Immobilization of lipase on macroporous resin by adsorption-crosslinking method
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摘要:目的
为基于大孔树脂吸附结合环氧交联剂交联法固定脂肪酶等工业用酶奠定基础。
方法使用大孔树脂吸附，而后环氧交联剂交联的方法进行脂肪酶的固定化，研究各因素对吸附–交联固定化的影响，并采用响应面法对固定化条件进行优化，制备固定化酶并考察其稳定性。
结果筛选出大孔树脂HPD750为载体，聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂。最佳固定化条件为：吸附温度45 ℃，给酶量60 mg·g–1，交联温度30 ℃，交联时间12.5 h，pH6.36，交联剂体积分数为0.7%。由上述条件制备所得的固定化酶活力为565.31 U·g–1，酶活力回收率为32.16%。与游离酶相比，固定化酶的热稳定性和酸碱稳定性均有明显提升；连续操作10次，固定化酶活力仍保留34.86%，操作稳定性较好；4 ℃条件下储存30 d，固定化酶活力仍保留64.81%。
结论大孔树脂HPD750为载体，聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂制备的固定化脂肪酶热稳定性、酸碱稳定性均得到显著提升，且具有良好的操作及储存稳定性。
Abstract:ObjectiveTo provide a basis for immobilization of industrial enzymes such as lipase using macroporous resin for adsorption and epoxy crosslinker for crosslinking.
MethodThe immobilization of lipase was performed through adsorption using macroporous resin as the carrier and epoxy crosslinker as the crosslinking agent. We investigated the effects of different factors on adsorption-crosslinking immobilization, and used response surface design to optimize the immobilization conditions. The immobilized enzyme was prepared and its stability was investigated.
ResultMacroporous resin HPD750 was selected as the carrier, and poly (ethylene glycol) diglycidyl ether was selected as the crosslinker. The optimal conditions of lipase immobilization were as follows: Adsorption temperature 45 ℃, enzyme addition amount 60 mg·g–1, crosslinking temperature 30 ℃, crosslinking time 12.5 h, pH6.36, and comcentration of crosslinking agent 0.7%. Under these optimized conditions, the immobilized lipase activity was 565.31 U·g–1 and the recycled rate of lipase activity was 32.16%. Compared with free lipase, the immobilized lipase exhibited obviously better thermal stability and pH stability. The immobilized lipase was of good operation stability and remained 34.86% of the original activity after repeated usage for 10 times. The immobilized lipase also exhibited good storage stability and remained 64.81% of the original activity after storage at 4 ℃ for 30 days.
