Fermentation optimization of Penicillium citrinum PA-33 strain by response surface method
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摘要:目的
优化桔青霉Penicillium citrinum PA-33发酵培养基和发酵条件，以提高桔青霉PA-33的抗菌活性。
方法采用单因素试验确定桔青霉PA-33发酵所需最适基础培养基、碳氮源和无机盐，并利用响应面法设计确定最适发酵培养基配方；在发酵条件单因素试验基础上，采用三元二次通用旋转组合设计和频率分析法优化其最适发酵条件组合。
结果经优化后，最佳发酵培养基配方为马铃薯汁液219.91 g·L−1、甘露醇34.11 g·L−1、黄豆粉6.25 g·L−1；最适发酵条件为装液量50 mL、接种量3.5% (φ)、发酵温度28 ℃，摇床转速150 r·min−1、发酵时间12 d。优化后发酵液对大肠埃希菌Escherichia coli的抑菌圈直径为28.99 mm，较优化前抑菌圈直径 (18.73 mm) 增加了10.26 mm。
结论采用响应面法、三元二次通用旋转组合设计和频率分析法优化发酵工艺，显著提高了桔青霉PA-33发酵液的抗菌活性，为该菌株的抗菌活性物质的分离以及工业化生产提供依据。
Abstract:ObjectiveTo optimize the medium composition and fermentation conditions of Penicillium citrinum PA-33 to improve its antibacterial activity.
MethodSingle factor experiments were used to determine the optimum basic medium, carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts. The optimum formulation of fermentation medium was determined by response surface methodology. On the basis of single factor tests of fermentation conditions, the optimal combination of fermentation conditions was optimized by ternary quadratic rotation unitized design and frequency analysis method.
ResultThe optimal medium composition were: Potato juice 219.91 g·L−1, mannitol 34.11 g·L−1 and soybean powder 6.25 g·L−1. The optimal fermentation conditions were: Liquid volume 50 mL, inoculation concentration 3.5% (φ), culture temperature 28 ℃, rotation speed 150 r·min−1 and fermentation for 12 d. The inhibition zone diameter of fermentation broth after optimization on Escherichia coli reached 28.99 mm, increased by 10.26 mm compared with 18.73 mm under the original conditions.
ConclusionResponse surface methodology, ternary quadratic rotation unitized design and frequency analysis method significantly enhance the antibacterial activity of fermentation broth of Penicillium citrinum PA-33, and this study provides a basis for isolation of antibacterial active substances and industrial production of this strain.
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烟草是一种经济价值较高的作物，在烟草生产中，有些地区的烟草常常遭受一种寄生性种子植物向日葵列当Orobanche cumana的为害，被寄生的烟草植株矮化、叶片变薄，烟叶的产量和品质严重下降[1-3]。列当种子体积较小、数量多、繁殖速度快，能在土壤中存活10年以上，且适宜条件下，在烟草的整个生育期均能出土[4-5]，给防治带来很大困难。随着种植年限的增加，土壤中列当种子数量逐年累积，列当发生日益严重[6]，成为限制烟草生产和发展的重要因素。Noureddine等[7]报道含有昆虫肽转基因的烟草不受列当的侵害，但未能推广应用。Eva等[8]曾以欧芹作为诱捕作物，但最终欧芹也成为了向日葵列当的寄主植物，且向日葵列当还存在如油菜、番茄和马铃薯，甚至杂草等潜在寄主植物。