天数。
在冬油菜大田生长期(2023年10月27日至2024年3月26日)，平均气温先降低后升高：2023年10月至2024年1月，由25.0 ℃降至15.9 ℃；2024年1月后，由15.9 ℃升至20.1 ℃。降雨量变化趋势与平均温度相似：2023年11月和2024年3月累计降雨量较高。昼夜温差先升高后降低：2023年10月至2023年11月，由7.7 ℃升高到10.5 ℃；2023年12月至2024年3月，由9.5 ℃降至7.0 ℃。光合有效辐射逐月下降，2023年10月至2024年3月由437.3 µmol·m−2·s−1降至310.3 µmol·m−2·s−1。月平均空气相对湿度为72.6%~80.4%。
1.4 数据分析
利用SPSS 27数据分析软件对25份甘蓝型冬油菜品种的农艺性状、产量数据进行整理，计算最大值、最小值、平均值、标准差，进行Pearson相关性分析；采用方差分析法进行差异显著性检验；采用系统聚类分析模块进行聚类分析。
2. 结果与分析
2.1 不同油菜品种生育进程
据供试品种的生育期调查数据显示，‘湘油656’最长，为151 d，‘希望990’最短，为136 d，两者相差15 d。“稻稻油”模式中冬种作物生育期约130~155 d，按照生育期每增加5 d分为1类的标准，参试品种中，全生育期136~140 d的品种有‘湘油420’‘希望990’；141~145 d的品种有‘中油107’‘中油925’‘中油988’‘希望226’和‘希望759’；其余18个品种(‘中油298’‘中油995’‘中油112’‘中油916’‘中油295早’‘希望599’‘希望799’‘希望299’‘希望2191’‘大地95’‘希望422’‘湘油168’‘中油早1号’‘湘油078’‘湘油228’‘湘油608’‘湘油656’‘阳光131’)全生育期都在145 d以上。本试验条件下，所有参试品种均能够在2024年3月31日前成熟。
不同油菜品种各生育期持续时间如表1所示。总体上，播种期至初花期持续时间最长，平均88.0 d，最短和最长相差35.0 d；初花期至盛花期持续时间最短，平均7.2 d，该阶段品种间变异系数最大，为39.8%；盛花期至终花期平均21.1 d，最大相差18.0 d。
表 1 早熟冬油菜品种不同生育期持续时间及所需有效积温Table 1. Duration time and effective accumulated temperature in various growth stages of early-maturing winter rape varieties时期1)
Stage持续时间
Duration time有效积温
Effective accumulated temperature变异幅度/d
Variation range均值/d
Mean变异系数/%
Coefficient of variation变异幅度/℃
Variation range均值/℃
Mean变异系数/%
Coefficient of variationA 62.0~97.0 88.0 8.9 1195.5 ~1 765.91 648.4 7.4 B 3.0~12.0 7.2 39.8 48.8~182.1 98.3 38.8 C 17.0~35.0 21.1 18.5 288.1~549.1 360.3 17.3 D 30.0~30.0 30.0 511.4~552.7 525.3 1.3 合计 Total 136.0~151.0 146.2 2.6 2 394.4~2 746.4 2 632.2 3.2 1) A：播种至初花，B：初花至盛花，C：盛花至终花，D：终花至成熟。
1) A: From sowing to initial flowering, B: From initial flowering to full flowering, C: From full flowering to final flowering, D: From final flowering to maturity.从各个生育期所需有效积温(表1)来看，播种期至初花期最大，平均1 648.4 ℃；初花期至盛花期有效积温最少，平均98.3 ℃，变异系数最大，为38.8%；盛花期至终花期平均有效积温360.3 ℃，变异系数17.3%；终花期至成熟期平均有效积温525.3 ℃。
2.2 不同油菜品种的产量及其构成因素
不同品种株高、分枝高度、一次分枝数、单株有效角果数、每角粒数、千粒质量、日产量、产量等均表现出一定差异(表2)，其中变异系数从大到小依次为一次分枝数>单株有效角果数>日产量>产量>分枝高度>每角粒数>千粒质量>株高。一次分枝数、单株有效角果数、每角粒数、千粒质量大的品种，产量相对较高。‘中油925’‘中油107’‘中油916’‘中油988’‘希望226’‘希望599’‘希望799’‘希望422’‘湘油420’‘湘油168’‘阳光131’11个品种的产量均在1 900 kg·hm−2以上；‘中油298’‘中油995’‘中油112’‘中油295早’‘希望
2191 ’‘大地95’‘中油早1号’‘湘油078’‘湘油228’‘湘油608’10个品种的产量为1 600~1 800 kg·hm−2；‘希望299’‘希望759’‘湘油656’‘希望990’4个品种的产量为1 200~<1 600 kg·hm−2。表 2 不同早熟冬油菜品种农艺性状比较1)Table 2. Comparison of agronomic traits in all early-maturing winter rape varieties品种
