水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak，BLS)，简称水稻细条病，是世界范围内水稻主要的细菌性病害之一，由水稻细条病病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzicola感染引起，该病菌为黄单胞菌属细菌，革兰阴性菌，正常生长条件下呈黄色，端生鞭毛^[1]。水稻细条病是我国南方稻区主要的检疫性病害之一^[2]，在适宜发病区，水稻细条病感染可造成15%~25%的产量损失，严重发病时损失可达40%~60%，是继水稻稻瘟病、水稻纹枯病和水稻白叶枯病之后的第四大病害。水稻细条病于1918年在菲律宾的水稻上首次被发现^[3]，1957年我国广东省发现该病害^[4]，1978年以来，该病害一直在广西地区发生流行^[5]。目前水稻细条病防治主要依靠噻唑类杀菌剂，长期使用危害人类健康，病原菌容易产生耐药性及突变体。抗性基因是一类具有发展潜力的生物防治因子，在缺乏有效化学药剂和抗病品种的前提下，利用水稻本身携带的抗病基因是一种值得探求的细条病防治途径。挖掘水稻抗细条病主效基因，对丰富水稻抗病基因资源、培育水稻抗性品种具有重要作用。

有关细条病抗性基因的研究，多集中在对水稻细条病抗性数量性状基因(Quantitative trait locus，QTL)定位的研究上，由于QTL效应小且易受环境影响，导致抗性QTL定位和克隆困难。目前已定位了多个抗性QTL^[6-9]，其中Xie等^[7]将QTL基因qBlsr5a精细定位到30 kb范围内，并推测LOC_Os05g01710是最可能的候选基因。Chen等^[8]采用2个F₂分离群体在‘Dular’的第11号染色体上定位了1个抗性主效QTL qBlsr-11-1。郑景生等^[9]以中抗品种‘明恢86’和高抗品种‘佳辐占’构建F₂群体，在第2号染色体的RM279~RM154之间检测到1个抗性QTL。主效基因控制的质量抗性遗传基础相对简单，效应大，一旦被鉴定，更有望在基因克隆和功能研究上取得突破。Triplett等^[10]在遗传水稻(Heirloom rice)品种‘Carolina Gold Select’中鉴定了1个显性抗性基因Xo1，定位于第4号染色体长臂1.09 Mb范围内。He等^[11]将1个来自广西普通野生稻Oryzae rufipogon Griff 材料‘DP3’的抗细条病基因bls1定位于第6号染色体RM587与RM510之间4 cM的范围内。

基于现有的研究基础，本试验以高抗性、稳定的普通野生稻抗性资源‘DY19’为父本、‘9311’为母本，构建分离群体进行抗性遗传特性分析，利用集团分离分析(Bulked segregant analysis, BSA)法和连锁分析研究普通野生稻抗性基因的分子标记和连锁群的初步定位，以期为水稻抗细条病抗性基因的进一步精细定位、克隆及抗性育种奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

抗源材料‘DY19’，为广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室野生稻课题组(以下简称：本课题组)保存的广西普通野生稻，全生育期高抗细条病，用作抗病亲本。籼稻品种‘9311’，由中国水稻研究所提供，全生育期高感细条病，用作感病亲本。

广西优势致病型水稻细条病菌株JZ28，由广西农业科学院微生物研究所提供。

1.2   群体构建

试验在广西大学农学院科学研究试验基地进行。‘DY19’(父本)与‘9311’(母本)杂交获得F₁，F₁自交获得F₂用作抗性遗传分析。F₁连续与‘9311’回交(轮回亲本)，每次均通过后代接种细条病菌进行鉴定(如出现抗感分离即为携带抗性基因植株)，每次均选择携带抗性基因的植株进行回交，获得BC₃F₂。分别种植亲本、F₁、BC₁、F₂及BC₃F₂群体，株行距为20 cm×20 cm，每行种5株，亲本、F₁、BC₁各种15株，F₂和BC₃F₂各种409和265株。整个生育期保持浅水灌溉，其他管理措施按常规田间管理进行。

1.3   菌株接种

在水稻分蘖盛期进行接种，参照岑贞陆等^[12]的针刺法，稍作改进。把2根大头针插进橡皮胶中(2个针头距离约0.8 cm，针头露出约0.5 cm)；把吸足菌液的无菌海绵(大小与培养皿内空间相当)置于培养皿内，将水稻叶片的接种部位平置于海绵碟上，用带橡皮胶的大头针针头刺穿水稻叶片后(注意让针刺在水稻叶片中脉两侧)，再借用大头针上的橡皮胶顺势带着叶片挤压海绵至挤出菌液；在接种过程中不定时地给海绵补充菌液，每株材料接种2片新生、完全展开叶片。接种时若温度过高要注意遮阴或选择阴天接种，以防病菌侵染失败。