国外常采取抗性育种的方法提高植物对列当的抗性，从而达到防治的效果[9-10]。在我国，对列当的防治研究也取得了一定进展。在化学防治方面，张锐等[11]在众多除草剂中筛选出精喹禾灵，其对列当的防治效果达到56.28%；程乐强等[12]施用8种除草剂及生防镰孢菌防除向日葵列当，其中以氟乐灵防治效果最好，平均寄生率为22.6%；徐玮等[13]通过田间试验认为二甲戊灵对向日葵列当的防效最好，其次是精异丙甲草胺和氟乐灵。除草剂对向日葵列当具有一定的防治效果，但容易对烟草产生药害，生产应用受到一定的限制。在物理方法进行农业防治方面，张连昌等[14]报道黑膜可以使列当出土数量减少6%左右。程乐强[15]等将糠醛渣撒施后深翻土壤，发现糠醛渣能够中和土壤中的碱，提高土壤通透性，推迟列当出土15 d左右，但过量的糠醛渣在团棵期影响烟株的正常生长，且后期难以恢复。唐嘉成等[16]研究多种有机肥对向日葵列当的防治效果，发现牛粪和羊粪对列当的防效分别能达到36.25%和66.00%，施用有机肥后，烟草长势也较好，中上等烟叶比例分别为74.84%和70.23%，但牛粪和羊粪价格较高，应用成本不菲。轮作虽然能有效控制当年列当对烟草的危害[17-18]，但由于列当种子在土壤中能存活10年以上，数量又多，即使10年后再种植烟草，列当寄生仍然十分严重，而且轮作在很大程度上受土地面积制约，难以施行。生产上急需找到新的可行的有效防治列当的方法。酒糟由于成本低、容易获取等特点常被用作有机肥[19]，本文通过田间小区试验，研究施用不同剂量的酒糟处理土壤对向日葵列当的防治效果及对烟草生长、产量和品质的影响，以期为向日葵列当的防治提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料及栽培条件
供试烟草品种为‘NC102’(2018年)和‘吉烟9号’(2019年)，种子由吉林省白城市烟草公司提供；新鲜高粱酒糟购买自白城市大安市酒厂。
试验地为吉林省白城市大安市红岗乡烟叶基地，前茬作物为烟草，地力均匀，列当发生较严重，栽培条件、田间管理及烘烤工艺与生产一致。
1.2 试验设计
试验设置3个处理，分别施用酒糟1、2、3 kg/m2，以不施用酒糟为对照，正常栽烟。每个处理重复3次，每处理1个小区，每小区面积30 m2(5 m×6 m)。烟苗移栽前，将酒糟按照各处理剂量均匀撒施于烟田中，然后进行翻耕，使酒糟与20 cm深土壤充分混匀后起垄。2018与2019年田间试验处理一致，2019年测定各处理烘烤后的烟叶品质。
1.3 方法
1.3.1 防效调查
采取全小区调查的方法，参照文献[20]标准,分别在施药后15、30、45 d和采收前进行调查，记载每个小区的列当数量，烟叶采收时同时对每小区的列当称鲜质量。根据以下公式计算株防效和鲜质量防效：
$$ {\text{株防效}} = \frac{{{\text{对照列当株数}} - {\text{处理列当株数}}}}{{{\text{对照列当株数}}}} \times 100{\text{%}} , $$ $$ {\text{鲜质量防效}} = \frac{{m\left( {{\text{对照}}} \right) - m\left( {{\text{处理}}} \right)}}{{m\left( {{\text{对照}}} \right)}} \times 100{\text{%}} , $$ 式中，m表示列当鲜质量。
1.3.2 烟草生长指标及叶绿素含量的测定
烟草植株成熟后采收前，每个小区随机选择10株烟草，测定株高、茎粗，每株烟草分别选取上部、中部、下部叶片各3片，测量叶长、叶宽，用手持叶绿素测定仪测定叶片基部、叶中部和叶尖的叶绿素含量。
1.3.3 烟草质量的测定
每次采收后烘烤前进行小区内烟叶总质量的测定，烘烤后按照不同等级分别称质量，全部采收和烘烤结束后对各小区（30 m2）的烟叶鲜质量和干质量进行求和。
1.3.4 烟叶烘烤后的品质测定
取C3L(中柠三)等级的烟叶进行测定，测定项目包括主要化学成分含量和吸评，其中糖、总碱、氯、钾的含量测定采用连续流动法[21-23]；总氮含量的测定采用克达尔法[24]。吸评评价标准参照烟草及烟草制品感官评价方法标准[25]。
1.4 数据处理
利用Excle2010进行试验数据整理，利用DPS软件分析试验数据，差异显著性检验用Duncan’ s新复极差法。
2. 结果与分析
2.1 施用酒糟对烟草向日葵列当的防治效果
受天气的影响，列当在试验后45 d未能出土，因此本试验只获得了采收前列当的相关数据。在栽培不同烟草品种的情况下，2年的试验结果(表1)表明，不同剂量酒糟处理土壤对向日葵列当均具有较好的防治效果，2018年株防效为62.73%~74.16%，鲜质量防效为42.70%~66.03%，各处理中以施用3 kg/m2酒糟的防效最好，株防效和鲜质量防效分别为74.16%和66.03%，鲜质量防效显著高于施用1 kg/m2酒糟的。2 kg/m2酒糟效果次之，株防效和鲜质量防效分别为72.00%和59.47%；2019年平均株防效为57.10%~64.17%，平均鲜质量防效为53.23%~80.56%，各处理中以施用3 kg/m2酒糟防效最好，株防效和鲜质量防效分别为64.17%和80.56%，且鲜质量防效显著高于施用1、2 kg/m2酒糟的。施用2 kg/m2酒糟的株防效和鲜质量防效分别为61.34%和59.18%。
表 1 烟草采收前施用酒糟对向日葵列当的防治效果1)Table 1. Control effect of vinasse treatment against broomrape on tobacco before harvest年份