ConclusionUsing macroporous resin HPD750 as the carrier and poly (ethylene glycol) diglycidyl ether as the crosslinker, the immobilized enzyme has significantly improved thermal stability and pH stability, and it also exhibits good operation stability and storage stability.
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土壤有机碳是土壤肥力评价的一项重要指标[1]。Lefroy等[2]将能被333 mmol·L–1 KMnO4氧化的有机碳称为活性有机碳，不能被氧化的称为非活性有机碳，并提出用土壤碳库管理指数(CPMI)来表征土壤管理措施引起的土壤有机碳变化。活性有机碳是占土壤有机碳中比例较小而周转速率较快的部分，在土壤有机碳中对环境的变化最敏感，可以指示土壤有机碳的早期变化[3]。因此土壤有机碳和活性有机碳在维持土壤肥力及土壤碳贮量变化方面具有重大意义[4]。
由于大量施用化学氮肥，加快了土壤原有有机碳的消耗，使积累在土壤中的有机碳总量减少[5]。土壤水分会影响土壤有机碳的变化，当土壤水分不足时，会导致土壤通气性加强，促进土壤呼吸作用和有机碳矿化分解，从而降低土壤有机碳含量[6-7]。唐首锋等[8]研究表明，在0~15和15~30 cm土层，3种灌溉处理土壤有机碳含量表现为滴灌>渗灌>沟灌。此外，土壤酶参与了土壤有机碳的分解和转化过程，其活性高低可反映土壤有机碳转化强弱[9]。
广西赤红壤面积达503万hm2，占土地总面积的21.25%[10]。广西大部分地区虽然年降雨量充沛，但是常出现季节性干旱，而滴灌施肥是将施肥与滴灌结合在一起的一项农业新技术，已被广泛应用[11]。赤红壤的酸碱缓冲能力相对较弱，邓兰生等[12]在研究滴灌施氮对赤红壤酸化的影响中发现，滴施尿素、硫酸铵、硝酸铵后赤红壤各土层pH均有一定程度地下降，下降幅度为：硫酸铵>硝酸铵>尿素。徐明岗等[13]研究发现，施肥对红壤活性有机质组分的影响显著。因此，在不同水肥条件下，研究赤红壤有机碳的变化对土壤碳库的影响有重要意义。
为探索有利于赤红壤碳库管理的滴灌施氮模式，本研究通过模拟滴灌系统的盆栽试验，研究了不同滴灌方式和施氮处理对土壤有机碳和活性有机碳含量、碳库管理指数和酶活性的影响，并分析土壤有机碳含量、活性有机碳含量、碳库管理指数和酶活性的关系，以期为赤红壤农田固碳的水肥管理提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验地点与材料
试验在广西大学农学院网室进行，该网室可以透光、通风、遮雨，网室内光照、温度和湿度等环境因素与室外基本一致。供试土壤为赤红壤，采自广西大学农科教学实习基地，经风干、碾碎，过5 mm筛，pH5.32，碱解氮31.55 mg·kg–1(1 mol·L–1NaOH扩散法)，速效磷33.26 mg·kg–1(0.5 mol·L–1NaHCO3法)，速效钾100.32 mg·kg–1(0.5 mol·L–1 NH4OAc法)，田间持水量为29.5%。供试玉米Zea mays L. 品种为‘家甜糯11’。
1.2 试验方法
在聚乙烯塑料桶(上部开口内径35 cm，底部内径26 cm，高29 cm)中部用塑料薄膜隔开，以防两侧水分交换，薄膜两侧各装风干土10 kg，每桶共装风干土20 kg，塑料桶上缘薄膜中部各剪一个小口，种植已催芽的玉米。
设3种滴灌方式和5种施氮处理，完全方案设计，共15个处理，每个处理重复3次，共45盆，随机区组排列。滴灌方式设常规滴灌(CDI，每桶2个滴头分别对玉米植株两侧土壤灌水或灌水施肥)、交替滴灌(ADI，本次用1个滴头对植株其中一侧土壤灌水或灌水施肥，下次用另一个滴头对植株另一侧土壤进行灌水或灌水施肥，如此交替进行)和固定滴灌(FDI，每次用1个滴头固定对玉米植株一侧土壤灌水或灌水施肥，另一侧土壤则不灌水或不灌水施肥)。试验期间，加肥料时，事先按设计要求配好肥料溶液，肥料溶液注入模拟滴灌系统的输液袋，将输液袋挂在距地面2 m高处，溶液由塑料软管导出，经软管由滴头滴入土壤中，滴头距离植株根系15 cm，流速为0.7 L·h–1。不加肥料时，按上述方法只灌自来水。
试验设5个施氮处理，分别用N0、N1、N2、N3和N4表示，除N0处理不施氮肥外，N1~N4处理总施氮量均为0.20 g·kg–1，追施氮量依次按0、100%、90%、80%和70%的总施氮肥比例进行，具体追施氮量分别为0、0.20、0.18、0.16、0.14 g·kg–1。除N0不追施氮肥外，其余处理按上述灌水施肥方法，通过输液袋进行滴灌施氮。其中苗期施氮占滴灌施氮量的30%，穗期占40%，花粒期占30%，每个时期平均分2次施入，共计6次。N肥作追肥的比例、方式和日期按表1实施。N2、N3和N4处理中，部分氮肥用作基肥，所有处理的P肥(0.15 g·kg–1)和K肥(0.20 g·kg–1)全部作基肥，装盆时与土壤混匀。氮肥用尿素(N质量分数为46%)，磷肥用磷酸二氢钾(P2O5质量分数为 52%)，钾肥用磷酸二氢钾(K2O质量分数为 34%)和氯化钾(K2O质量分数为 60%)。