Variety株高/cm
Plant
height分枝高
度/cm
Branch
height一次分枝数
Number of
primary
branches单株有效
角果数
Effective pods
per plant每角
粒数
Seeds per
pod千粒质
量/g1 000 -seed
weight日产量
(kg·hm−2)
Daily
yield产量 Yield 性状值/
(kg·hm−2)
Trait value排名
Ranking1 184.5ab 122.0ab 3.6c-h 116.5b-g 19.4f 3.3g-j 14.0a-d 1 986.0a-c 10 2 180.8a-c 84.5d-f 1.9m 83.2hi 19.4f 3.3f-j 11.9a-f 1 744.7a-e 15 3 185.2ab 121.9ab 4.6ab 134.7b 23.4bc 3.3f-j 14.4a-d 2 068.5a-c 7 4 176.2b-f 96.7b-f 3.4e-i 105.5d-h 21.8c-f 3.5e-g 11.1c-f 1 645.7b-e 20 5 171.0d-g 106.6a-e 4.5a-c 129.3bc 21.2c-f 3.2h-k 11.6b-f 1 728.5b-e 17 6 173.6c-f 102.3a-f 2.5k-m 80.9i 22.8b-e 3.7b-d 15.5a 2 288.1a 1 7 184.1ab 113.0a-c 3.7b-g 128.1b-d 20.5d-f 3.0k 11.0d-f 1 638.4b-e 21 8 178.3a-e 99.5b-f 3.7c-h 124.9b-e 22.7b-e 3.5d-f 15.0ab 2 161.8ab 3 9 170.6e-g 81.6ef 2.5j-m 96.8f-i 25.0b 3.4e-h 14.9ab 2 117.3a-c 4 10 178.5a-e 96.1b-f 3.1f-k 115.4b-g — 3.9b 13.5a-e 1 990.7a-c 8 11 186.4a 126.1a 4.3a-d 130.2bc 20.3ef 3.6c-e 13.3a-e 1 972.9a-d 11 12 180.0a-c 108.1a-d 3.9a-f 117.9b-f 20.3ef 3.5e-g 8.6f 1 279.0e 25 13 159.5hi 101.6a-f 3.6c-h 102.8e-i 15.9g 3.4e-g 10.1ef 1 429.1de 23 14 179.7a-d 117.9ab 4.1a-e 130.5bc 15.9g 4.2a 12.0a-f 1 746.2a-e 14 15 176.8b-f 111.7a-c 3.9a-f 124.5b-e 19.0f 3.4f-i 11.5b-f 1 703.9b-e 18 16 176.4b-f 116.0a-c 4.3a-d 114.6b-g 27.5a 2.6i 14.2a-d 2 099.7a-c 6 17 150.8jk 78.2f 3.7c-h 116.9b-g 20.0ef 3.4e-h 15.4a 2 111.1a-c 5 18 149.5k 84.5d-f 3.6d-h 109.3c-g 23.3b-d 3.2h-k 14.8a-c 2 193.4ab 2 19 158.5h-j 97.3b-f 3.3e-j 94.6f-i 20.7c-f 3.2i-k 11.3b-f 1 679.7b-e 19 20 147.3k 77.2f 4.6ab 134.4b 20.2ef 3.1jk 11.7a-f 1 744.5a-e 16 21 151.9i-k 91.7c-f 2.8h-l 94.9f-i 19.0f 3.7bc 12.0a-f 1 792.2a-e 12 22 152.7i-k 83.1d-f 2.3lm 100.7f-i 21.6c-f 3.3g-j 12.2a-f 1 788.5a-e 13 23 163.0gh 99.9b-f 2.7i-m 101.0f-i 20.5d-f 3.2h-k 8.8f 1 329.7e 24 24 168.6fg 104.6a-e 4.7a 163.1a 22.6b-e 2.5m 13.3a-e 1 987.5a-c 9 25 153.0i-k 84.8d-f 2.9g-l 93.5g-i 15.1g 4.1a 11.6b-f 1 574.9c-e 22 均值 Mean 169.5±12.9 100.3±14.6 3.5±0.8 113.8±18.9 20.8±2.8 3.4±0.4 12.5±1.9 1 832.1 ±271.0CV/% 7.6 14.5 22.1 16.6 13.5 11.2 15.4 14.8 1)“—”表示数据未获得；CV表示变异系数；同列数据后的不同小写字母表示品种间差异显著(P<0.05，LSD法)。