Year酒糟用量/
(kg·m−2)
Dose of vinasse株防效/%
Plant control
effect鲜质量防效/%
Fresh weight
control effect年份
Year酒糟用量/
(kg·m−2)
Dose of vinasse株防效/%
Plant control
effect鲜质量防效/%
Fresh weight
control effect2018 1 62.73±6.36a 42.70±2.90b 2019 1 57.10±11.58a 53.23±6.20b 2 72.00±1.95a 59.47±14.84ab 2 61.34±13.01a 59.18±9.79b 3 74.16±2.41a 66.03±6.86a 3 64.17±17.22a 80.56±5.74a 1)表中数据为平均值±标准误，相同年份同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s 法)
1)The values in the table are mean ± standard error, and different lowercase letters in the same year in the same column represent significant difference(P<0.05，Duncan’s test)2.2 施用酒糟对烟草生长及叶绿素含量的影响
各处理施用酒糟后烟草长势均有明显的变化(表2)，施用酒糟的处理在株高、茎粗、叶长、叶宽及叶绿素含量方面总体均高于对照。2018、2019年各处理平均株高分别比对照提高7.44%和5.41%，茎粗分别比对照提高19.43%和3.40%。从叶长上看，2018年施用1 kg/m2酒槽时下部叶片长度增加17.15%，施用3 kg/m2酒槽时中部叶片和上部叶片长度分别提高了12.33%和17.49%；2019年施用1 kg/m2酒槽时叶长增长较明显，下、中、上部叶片分别增长10.41%、8.25%和9.69%。从叶片宽度上看，2018年施用1 、2 kg/m2酒槽对下部叶宽增长效果明显，分别比对照增宽45.75%和44.87%，3 kg/m2酒槽处理下上部叶片的宽度增幅较大，为14.00%；2019年同样以施用1 和2 kg/m2酒槽叶宽增幅较大，施用2 kg/m2酒槽的下部和中部叶片、施用1 kg/m2酒槽的上部叶片表现出较好的长势，分别比对照增宽15.48%、15.19%和16.79%。2年的试验结果中，各处理剂量上、中、下部叶片的叶绿素含量均略有提高，其中都以施用2 kg/m2酒槽的处理提高最明显。
表 2 酒糟处理后对烟草生长的影响1)Table 2. Effect of vinasse treatment on the growth of tobacco年份Year 酒糟用量/
(kg·m−2)
Doses of
vinasse株高/cm
Plant height茎粗/cm
Stem diameter叶长/cm
Length of leaf叶宽/cm
Width of leafw(叶绿素)/(mg·g−1)
Chlorophyll content下部Bottom 中部Middle 上部
Top下部Bottom 中部Middle 上部
Top下部Bottom 中部Middle 上部
Top2018 0（CK） 105.62b 27.37b 57.74a 65.72b 56.16b 20.46b 33.28a 30.72a 15.71a 18.21a 19.33a 1 117.10ab 28.53b 69.12a 72.50ab 60.76ab 29.82a 33.62a 30.96a 19.30a 21.44a 21.11a 2 107.28ab 33.44a 67.52a 67.76ab 55.60b 29.64a 29.06a 29.76a 20.45a 22.49a 22.48a 3 116.04a 36.09a 67.64a 73.82a 65.98a 24.04b 32.54a 35.02a 17.40a 21.21a 20.93a 2019 0（CK） 131.53b 29.34ab 65.32a 69.46b 59.37a 30.11a 32.33a 30.56a 10.42a 11.85a 13.48a 1 141.02a 29.86ab 72.12a 75.19a 65.12a 33.25a 36.75a 35.69a 10.33a 12.74a 13.84a 2 142.06b 31.58a 72.35a 73.52a 63.78a 34.77a 37.24a 30.12a 10.53a 12.31a 15.75a 3 132.85b 29.57b 69.56a 71.33ab 63.98a 31.25a 32.10a 33.27a 10.44a 12.46a 14.27a 1)相同年份同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s 法)
1)Different lowercase letters in the same year in the same column represent significant difference(P<0.05，Duncan’s test)2.3 施用酒糟对烟草产量的影响