1.4   抗性鉴定

参考农秀美等^[13]的方法。在接种20 d后进行病情调查，每株测量长度最长的2个病斑，取平均值作为单株的抗性指标。以病斑长度1.5 cm作为抗、感分界线，抗病鉴定标准：免疫(I)，伤口无症状或仅有褐点；高抗(HR)，病斑长度0.1~0.5 cm；抗(R)，病斑长度0.6~1.0 cm；中抗(MR)，病斑长度1.1~1.5 cm；感病(S)，病斑长度1.6~2.5 cm；高感(HS)：病斑长度大于2.5 cm。

1.5   基因池构建及DNA提取

在F₂群体中，选取极端抗病(HR)和极端感病(HS)类型的单株各10株，每株取嫩叶100 mg，用CTAB法提取DNA，分别混合成抗病基因池和感病基因池。

1.6   SSR标记

SSR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应采用10 μL反应体系，含10×PCR Buffer(含MgCl₂) 1.0 μL、2.5 mmol·L^–1 dNTPs 0.2 μL、dd H₂O 7.1 μL、10 μmol·L^–1引物 0.6 μL、模板DNA 1.0 μL、5 U·μL^–1 Taq DNA聚合酶 0.1 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55~62 ℃(依据引物两段互补的碱基序列解链50%时的温度调整)退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物经80 g·L^–1聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离，快速银染后观察。

1.7   遗传图谱构建及基因定位

用均匀分布于水稻12条染色体的680对SSR引物对‘9311’和‘DY19’进行亲本多态性筛选，然后用在两亲本间表现出多态性的引物对抗病基因池和感病基因池进行扩增，再用在抗、感病基因池间检测到多态性的引物对定位群体的单株进行基因检测。根据基因型，用软件JoinMap 3.0绘制标记的连锁图谱，根据重组单株基因型进行抗性基因初步定位。

2.   结果与分析

2.1   抗源‘DY19’对细菌性条斑病的抗性表现

以抗源‘DY19’为父本与感病籼稻品种‘9311’杂交和回交，用广西强致病力细条病菌株JZ28对亲本及杂交和回交后代进行抗性鉴定。结果(表1)表明，所有F₁和BC₁植株对细条病的病情指数均为S~HS级，表现为感至高感，没发现抗病植株，说明‘DY19’控制水稻抗细条病的基因为隐性遗传。

表  1  亲本及杂交和回交后代对细菌性条斑病菌株JZ28的抗性反应

Table  1.  Resistance reaction of parents and their cross and backcross progenies to bacterial leaf streak strain JZ28

材料 Material	总株数 Total plant number	各病情指数的材料份数 Plant number with different disease indexes
		0(Ⅰ)	1(HR)	3(R)	5(MR)	7(S)	9(HS)
9311	15	0	0	0	0	0	15
DY19	15	0	15	0	0	0	0
F1	15	0	0	0	0	1	14
BC1	15	0	0	0	0	1	14

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2.2   抗性的遗传分析

通过对F₂群体(409株)病斑长度的调查，以病斑长度1.5 cm为分界点，抗病和感病单株数分别为112和297株，经卡平方检验，抗(R)、感(S)分离符合1∶3(χ²=1.24<χ²_0.05=2.84)的单基因遗传分离理论比率。结合F₁和BC₁代的抗性表现，说明‘DY19’在水稻分蘖期对细条病的抗性由1对隐性主效基因控制，命名为bls2。

2.3   抗性基因的初步定位

选取均匀分布于水稻12条染色体上的680对SSR引物对亲本‘DY19’和‘9311’进行多态性检测，筛选到261对在亲本间具多态性的引物，平均多态率为38.38%。以抗、感病基因池DNA为PCR模板，用筛选获得的261对多态性标记进行PCR扩增反应，获得1个在抗、感病基因池之间具有多态性的引物RM13630。

进一步根据GRAMENE网站公布的水稻SSR标记信息，在RM13630上、下游5 M的范围内设计合成了25个SSR标记，从中筛选出4个具有多态性的标记RM5427、RM13514、RM13638和RM1367(引物序列见表2)。这5个分子标记都与抗细条病基因存在不同程度的连锁关系，用筛选到的5对多态性引物分别对F₂分离单株的基因型和表型进行分析，利用JoinMap 3.0构建遗传连锁图。结果表明，抗细条病基因bls2位于第2条染色体区段RM13514与RM13630之间约12 cM范围内。

表  2  用于bls2标记的SSR引物序列

Table  2.  SSR primer sequences used for bls2 mapping

引物名称 Primer name	上游引物 Forward primer (5′→3′)	下游引物 Reverse primer (5′→3′)
RM5427	TGCTGTTGACACTTGACAGGTAGC	CACAATTATTGCGGCTCATCG
RM13514	ATCTGATGATGGCCACGACAGTAACG	TGATCTGATCCCGTATTCCCATGC
SL02	CTTGTGGACGACGAGGTAT	AACAGAGTAGGGAGGAGGAG
SL03	GCAAATTCCTCTGTTCTGTG	ACTTGCAAAGCAAATTCTGT
SL04	TAAAAGTGGAGTCATCCGTC	GAGAATGGGTTGTGGATTAG
RM13630	GCCGCTGATCTCTTACCTGTTACGG	GTGCTTCGGCACAGGTCAATGC
RM13638	CGTCAACTGACTGGTCCCACTACTGC	CTTGGGCCCACCTGTCATACCC
RM1367	CGCTGCTACTCCTAGCTGCTACC	CATGCATGTGTGTACGTAGGATCG