1) “—” means that data are not obtained; CV stands for coefficient of variation; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among varieties (P<0.05, LSD method).2.3 油菜产量、产量构成因子及生育期间的相关性
产量与每角粒数呈极显著正相关，与单株有效角果数、千粒质量无显著相关性(表3)；说明短生育期油菜品种在广东种植，每角粒数的多少直接决定产量高低。每角粒数与千粒质量呈极显著负相关，生育期与产量无显著相关性(表3)。
表 3 早熟冬油菜品种产量、产量构成因子及生育期间的相关性1)Table 3. Correlation among yield, yield component and growth duration of early-maturing winter rape varieties性状
Trait产量
Yield单株有效角果数
Effective pods per plant每角粒数
Seeds per pod千粒质量 1000 -seed weight生育期
Growth duration产量 Yield 1.00 单株有效角果数 Effective pods per plant 0.10 1.00 每角粒数 Seeds per pod 0.58** 0.10 1.00 千粒质量 1000 -seed weight−0.11 −0.40 −0.63** 1.00 生育期 Growth duration −0.19 0.20 0.31 −0.38 1.00 1)“**”表示在P<0.01水平显著相关(Pearson法)。
1) “**” indicates significant correlation at P<0.01 level (Pearson method).2.4 基于产量和生育期的油菜品种聚类分析
以产量和生育期为聚类指标，将25个参试品种聚为4个类群(表4)。其中第I类为高产长生育期类型，仅包含‘中油916’；第II类为高产短生育期类型，包含10个品种，分别是‘希望599’‘阳光131’‘中油925’‘希望799’‘中油988’‘湘油168’‘希望226’‘湘油420’‘希望422’‘中油107’；第III类属于中产长生育期类型，包含11个品种，分别是‘中油298’‘中油995’‘中油112’‘中油295早’‘希望
2191 ’‘大地95’‘中油早1号’‘湘油078’‘湘油228’‘湘油608’‘希望990’；第IV类属于低产长生育期类型，包含3个品种，分别是‘希望299’‘湘油656’‘希望759’。表 4 各类群早熟冬油菜品种产量、生育期、含油量特征Table 4. Yield, growth duration and oil content characters in various clustering groups of early-maturing winter rape varieties分类1)
Cluster产量 Yield 生育期 Growth duration 含油量(w) Oil content 变异幅度/
(kg·hm−2)
Variation range均值/
(kg·hm−2)
Mean变异系数/%
Variation
coefficient变异幅度/d
Variation
range均值/d
Mean变异系数/%
Variation
coefficient变异幅度/%
Variation
range均值/%
Mean变异系数/%
Variation
coefficientI 2 288.1 148.0 48.0 II 1 972.9~2 193.4 2 068.9 3.9 137.0~149.0 144.9 2.6 40.8~48.4 45.5 5.2 Ⅲ 1 574.9~1 792.2 1 707.9 3.9 136.0~149.0 147.0 2.6 40.4~48.2 43.6 5.3 IV 1 279.0~1 429.1 1 345.9 5.7 142.0~151.0 147.3 3.2 40.8~45.6 43.3 5.6 合计 Total 1 279.0~2 288.1 1 832.0 14.8 136.0~151.0 146.2 2.6 40.4~48.4 44.5 5.6 1) I：高产长生育期，II：高产短生育期，Ⅲ：中产长生育期，IV：低产长生育期。
1) I: High-yield and long-growth duration, II: High-yield and short-growth duration, Ⅲ: Middle-yield and long-growth duration, IV: Low-yield and long-growth duration.2.5 不同油菜品种的品质
不同油菜品种的品质如表5所示。各品种平均含油量(w)为44.5%，变幅为40.4%~48.4%；含油量最高品种为‘希望226’，最低品种为‘湘油228’。蛋白质含量(w)变幅为19.2%~25.4%，平均22.4%；蛋白质含量最高品种为‘湘油656’，最低品种为‘中油925’。油酸含量(w)变幅为19.6%~73.3%，平均58.5%；油酸含量最高品种为‘希望422’，最低品种为‘湘油078’。亚油酸含量(w)变幅为11.9%~24.8%，平均21.2%；亚油酸含量最高品种为‘湘油228’，最低品种为‘希望422’。亚麻酸含量(w)变幅为4.9%~12.4%，平均10.2%；亚麻酸含量最高品种为‘大地95’，最低品种为‘希望422’。棕榈酸含量(w)变幅为3.3%~4.3%，平均3.9%；棕榈酸含量最高品种为‘中油298’‘湘油656’，最低品种为‘希望226’‘湘油078’。除‘希望226’‘希望422’‘湘油078’‘阳光131’以外，其他品种的品质都符合双低油菜标准。