施用酒糟后，烟草的鲜质量和干质量均比对照有了明显的增加，中上等烟叶比例也有明显的提高(表3)。在鲜质量方面，2018、2019年鲜质量分别比对照提高17.76%~24.22%和6.63%~15.71%，连续2年在施用2 kg/m2酒槽处理下，鲜质量最大，分别比对照提高了24.22%和15.71%。在干质量方面，2018年施用1、2、3 kg/m2酒槽处理的烟叶平均干质量分别较对照增加6.70%、11.63%和9.77%；施用1、2、3 kg/m2酒槽处理的中上等烟质量显著高于对照，分别较对照提高15.39%、20.17%和18.26%，中上等烟叶比例在94%以上，比对照提高7.3%以上；2019年施用1、2、3 kg/m2酒槽平均干质量分别较对照增加12.59%、19.11%和13.64%，施用1、2、3 kg/m2酒槽处理的中上等烟叶质量分别比对照提高19.31%、23.76%和19.82%，中上等烟叶占比均高于95%，比对照提高3.9%以上。
表 3 酒糟处理后对烟草产量的影响1)Table 3. Effect of vinasse treatment on the yield of tobacco年份
Year酒糟用量/
(kg·m−2)
Dose of vinassem鲜/kg
Fresh
weight烟叶等级
Tobacco gradem干/kg
Dry
weight中上等烟叶
Superior and middle class of tobaccoX4L X3L C3F C2L C3L B2F B3F m/kg 占比/% Rate 2018 0（CK） 79.47b 3.99 18.91 1.51 7.85 10.75a 9.42 87.63 1 93.58a 1.80 15.38 4.15 13.08 11.47a 10.87 94.77 2 98.72a 2.06 18.43 5.67 9.85 12.00a 11.32 94.33 3 95.08a 2.12 16.26 4.61 12.42 11.80a 11.10 94.07 2019 0（CK） 72.65b 2.14 6.34 11.62 5.55 8.58a 7.87 91.72 1 79.55a 0.82 7.32 14.44 6.52 9.66a 9.39 97.20 2 84.06a 1.43 6.97 15.40 6.67 10.22a 9.74 95.30 3 77.47a 0.97 7.01 15.63 5.64 9.75a 9.43 96.72 1)烟叶等级中，X4L：下柠四，X3L：下柠三，C3F：中桔三，C2L：中桔二，C3L：中柠三，B2F：上桔二，B3F：上桔三；相同年份同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s 法)
1)X4L, C3F, C3L, B3F, X3L, C2L, B2F are grades of tobacco; different lowercase letters in the same year in the same line represent significant difference(P<0.05，Duncan’s test)2.4 施用酒糟对烤后烟叶主要化学成分含量的影响
施用酒糟后，烟草还原糖、总糖含量与对照相比均有不同程度的提高；施用酒糟后的烟草总植物碱和总氮含量略低于对照；钾的含量在施用酒糟3 kg/m2烟草中高于对照，其他处理低于对照；施用酒糟能有效降低烤后烟叶中氯的含量，3个处理烤后烟叶氯的含量分别比对照降低58.73%、61.90%和46.03%(表4)。
表 4 酒糟处理对烤后烟叶主要化学成分含量的影响Table 4. Effect of vinasse treatment on the contents of chemical components in tobaccow/% 酒糟用量/(kg·m−2)
Dose of vinasse还原糖
Reducing sugar总糖
Total sugar总植物碱
Total nicotine总氮
Total N钾
K氯
Cl1 23.4 26.7 2.36 1.92 1.48 0.52 2 21.7 25.2 2.31 1.96 1.73 0.48 3 25.4 30.3 2.10 1.80 1.85 0.68 0 (CK) 19.0 21.9 2.50 2.06 1.80 1.26 2.5 施用酒糟对烤后烟叶感官评价的影响
由表5可以看出，施用酒糟后，在防除烟草向日葵列当、提高烟叶产量的同时，烟草的感官吸评质量与对照无差异，而且，施用酒糟1 kg/m2的烟草在香气质、香气量、余味、杂气等方面的得分均高于对照，总得分也高于对照，质量档次与对照组同属于中等＋；施用酒糟2、3 kg/m2的烟草总得分略低于对照，质量档次属于中等。
表 5 酒糟处理对烤后烟叶感官评价的影响1)Table 5. Effect of vinasse treatment on sensory evaluation of tobacco酒糟用量/
(kg·m−2)
Dose of vinasse香型Aroma type 劲头Energy 浓度Concetration 香气质
Quality of aroma
(15)香气量
Quatity of aroma (20)余味Aftertaste
(25)杂气Miscellaneous
gas (18)刺激性Irritation
(12)燃烧性
Combusti-
bility
(5)灰色
Color
of ash
(5)总得分
Total score