表 1 甜糯玉米各处理滴灌施氮情况Table 1. Drip nitrogen fertigation of different treatments for sweet-waxy maize处理
Treatment滴灌施 N 量/(g·kg–1)
Amount of drip
irrigated N占 N 总量比例/%
Percentage of drip irrigated
N in total N applied各追肥日期的 N 肥比例1)/%
Percentage of N applied at different topdressing dates04-30 05-20 05-31 06-07 06-17 06-26 N0 0 0 0 0 0 0 0 0 N1 0.20 100 15 15 20 20 15 15 N2 0.18 90 15 15 20 20 15 15 N3 0.16 80 15 15 20 20 15 15 N4 0.14 70 15 15 20 20 15 15 1) 04-30、05-20：拔节期；05-31、06-07：孕穗期；06-17、06-26：花粒期
1) 04-30, 05-20: Jointing stage; 05-31, 06-07: Booting stage; 06-17, 06-26: Flowering-maturing stage1.3 试验管理
4月6日，按照试验设计将土壤、部分氮肥和全部P、K肥混匀装入试验桶，4月7日每桶播4粒已催芽的玉米种子，长到“四叶一心”时，间苗定苗，每桶留长势均匀的玉米苗1株。4月27日(播后20 d)，对供试玉米进行控水处理，常规滴灌土壤水分下限为田间持水量的70%，上限为田间持水量的80%，当含水量降至或接近该处理水分下限时进行灌水，灌水至水分控制上限。根据作物生长和天气情况，每隔1~2 d于下午称量CDI处理桶质量，用水量平衡法确定所需的灌水量。ADI和FDI各施N处理每次灌水量按常规滴灌相应施N处理灌水量的80%进行滴灌。每次灌水量用量筒量取，并记录各处理灌水量。7月11日试验结束。
1.4 测定项目及方法
1.4.1 土壤碳库测定
土壤有机碳(SOC)用高温外加热重铬酸钾氧化−容量法测定[14]；土壤活性有机碳(LOC)用浓度333 mmol·L–1的高锰酸钾氧化土样，并测D565 nm值[15]。
本试验将不施N肥处理土壤(N0)作为对照土壤。碳库指数及碳库管理指数等相关指标参照徐明岗等[16]的方法计算，计算公式如下：
非活性有机碳含量 = 有机碳含量−活性有机碳含量， (1)
碳库指数 (ICP) = 土壤有机碳含量/参考土壤有机碳含量， (2)
碳库活度 (A) = 活性有机碳含量/非活性有机碳含量， (3)
碳库活度指数 (IA) = 碳库活度/参考碳库活度， (4)
碳库管理指数 (ICPM) = 碳库指数/碳库活度指数×100。 (5)
1.4.2 土壤酶活性测定
过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法测定，脲酶活性用苯酚−次氯酸钠比色法测定，转化酶活性用3,5−二硝基水杨酸比色法测定[17]。
1.5 数据处理
显著性检验用方差分析法，方差分析包括不同施氮处理、滴灌方式以及两者间的交互效应，分析结果用P值表示(P<0.05，显著；P<0.01，极显著；P>0.05，不显著)，用SPSS 20.0软件进行分析。多重比较采用Duncan’s法。用Pearson法分析了土壤有机碳含量、活性有机碳含量和碳库管理指数与酶活性的相关性系数。
2. 结果与分析
2.1 不同滴灌方式和施氮处理对土壤碳库的影响
2.1.1 有机碳含量
由表2可知，滴灌方式对土壤有机碳(SOC)含量的影响极显著。与常规滴灌(CDI)相比，N2处理下，交替滴灌(ADI)土壤SOC含量比CDI方式提高9.7%，差异显著；与固定滴灌(FDI)相比，N1和N2处理下，ADI方式土壤SOC含量比FDI方式分别提高15.4%和18.8%，差异显著。
表 2 不同滴灌方式和施氮处理对土壤碳库的影响1)Table 2. Effects of different drip irrigation methods and nitrogen treatments on soil carbon pool施氮处理
Nitrogen treatment
(N)滴灌方式
Drip irrigation method
(DIM)w/(g·kg–1) 碳库活度
Activity of carbon
pool (A)碳库活度指数
Activity index of
carbon pool (IA)碳库指数
Carbon pool
index
(ICP)碳库管理指数
Carbon pool management
index (ICPM)有机碳
Soil organic carbon活性有机碳