表 5 不同早熟冬油菜品种品质指标比较1)Table 5. Comparison of quality characters among all early-maturing winter rape varieties品种
Varietyw/% b(硫代葡萄糖苷)/
(μmol·g−1)
Glucosinolate
content油分
Oil蛋白质
Protein油酸
Oleic acid亚油酸
Linoleic acid亚麻酸
Linolenic acid棕榈酸
Palmitic acid芥酸
Erucic acid1 46.1b-e 19.2l 61.2c-f 21.9d-h 10.6d-f 4.0de 0.1d 27.3c-i 2 43.3f-i 22.4d-g 58.9fg 23.3bc 10.4e-g 4.3a 0.1d 25.1e-j 3 45.3d-f 21.0h-j 61.0c-g 22.0d-h 10.6d-f 4.0de 0d 25.9d-j 4 41.4i-k 24.0bc 60.9c-g 22.8b-e 10.7de 4.2a-d 0d 27.0c-i 5 42.0h-k 22.6c-g 62.5cd 21.1gh 9.9gh 4.0ef 0.3d 29.8c-e 6 48.0ab 19.6kl 60.9c-g 18.7i 9.4i 3.6ij 0.2d 29.4c-f 7 42.4h-k 22.8c-g 59.1fg 23.6b 11.5b 4.1b-e 0d 27.0c-i 8 45.7c-e 21.8f-i 59.2e-g 22.1d-g 10.6d-f 3.9ef 0.3d 29.8c-e 9 48.4a 21.4g-j 65.7b 16.2k 7.4k 3.3k 3.5c 30.2cd 10 45.8c-e 22.6c-g 60.4c-g 21.8e-h 10.7de 4.0de 0.3d 23.1ij 11 47.2a-d 21.8f-i 58.7fg 21.0h 10.3e-h 3.7hi 0.2d 21.7j 12 43.5f-h 22.3d-h 60.5c-g 21.3f-h 10.0gh 3.8gh 0.2d 26.5c-i 13 45.6c-e 20.3j-l 62.1c-e 21.4f-h 10.7de 3.8fg 0.1d 28.7c-g 14 44.9e-g 23.5cd 62.2cd 22.4c-f 9.8hi 4.0de 0.4d 27.2c-i 15 43.0g-i 23.3c-e 45.1j 22.5c-e 12.4a 4.0de 0.2d 23.3ij 16 47.7a-c 22.1e-i 73.3a 11.9l 4.9l 3.5ij 5.1b 23.5h-j 17 42.1h-k 22.6c-g 62.2cd 22.9b-d 10.3e-h 4.2ab 0.1d 28.5c-h 18 45.7c-e 23.0c-f 62.6c 19.0i 8.5j 3.5j 0.4d 30.9c 19 46.4a-e 20.7i-k 55.3h 22.2d-g 11.0cd 4.1c-e 0.1d 24.8f-j 20 48.2a 22.9c-f 19.6k 17.1j 10.6d-f 3.3k 40.9a 38.1b 21 40.4k 25.0ab 58.1g 24.8a 12.0a 4.2ab 0d 24.2g-j 22 42.6h-j 25.0ab 60.0c-g 23.6b 11.0cd 4.2a-c 0.2d 25.7d-j 23 40.9jk 25.4a 59.6d-g 23.5b 11.4bc 4.3a 0.2d 27.4c-i 24 40.8jk 23.3c-e 50.6i 21.7e-h 11.1b-d 3.9ef 5.7b 45.7a 25 45.1d-f 21.7f-i 62.2cd 21.3f-h 10.1f-h 4.0de 0.3d 28.0c-i 均值 Mean 44.5±2.5 22.4±1.6 58.5±9.5 21.2±2.8 10.2±1.5 3.9±0.3 2.3±8.2 28.0±5.0 CV/% 5.6 7.0 16.2 13.1 14.7 7.4 348.5 17.8 1) CV表示变异系数；同列数据后的不同小写字母表示品种间差异显著(P<0.05，LSD法)。
1) CV represents coefficient of variation; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among varieties (P<0.05, LSD method).2.6 油菜主要农艺性状与主要气象因子的相关性
产量分别与播种期至初花期的平均温度和光合有效辐射呈极显著正相关，与降雨量呈极显著负相关；与初花期至盛花期的平均温度呈极显著负相关；与初花期至盛花期的光合有效辐射以及终花期至成熟期的平均温度呈显著负相关。每角粒数与初花期至盛花期的平均温度呈显著负相关，与光合有效辐射呈极显著负相关。千粒质量与盛花期至终花期的平均温度呈显著负相关。单株有效角果数与全生育期的气象因子均没有显著相关性。各生育期持续时间分别与各生育期平均温度和光合有效辐射呈负相关，与各生育期降雨量呈极显著正相关(表6)。