(100)质量档次Quality level 1 中间 适中 中等 11.17 15.67 19.08 13.00 8.92 3.00 3.08 73.9 中等+ 2 中间 适中 中等 10.83 15.33 18.33 12.42 8.75 3.00 3.08 71.8 中等 3 中间 适中 中等 11.08 15.58 18.50 12.67 8.92 3.00 3.08 72.8 中等 0 (CK) 中间 适中 中等 11.00 15.58 18.67 12.92 8.92 3.00 3.08 73.2 中等+ 1)括号中数字表示满分
1)The number in parentheses presents full score3. 结论与讨论
土壤施用酒糟对烟草向日葵列当有较好的防治效果，对烟草的生长具有促进作用，各项生长指标均明显高于对照，能够提高烟草的产量和中上等烟叶的比例，可以提高烤后烟叶中糖的含量，同时能有效降低烤后烟叶中氯的含量，改善氯含量过高的情况。综合考虑推荐在烟苗移栽前以1~2 kg/m2的剂量将酒糟与20 cm深土壤混合均匀后起垄。
列当虽然属于五类病原物之一，但由于其为寄生性的种子植物，所以在生产中也将其视为一类杂草。化学防治一直以来是植物病害防治和杂草防除的重要手段，已筛选出对烟草向日葵列当有一定防治效果的精喹禾灵、二甲戊灵、精异丙甲草胺和氟乐灵等除草剂，但除草剂会对烟草产生药害，同时也存在农药残留的问题，因此在烟草生产上化学除草剂未得到广泛应用。本研究施用酒糟防治向日葵列当，各处理的平均防效与除草剂相当或略高于上述除草剂，而且可以有效避免药害、农药残留等问题，有利于烟草与其他作物的轮作，从而减少烟草病虫害的发生。酒糟作为酿酒的副产品，来源比较广泛，以往主要用作牲畜的饲料，但由于其口感不好一般需要经过再发酵或者是与其他精饲料混合，有时会被当作废物到处堆积[26]。本研究发现其对向日葵列当有一定的防除效果，而且可以促进烟草的生长和改善烟草品质，不仅为向日葵列当的防治提供了新思路，而且拓宽了酒糟的利用途径。
邵伏文等[27]的研究表明，在土壤中施用0.1 kg/m2硫磺＋3 kg/m2酒糟能够提高上等烟叶的比例，同时能增加糖类的含量、降低氯的含量，与本研究结果相符。烤烟的化学成分含量与烤烟质量关系密切[28-29]，可溶性糖和烟碱的比值常作为烤烟及其制品的评比指标，最适值为8~12，比值越大，苦辣味越轻，口感越好，钾氯比常作为烤烟燃烧性的评价指标，最适值为4~10，比值越大，燃烧性越好[30-31]。本研究中，施用酒糟的烟草可溶性糖与烟碱的比值为9.40~12.10，钾氯比为2.72~3.60，均高于对照。因此，可以尝试通过在烟田施用酒糟来改善烟叶苦辣味较重和燃烧性较差的问题，提高烟叶的品质。
据研究，大多数酒糟不仅含有一定的粮食(原料本身)和乙醇，而且还含有丰富的蛋白质、多种微量元素、维生素、酵母菌、赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸等[32]。用于酿酒的原材料不同，酒糟的成分也不一样，本研究中使用的是高粱酿酒后的下脚料，而且是新出锅的酒糟，施入土壤后为什么能减少列当出土，是其本身含有的乙醇还是其他成分发挥作用？是否与酒糟施入土壤后进一步发酵产生的短时高温有关？是抑制了向日葵列当种子萌发还是阻止了其萌发后与寄主建立的寄生关系？这些都有待于进一步研究。
除草剂防除土壤杂草的试验一般在施药后15、30和45 d调查株防效，45 d时调查鲜质量防效[20]，本试验中未能按上述准则调查主要是因为向日葵列当出土受气候条件影响很大，向日葵列当种子的萌发、与寄主建立联系、向日葵列当的生长都受到温度、湿度、降水等条件的影响，2018年到烟草采收前向日葵列当才陆续出土，2019年也是到了7月份后向日葵列当才出土，无法在施药后15、30和45 d 调查。本研究为白城烟区2年的试验结果，各地区土壤类型、土壤条件及种植品种的不同，年份间及不同地方的气候条件也不尽相同，酒糟防治烟草向日葵列当的效果可能受多种因素影响，还应进行多年多点试验，评价其效果的稳定性。
致谢：感谢杨丽娜老师为本试验妥善安排差旅工作！感谢邵郅伟、曹哲铭等同学参与调查工作。
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图 1 不同培养基成分对发酵液抗菌活性的影响
B图中横坐标的数字1、2、3、4、5、6、7、8、9和10分别代表葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、乳糖、果糖、糊精、甘油、甘露醇和麦芽糖；C图中横坐标的数字1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11分别代表对照、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、黄豆粉、尿素、KNO3、NH4NO3、NH4Cl和陈皮；各图中柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
Figure 1. Effects of different medium ingredients on the antibacterial activities of fermentation broth