Labile organic carbonN0 CDI 10.62±0.04h 0.85±0.06fgh 0.09±0.01cdefg 1.00±0bc 1.00±0g 100.00±0g ADI 10.94±0.10gh 0.97±0.05def 0.10±0.01bcde 1.00±0bc 1.00±0g 100.00±0g FDI 10.43±0.04h 0.76±0.02h 0.08±0efg 1.00±0bc 1.00±0g 100.00±0g N1 CDI 12.92±0.07cdef 1.10±0.01cde 0.09±0bcdef 1.09±0.09abc 1.22±0.01cdef 132.20±11.40cde ADI 14.20±0.84bc 1.33±0.03b 0.10±0.01bcd 1.08±0.14abc 1.30±0.08bcd 138.54±9.80bcd FDI 12.30±0.16efg 0.92±0.03fgh 0.08±0.01efg 1.03±0.05bc 1.18±0.02def 120.99±4.72cdef N2 CDI 15.02±0.03b 1.49±0.06b 0.11±0.01ab 1.27±0.05a 1.41±0ab 179.50±6.96a ADI 16.48±0.42a 1.80±0.05a 0.12±0a 1.27±0.04a 1.51±0.05a 190.49±6.95a FDI 13.87±1.16bcd 1.16±0.06c 0.09±0bcdef 1.17±0.09ab 1.33±0.12bc 154.44±3.65b N3 CDI 13.49±0.60cde 1.13±0.10cd 0.09±0.01cdefg 1.06±0.06bc 1.27±0.05cd 133.77±2.31cde ADI 13.82±0.41bcd 1.34±0.02b 0.11±0abc 1.10±0.04abc 1.26±0.04cd 139.63±8.93bc FDI 12.78±0.07def 0.89±0.06fgh 0.07±0.01g 0.95±0.06c 1.23±0cde 116.61±7.15efg N4 CDI 11.61±0.10fgh 0.95±0.04efg 0.09±0defg 1.02±0.05bc 1.09±0.01efg 112.01±5.25fg ADI 12.15±0.20efg 1.15±0.08c 0.10±0.01bcd 1.08±0.03abc 1.11±0.01efg 119.49±2.42defg FDI 11.32±0.10gh 0.80±0.04gh 0.08±0fg 0.96±0.05bc 1.09±0.01fg 104.87±6.38fg P N < 0.001 < 0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 DIM < 0.001 < 0.001 <0.001 0.104 0.045 <0.001 N×DIM 0.042 0.053 0.914 0.978 0.607 0.319 1) 表中数据为平均值±标准误，同列数据后的不同小写字母表示差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)
1) The values in the table are mean ± standard error, and different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test)施氮处理对SOC含量的影响极显著。与N0相比，N1~N3处理的SOC含量均显著提高。CDI方式下，N2处理的SOC含量比其他施氮处理提高11.3%~41.4%；ADI方式下，N2处理的SOC含量较其他施氮处理提高16.1%~50.6%；FDI方式下，N2处理的SOC含量较N0、N1和N4处理分别提高33.0%、12.8%和22.5%。
施氮处理与滴灌方式的交互作用对SOC含量的影响显著，此外，不同处理相比，以N2-ADI处理的SOC含量最高。
2.1.2 活性有机碳含量
表2表明，滴灌方式对土壤活性有机碳(LOC)含量有极显著的影响。与CDI方式相比，N1~N4处理时ADI方式的土壤LOC含量提高18.6%~21.1%，差异显著；与CDI方式相比，N1~N3处理时FDI方式的土壤LOC含量降低16.4%~22.1%，差异显著。
施氮处理对土壤LOC含量的影响极显著。与N0处理相比，CDI方式时N1~N3处理的土壤LOC含量提高29.4%~43.0%，FDI方式时N2处理的土壤LOC含量提高52.6%，ADI方式时N1~N4处理的LOC含量提高18.6%~85.6%，差异均显著。
施氮处理与滴灌方式的交互作用对土壤LOC含量的影响不显著。
此外，不同处理相比，以N2-ADI处理的土壤LOC含量最高。
2.1.3 碳库管理指数
由表2可知，滴灌方式对碳库活度指数的影响不显著，而对碳库活度、碳库指数和碳库管理指数的影响显著或极显著。与FDI方式相比，N1~N3处理时ADI方式的土壤碳库活度提高25.0%~57.1%，N2和N3处理时ADI方式的碳库管理指数分别提高23.3%和19.7%。