表 6 早熟冬油菜品种农艺性状与气象因子的相关性1)Table 6. Correlation between agronomic traits of early-maturing winter rape varieties and meteorological factors时期
Stage气象因子
Meteorological factor产量
Yield每角粒数
Seeds per pod千粒质量 1000 -seed weight持续时间
Duration time播种至初花
From sowing to
initial flowering平均温度 0.58** 0.28 −0.21 −0.74** 降雨量 −0.53** −0.17 0.16 0.85** 光合有效辐射 0.57** 0.24 −0.12 −0.69** 初花至盛花
From initial flowering
to full flowering平均温度 −0.62** −0.44* 0.18 −0.49* 降雨量 0.40 0.28 −0.30 0.85** 光合有效辐射 −0.48* −0.52** 0.21 −0.34 盛花至终花
From full flowering
to final flowering平均温度 0.01 0.36 −0.40* −0.27 降雨量 0.37 −0.05 0.10 0.80** 光合有效辐射 −0.30 0.16 −0.14 −0.73** 终花至成熟
From final flowering
to maturity平均温度 −0.44* −0.02 −0.13 降雨量 −0.07 0.29 −0.18 光合有效辐射 −0.15 −0.26 0.05 1)“*”“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平显著相关(Pearson法)。
1) “*” “**” indicate significant correlations at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (Pearson method).2.7 油菜品质性状与主要气象因子的相关性
如表7所示，含油量与播种期至初花期的平均温度呈显著正相关，与光合有效辐射呈极显著正相关；与初花期至盛花期的平均温度、光合有效辐射呈极显著负相关；与终花期至成熟期的光合有效辐射呈显著负相关。蛋白质含量与初花期至盛花期的平均温度、盛花期至终花期的光合有效辐射呈显著正相关；与盛花期至终花期的降雨量呈显著负相关。亚油酸含量与初花期至盛花期的平均温度、光合有效辐射呈显著正相关。棕榈酸含量与播种期至初花期的光合有效辐射呈显著负相关；与初花期至盛花期的平均温度、光合有效辐射呈极显著正相关。亚麻酸含量与各阶段的气象因子均没有显著相关性。
表 7 早熟冬油菜品种品质性状与气象因子的相关性1)Table 7. Correlation between quality traits of early-maturing winter rape varieties and meteorological factors时期
Stage气象因子
Meteorological factor含油量
Oil content蛋白质含量
Protein content亚油酸含量
Linoleic acid content棕榈酸含量
Palmitic acid content播种至初花
From sowing to
initial flowering平均温度 0.43* −0.39 −0.33 −0.37 降雨量 −0.36 0.35 0.29 0.32 光合有效辐射 0.51** −0.39 −0.37 −0.42* 初花至盛花
From initial flowering
to full flowering平均温度 −0.61** 0.42* 0.46* 0.52** 降雨量 0.31 −0.10 −0.24 −0.37 光合有效辐射 −0.55** 0.21 0.43* 0.52** 盛花至终花
From full flowering
to final flowering平均温度 −0.16 0.39 0.02 −0.08 降雨量 0.20 −0.43* −0.18 −0.07 光合有效辐射 −0.21 0.43* 0.16 0.06 终花至成熟
From final flowering
to maturity平均温度 −0.18 0.22 0.15 0.13 降雨量 −0.12 0.38 0.04 −0.01 光合有效辐射 −0.41* 0.34 0.21 0.33 1)“*”“**”分别表示在P<0.05、P<0.01水平显著相关(Pearson法)。
1) “*” “**” indicate significant correlations at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (Pearson method).3. 讨论与结论
3.1 早熟冬油菜与广东双季稻生产的匹配性