In figure B，number 1，2，3，4，5，6，7，8，9 and 10 represent glucose, sucrose, starch, corn flour, lactose, fructose, dextrin, glycerin, mannitol and maltose, respectively; In figure B，number 1，2，3，4，5，6，7，8，9, 10 and 11 represent control, peptone, yeast extract, beef extract, tryptone, soybean powder, urea, KNO3, NH4NO3, NH4Cl and bran, respectively; In each figure, different lowercase letters on the bars indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test)
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图 2 菌株PA-33抗菌活性的响应曲面图
A1、A2和A3为响应面3D图；B1、B2和B3为等高线图
Figure 2. Response surface plots of antibacterial activity of strain PA-33
A1, A2, and A3: 3D maps of response surfaces; B1, B2, and B3: Contour maps
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图 3 不同发酵条件对菌株PA-33抑菌活性的影响
各图中, 柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan’s法)
Figure 3. Effect of different dermentation condition on antimicrobial activity of strain PA-33
In each figure, different lowercase letters on the bars indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test)
表 1 不同质量浓度的培养基成分对菌株PA-33抗菌活性的影响1)
Table 1 Effects of different concentrations of medium components on antibacterial activities of fermentation broth
ρ(马铃薯)/(g·L−1) Patato content 抑菌圈直径/mm Inhibition zone diameter ρ(甘露醇)/(g·L−1) Mannitol content 抑菌圈直径/mm Inhibition zone diameter ρ(黄豆粉)/((g·L−1) Soybean powder content 抑菌圈直径/mm Inhibition zone diameter 100 22.93±0.52ab 20 22.03±0.12c 5.0 23.83±0.69c 150 23.13±0.25ab 25 23.33±0.09b 7.5 27.93±0.19a 200 23.47±0.25a 30 26.60±0.83a 10.0 25.77±0.31b 250 22.53±0.19b 35 25.50±0.08a 12.5 25.13±0.09b 300 21.80±0.16c 40 23.43±0.87b 15.0 22.43±0.17d 1) 同列数据后的不同小写字母表示差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法 )
1) Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05，Duncan’s test)
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表 2 Box-Behnken试验方差分析
Table 2 Analysis of variance for Box-Behnken experiment
来源1) Source SS DF MS F P2) 模型 Model 76.25 9 8.47 22.24 0.000 2** A 1.07 1 1.07 2.80 0.138 3 B 15.62 1 15.62 41.01 0.000 4** C 14.36 1 14.36 37.70 0.000 5** AB 0.07 1 0.07 0.17 0.691 9 AC 9.52 1 9.52 24.98 0.001 6** BC 0.01 1 0.01 0.02 0.894 4 A2 14.56 1 14.56 38.22 0.000 5** B2 12.31 1 12.31 32.30 0.000 7** C2 5.19 1 5.19 13.61 0.007 8** 残差
Residual2.67 7 0.38 失拟
Lack of fit1.96 3 0.65 3.71 0.118 9 误差
Error0.71 4 0.18 总变异
Total variation78.92 16 1) A、B 和 C 分别表示马铃薯、甘露醇和黄豆粉；2) “**” 表示模型具有极显著影响 (P<0.01)