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随后，利用bls2两侧分子标记RM13514和RM13630，对BC₃F₂群体(共265个单株)中61株抗病单株进行分子标记检测，分别筛选到16和5株重组单株。对位于RM13514与RM13630之间的20对SSR标记进行多态性筛选，共获得3对具有多态性的标记SL02、SL03和SL04(引物序列见表2)。利用这3对标记进一步对上述的21株重组单株进行分析，最终将bls2定位在水稻第2条染色体标记SL03与SL04之间4 cM的范围内(图1)。

图  1  bls2在第2条染色体上的连锁图谱

Figure  1.  Linkage map of bls2 on the second chromosome of rice

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3.   讨论与结论

3.1   水稻细菌性条斑病抗性基因的遗传规律

普通野生稻是水稻的祖先，其在野生环境中经过漫长的自然选择，在抗病虫害方面保持着多种优良抗性基因。面对如今育种中出现的基因库狭窄的问题，发掘野生稻的细条病抗性资源，利用野生稻的抗病基因对种质创新有十分重要的意义。关于水稻细条病抗性遗传规律的研究，最初Khush^[14]认为细条病抗性属于数量性状。何月秋等^[15]用9个恢复系和7个不育系组配了13个杂交组合，认为水稻对细条病的抗性由1~2对显性主效基因控制。张红生等^[16]研究表明，‘IR36’对细条病的抗性由1对隐性主效基因控制，‘Dular’、‘IR26’和‘IR1545-339’的抗病性均由1对显性基因控制。周明华等^[17]用细条病菌株Rs105接种‘BJ1’、‘IR36’不同世代群体，根据其抗、感病反应推断，‘BJ1’对细条病的抗性由1对显性基因控制；‘IR36’的抗性则由2对隐性基因控制。徐建龙等^[18]分析了‘Hashikalmi’、‘Dular’和‘0IRBBN44’这3个抗源对细条病的抗性遗传，发现他们对细条病S-103菌株存在4个不同的抗性基因，暗示水稻细条病抗性基因存在多个基因位点。黄大辉等^[19]通过对‘DP3’与‘9311’杂交的F₂群体分析发现，水稻细条病抗感植株的分离比符合1∶15的比例，表明‘DP3’的抗性由2对隐性重叠作用基因控制。贺文爱等^[20]认为，广西普通野生稻‘DY3’、‘DY17’、‘DY20’的细条病抗性由2对隐性抗性基因控制，‘DY16’的抗性由1对隐性抗性基因控制。郑景生等^[9]认为水稻对细条病的抗性属于微效多基因控制的数量遗传。邹丽芳等^[21]从‘Xooc’中获得2个avBs3r/PthA家族基因克隆，证实水稻对细条病的抗性可能是受主效基因控制。本试验用1份普通野生稻高抗源‘DY19’，采用BC₃F₂分离群体结合BSA法进行了研究，结果表明细条病抗性是受1对隐性主效基因控制；结合前人研究结果证实不同抗源材料存在不同的抗病遗传机制，说明水稻资源控制细条病的遗传机制是多样化的。

3.2   水稻细菌性条斑病抗性位点的定位

到目前为止，相关文献报道共检测到19个水稻细条病抗性QTLs，分布在水稻的8条染色体上，其中来自水稻第3、5、11号染色体的抗性QTLs被多次检测到，然而这些QTLs绝大多数还处于初步定位阶段。由于每个QTL的效应小且易受环境影响，导致抗性QTL定位和克隆困难。主基因控制的质量抗性遗传基础相对简单，效应大，一旦被鉴定，更有望在基因克隆和功能研究上取得突破。目前对水稻细条病抗性主基因的研究大多仅限于遗传分析，鲜见定位报道。Triplett等^[10]在美国遗传水稻(Heirloom rice)品种‘Carolina Gold Select’中鉴定了1个显性抗性基因Xo1，对非洲分离的细条病生理小种表达完全抗性，该基因被定位于第4号染色体长臂1.09 Mb范围内，但是该基因对亚洲细条病生理小种表现感病。本课题组前期以1份高抗性普通野生稻材料与测序品种‘9311’构建了连续回交群体BC₂F₂，将1个主效隐性抗性基因bls1定位在第6号染色体4 cM范围内^[11]。这是唯一报道的对亚洲细条病菌具有抗性的主基因定位。本研究选择均匀分布于水稻12条染色体的680对SSR引物对抗病亲本‘DY19’和感病亲本‘9311’进行多态性检测，筛选得到261对在两亲本间具有多态性的SSR引物，将主基因bls2初步定位于第2号染色体SL03与SL04之间4 cM范围内，这是1个新的抗性基因。该基因的发现为水稻抗细条病基因的精细定位、克隆及阐明由主基因介导的抗性调控机制提供了有利的资源条件。