广东“稻稻油”三熟制模式一般要求早稻在2月底至3月初播种，3月底至4月上旬移栽；晚稻在7月中旬播种，8月上旬移栽，10月底或11月初收获。构建“稻稻油”三熟制模式需冬油菜在11月上旬播种，次年3月底最迟4月初收获[8]。为保障三季作物茬口衔接，粤北与山地稻作区的冬油菜全生育期需在155 d以内，粤中与丘陵稻作区需在130~155 d，粤南与沿海稻作区需在130 d以内[21]。本试验在广州开展，且冬油菜品种全生育期都在151 d以内，满足粤中与丘陵稻作区“稻稻油”三熟制模式对冬油菜的生育期要求。由于油菜生长发育易受气候条件影响[22]，本研究也发现播种期至初花期的持续时间约占全生育期的60%，与该阶段平均温度极显著负相关，线性关系方程为y=−13.56x+342.37， r=−0.74**，其中y为播种期至初花期的持续时间，x为该阶段平均温度。假如早熟油菜品种在广州冬季种植时x为18.8 ℃，y为87.44 d，1)将该品种南进至茂名、湛江等更靠南的区域(粤南与沿海稻作区)种植，若冬季平均气温比广州高2 ℃，不考虑其他气象因素、品种感光特性等影响，按照以上线性方程，该品种播种期至初花期的持续时间理论上会减少27.12 d，本研究25个油菜品种的全生育期都会缩短至130 d以内，适宜种植；2)假如将该品种北移到韶关、清远等区域(粤北与山地稻作区)种植，冬季平均气温比广州低约1.5 ℃，播种期至初花期的持续时间理论上将延长20.34 d，按此计算，参试品种全生育期都会超过155 d，将不适宜在粤北“稻稻油”模式中应用。以上仅为引种生育期变化的理论估计值，下一步仍需在粤北开展早熟冬油菜品种的适应性验证。曹小东等[23]同样研究发现，年平均温度、最冷月平均温度、极端低温都与冬油菜的生育期呈极显著负相关；冬油菜由定西(35°58′N)南进至天水(34°33′N)，年平均温度增加2.8 ℃，全生育期缩减56.7 d，由定西北移至白银(36°12′N)，年平均温度降低1.2 ℃，全生育期延长9.5 d。由此可见，温度是影响油菜生育期的重要气象因子，冬油菜南进生育期缩短，北移生育期延长，与本研究结果相似。由以上可知，本研究的参试品种可满足粤中与丘陵稻作区和粤南与沿海稻作区“稻稻油”模式的构建和应用。
3.2 适宜广东“稻稻油”模式的冬油菜品种与农艺性状特征
本研究的25个早熟冬油菜品种南进广州后产量表现出较大差异，同时产量与生育期之间并无显著相关性；因此，选择高产和较早熟的品种将更有利于三熟制模式的周年高产和应用弹性。聚类分析显示，第I类(高产长生育期类型)和II类(高产短生育期类型)共计11个品种都属于高产类型，包含‘湘油420’‘中油925’‘中油107’‘中油916’‘中油988’‘希望226’‘希望599’‘希望799’‘希望422’‘湘油168’‘阳光131’，平均产量(
2088.8 kg·hm−2)、平均每角粒数(22.7)、平均一次分枝数(3.7)、平均单株有效角果数(118.5)和平均日产量(14.4 kg·hm−2)比后两类(III类和IV类)指标均值分别高28.1%、17.2%、8.9%、7.6%和29.8%。前人研究认为，“稻稻油”模式选择冬油菜品种时，除了将产量作为重要选择指标外，还应关注日产量，增加品种日产量可减少因生育期缩短造成产量潜力低的不利影响[12]，说明适宜广东“稻稻油”模式的冬油菜品种应具有较多的每角粒数、一次分枝数、单株有效角果数以及较高的日产量。根据不同稻作区可用冬闲田的时间，粤中与丘陵稻作区“稻稻油”模式的构建和应用可重点选择以上11个品种；推荐粤南与沿海稻作区“稻稻油”模式选择其中生育期较短的‘湘油420’‘中油925’‘中油107’‘中油988’‘希望226’；粤北与山地稻作区选择‘湘油420’进行适应性评价和验证。
3.3 广东冬季气象因子对早熟冬油菜产量和品质性状的影响
关于营养生长期平均温度对冬油菜产量的影响，存在有利作用[24]和有弊作用[15]2类研究结果。本研究发现在播种期至初花期，产量与平均温度和光合有效辐射均呈极显著正相关，与降雨量呈极显著负相关。由气象数据可知，本研究苗期光热资源充足，且全生育期并未遭遇−5 ℃及以下低温，为后期生殖生长提供了物质保障，贺亚琴等[24]研究认为油菜苗期和蕾薹期的温度升高能够促进新陈代谢，利于安全越冬；相反，连续降雨不仅易引起渍害还会降低幼苗期生长气温导致减产[25]，与本研究结果一致。
本研究发现含油量与播种期至初花期的平均温度呈显著正相关，与光合有效辐射呈极显著正相关；说明在没有低温冻害的情况下，充分利用苗期和蕾薹期充足的光热资源，对后期含油量性状的形成有积极影响，具体机理需要进一步研究。有研究发现终花期至成熟期的平均温度、光合有效辐射和相对湿度均与油菜含油量呈显著负相关[26-28]，本研究也发现相同趋势，说明成熟期的高温高湿天气对油菜品质形成有不利影响。
3.4 结论
本研究在广州冬闲田开展了25个甘蓝型早熟冬油菜品种的评价、筛选研究。试验品种全生育期136~151 d，产量