1) A, B and C represent potato, mannitol and soybean powder, respectively; 2) “**” indicates the model is highly significant(P<0.01)
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表 3 三元二次通用旋转组合试验设计及结果1)
Table 3 Design and results for quadratic general rotary composite
试验号
Test No.θ/℃ 接种量(φ)/ %
Inoculation concentration装液量/mL
Liquid volume抑菌圈直径/mm
Inhibition zone diameter1 30(1) 5(1) 60(1) 28.30 2 30(1) 5(1) 40(−1) 28.37 3 30(1) 2(−1) 60(1) 27.80 4 30(1) 2(−1) 40(−1) 27.93 5 26(−1) 5(1) 60(1) 28.73 6 26(−1) 5(1) 40(−1) 28.87 7 26(−1) 2(−1) 60(1) 28.40 8 26(−1) 2(−1) 40(−1) 28.57 9 24.6(−1.682) 3.5(0) 50(0) 26.88 10 31.4(1.682) 3.5(0) 50(0) 27.00 11 28(0) 0.977(−1.682) 50(0) 28.80 12 28(0) 6(1.682) 50(0) 29.23 13 28(0) 3.5(0) 33.2(−1.682) 28.53 14 28(0) 3.5(0) 66.8(1.682) 28.87 15 28(0) 3.5(0) 50(0) 28.80 16 28(0) 3.5(0) 50(0) 28.93 17 28(0) 3.5(0) 50(0) 29.20 18 28(0) 3.5(0) 50(0) 29.13 17 28(0) 3.5(0) 50(0) 29.00 18 28(0) 3.5(0) 50(0) 28.90 1) 括号中的数值为编码值
1) Numbers in the brackets are coded values
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表 4 三元二次通用旋转组合试验结果方差分析
Table 4 Analysis of variance for results from quadratic general rotary united design
来源 Source SS DF MS PCC F P X1 0.283 6 1 0.283 6 −0.515 4 3.617 2 0.086 4 X2 0.385 1 1 0.385 1 0.573 9 4.910 4 0.051 0 X3 0.000 3 1 0.000 3 0.018 9 0.003 6 0.953 5 X12 6.406 3 1 6.406 3 −0.943 9 81.696 5 0.000 1 X22 0.064 5 1 0.064 5 0.275 6 0.822 2 0.385 9 X32 0.028 5 1 0.028 5 −0.187 3 0.363 6 0.559 9 X1X2 0.012 0 1 0.012 0 0.122 8 0.153 2 0.703 7 X1X3 0.001 5 1 0.001 5 0.043 9 0.019 3 0.892 3 X2X3 0.001 0 1 0.001 0 0.035 9 0.012 9 0.911 8 回归 Regression 7.349 1 9 0.816 6 10.413 2 0.000 8 残差 Residual 0.784 2 10 0.078 4 失拟 Lack of fit 0.541 6 5 0.108 3 2.233 2 0.130 9 误差 Error 0.242 5 5 0.048 5 总和 Total 8.133 2 19 1) X1、X2 和 X3 分别表示温度、接种量和装液量；PCC 为偏相关系数
1) X1，X2 andX3 represent temperature，inoculation concentration and liquid volume, respectively; PCC is patial correlation coefficient
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表 5 各变量取值频率分布
Table 5 Frequency distribution of variable value
水平
Levelθ 接种量 Inoculation concentration 装液量 Liquid volume 次数 Times 频率 Frequency 次数 Times 频率 Frequency 次数 Times 频率 Frequency −1.682 0 0.000 5 0.143 7 0.200 −1.000 10 0.286 5 0.143 7 0.200 0.000 25 0.714 5 0.143 7 0.200 1.000 0 0.000 10 0.286 7 0.200 1.682 0 0.000 10 0.286 7 0.200
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