1279.0 ~2288.1 kg·hm−2；冬油菜产量与播种期至初花期的平均温度和光合有效辐射呈极显著正相关，含油量与播种期至初花期的平均温度呈显著正相关、与光合有效辐射呈极显著正相关；适宜广东“稻稻油”模式的冬油菜品种应具有较多的每角粒数、一次分枝数和单株有效角果数以及较高的日产量；以产量和生育期为指标筛选出‘湘油420’‘中油925’‘中油107’‘中油916’‘中油988’‘希望226’‘希望599’‘希望799’‘希望422’‘湘油168’‘阳光131’11个单产最高的品种，全生育期137~149 d，含油量均大于40%，适宜在粤中与丘陵稻作区“稻稻油”三熟制模式中推广应用。致谢：中国农业科学院油料研究所胡琼研究员、湖南农业大学刘忠松教授和全国农业技术推广服务中心李荣德老师为本研究提供短生育期甘蓝型冬油菜品种，江西省红壤及种质资源研究所郑伟研究员为本研究提供技术支持，特此感谢。
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图 1 猪LPAR3完整mRNA序列的RACE结果及5'调控序列扩增结果
M1为DL2000 marker，从上到下依次为：2 000、1 000、750、500、250和100 bp，M2为DL5000 marker，从上到下依次为5 000、3 000、2 000、1 500、1 000、750、500、250、100 bp；1：LPAR3基因5'UTR扩增条带；2和3分别为5'RACE Outer和Inner引物扩增特异性条带；4和5分别为3'RACE Inner和Outer引物扩增特异性条带；6:LPAR3基因5'调控区的扩增条带
Figure 1. RACE results of the complete mRNA sequence of pig LPAR3 gene and amplification results of the 5' regulatory sequence
M1: DL2000 marker，from up to bottom: 2 000, 1 000, 750, 500, 250, and 100 bp; M2: DL5000 marker，from up to bottom: 5 000, 3 000, 2 000, 1 500, 1 000, 750, 500, 250 and 100 bp; 1: Products of LPAR3 5'UTR amplification; 2 and 3: The specific bands of 5'RACE with Outer and Inner primers; 4 and 5: The specific bands of 3'RACE with Outer and Inner primers; 6: Products of LPAR3 5' regulatory sequence
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图 2 猪LPAR3基因5'调控区重要调控元件与转录因子结合位点预测结果
Figure 2. Predicted results of important regulatory elements and binding sites of transcription factors in the 5' regulatory region of pig LPAR3 gene
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图 3 猪LPAR3基因启动子各缺失片段扩增(A)及双酶切鉴定(B)
M:DL5000 marker；P1~P9片段大小分别约为1 958、1 435、1 047、534、351、203、96、218和921 bp
Figure 3. Amplification of the deletion fragments of pig LPAR3 gene promoter (A) and double enzyme digestion (B)
M: DL5000 marker; The lengths of P1-P9 were 1 958, 1 435, 1 047, 534, 351, 203, 96, 218 and 921 bp, respectively
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图 4 猪LPAR3基因各启动子缺失片段转录活性
各图中，柱子上的不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan’s 法)
Figure 4. Luciferase activities of LPAR3 promoter deletion fragments
In each gragh, different lowercase letters on the bars indicate significant difference(P<0.05, Duncan’s test)
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图 5 猪LPAR3 mRNA的组织表达谱
A图中，横坐标上的数字1~13分别表示心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑、肌肉、垂体、下丘脑、小肠、胃和子宫内膜；B图中，“**”表示差异显著(P<0.01，t 检验)
Figure 5. Gene expression profile of pig LPAR3 mRNA
In graph A, the numbers of 1~13 along the abscissa axis represented heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, cerebellum, muscle, pituitary, hypothalamus, small intestine, stomach and endometrium respectively; In graph B, “**” indicates significant difference (P<0.01, t test)
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图 6 GF12 ER和GD12 LL猪LPAR3基因甲基化检测结果
A、B、C为GD12 ER LPAR3基因甲基化状态；D、E、F为GD12 LL LPAR3基因甲基化状态；每行代表1个克隆，黑色点表示甲基化的CpG位点，白色点表示未被甲基化的CpG位点，黑框表示碱基错配
Figure 6. Detection results of methylation status of LPAR3gene in GF12 ER and GD12 LL pigs
A, B, C: Methylation status of GD12 ER LPAR3; D, E, F: Methylation status of GD12 LL LPAR3; Each row represents one clone, black dots indicate methylated CpG sites, white dot indicates non-methylated CpG sites, black boxes indicate base mismatches
表 1 猪LPAR3基因mRNA克隆及启动子扩增所需引物信息
Table 1 The primers for cloning the mRNA and promoter of porcine LPAR3 gene
引物名称
Primer name引物序列(5'→3')1)
Primer sequence产物大小/bp
Product sizepLPAR3-5UTR F：TGTCCTCCACCGCTCCT R：CCATCACCGTCTTCATTAG LPAR3-P F：CCTTTTGGTGGAGAAGTGAGAC 3 080 (–2 430/+650) R：GCATGGTTCGAGCTGTTCTCT p1 F：CGACGCGTCG TGAAGTGGCTCAGCAGGTT 1 958 (–1 878/+80) R：CCGCTCGAGCGG GAGGAGCGGTGGAGGAC p2 F：CGACGCGTCG TTGTATCCACCACATTGCCC 1 435 (–1 355/+80) R：CCGCTCGAGCGG GAGGAGCGGTGGAGGAC p3 F：CGACGCGTCG TTTCCTGGGTTATGGTTTC 1 047 (–967/+80) R：CCGCTCGAGCGG GAGGAGCGGTGGAGGAC p4 F：CGACGCGTCG GAGTTGTGTGGCTTCAGTT 534 (–454/+80) R：CCGCTCGAGCGG GAGGAGCGGTGGAGGAC p5 F：CGACGCGTCG CTCTGTAGGGCTTGTGG 351 (–271/+80) R：CCGCTCGAGCGG GAGGAGCGGTGGAGGAC p6 F：CGACGCGTCG TGCGTGGGAACTGTCGGT 203 (–123/+80) R：CCGCTCGAGCGG GAGGAGCGGTGGAGGAC p7 F：CGACGCGTCG CTGCCAAACTTTTCTCCTGT 96 (–16/+80) R：CCGCTCGAGCGG GAGGAGCGGTGGAGGAC p8 F：CGACGCGTCG CTCTGTAGGGCTTGTGG 218 (–271/–54) R：CCGCTCGAGCGG TCCGACTTGCCCCGCCTA p9 F：CGACGCGTCG CTCTGTAGGGCTTGTGG 921 (–271/+650) R：CCGCTCGAGCGG GCATGGTTCGAGCTGTTCTCT p-GADPH F：ACGCCTGCCCTGTGTCCCAA 190 R：GAAGCACGCCCTCTCGCCTC pLPAR3 F：TGGTCGCCCCGTCACTCT 100 R：AACTGAACATCCGCTCACACT LPAR3-BSP1 F：GGTTCGGAGGTACGGTTTTGTAGG 1 006 R：AAACACCACTCCCAACAATATCCC LPAR3-BSP2 F：CGGTTATGTATTTGGGGATTAG 887 R：TTCCCGAATCTCTAAATACCTT 1) 加粗表示保护碱基，下划线表示 MluI 酶切位点 (ACGCGT) 和 XhoI 酶切位点 (CTCGAG)
1) Bold type: Protective bases; Underline type: Restriction sites for MluI(ACGCGT) and XhoI(CTCGAG)
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