施氮处理对碳库活度、碳库活度指数、碳库指数和碳库管理指数均有极显著的影响。与N0处理相比，ADI方式时N2处理的土壤碳库活度提高20.0%，CDI方式时N1~N3处理的碳库管理指数提高32.2%~79.5%，ADI方式时N1、N2和N3处理的碳库管理指数分别提高38.5%、90.5%和39.6%，FDI方式时N1和N2处理的碳库管理指数分别提高21.0%和54.4%，均达显著水平。
此外，不同处理相比，N2-ADI处理的土壤碳库管理指数最高。
2.2 不同滴灌方式和施氮处理对土壤酶活性的影响
2.2.1 过氧化氢酶活性
由表3可知，滴灌方式和施氮处理对土壤过氧化氢酶活性均有极显著的影响。与CDI方式相比，N2处理时ADI方式的土壤过氧化氢酶活性提高12.3%，差异显著。
表 3 不同滴灌方式和施氮处理对土壤酶活性的影响1)Table 3. Effects of different drip irrigation methods and nitrogen treatments on enzyme activities in soil施氮处理
Nitrogen treatment
(N)滴灌方式
Drip irrigation method
(DIM)过氧化氢酶活性/
(mL·g–1)
Catalase activity脲酶活性/
(mg·kg–1·d–1)
Urease activity转化酶活性/
(mg·g–1·d–1)
Invertase activityN0 CDI 1.45±0.04c 0.69±0.09bc 11.18±1.88bc ADI 1.58±0.03bc 0.73±0.03abc 11.88±0.80abc FDI 1.44±0.04c 0.61±0.02c 9.80±0.74c N1 CDI 1.60±0.01bc 0.77±0.05abc 13.83±1.34abc ADI 1.74±0.12b 0.84±0.05ab 14.38±1.07ab FDI 1.57±0.06bc 0.70±0.04bc 12.91±0.25bc N2 CDI 1.79±0.07b 0.82±0.01abc 16.03±1.79abc ADI 2.01±0.04a 0.92±0.01a 17.26±1.11a FDI 1.72±0.08b 0.77±0.04abc 14.43±1.07abc N3 CDI 1.63±0.07bc 0.72±0.11abc 15.06±1.30abc ADI 1.74±0.03b 0.77±0.09abc 15.71±0.98abc FDI 1.62±0.03bc 0.71±0.10abc 13.48±1.21abc N4 CDI 1.47±0.10c 0.67±0.06bc 13.41±1.69bc ADI 1.58±0.14bc 0.70±0.08bc 14.37±0.62bc FDI 1.43±0.04bc 0.63±0.06bc 13.21±1.33bc P N <0.001 0.016 <0.001 DIM <0.001 0.043 0.054 N×DIM 0.983 0.997 0.999 1) 表中数据为平均值±标准误，同列数据后的不同小写字母表示差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)
1) The values in the table are mean ± standard error, and different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s test)与N0相比，CDI方式时N2处理的土壤过氧化氢酶活性提高23.4%，ADI方式时N2处理的土壤过氧化氢酶活性提高27.2%，FDI方式时N2处理的土壤过氧化氢酶活性提高19.4%，均差异显著。
此外，不同处理相比，以N2-ADI处理的土壤过氧化氢酶活性最高。
2.2.2 脲酶活性
由表3可知，滴灌方式和施氮处理均对土壤脲酶活性的影响显著。其中，N2-ADI处理的土壤脲酶活性较N0-CDI显著提高33.3%。不同处理相比，以N2-ADI处理的土壤脲酶活性最高。
2.2.3 转化酶活性
由表3可知，施氮处理对土壤转化酶活性的影响极显著，而滴灌方式对土壤转化酶活性的影响不显著。N2-ADI处理的土壤转化酶活性较N0-CDI处理显著提高54.4%。不同处理相比，以N2-ADI处理土壤转化酶活性最高。
2.3 土壤碳库和土壤酶活性的关系
由表4可知，土壤有机碳、活性有机碳含量和碳库管理指数与3种土壤酶活性之间的相关性均达0.01显著水平，说明土壤碳库的变化与土壤酶活性大小关系密切。
表 4 土壤碳库指标与土壤酶活性的相关性1)Table 4. Correlation between carbon pool index and enzyme activity in soil指标
Index过氧化氢酶活性
Catalase activity脲酶活性
Urease activity转化酶活性
Invertase activity土壤有机碳含量 Soil organic carbon content (SOC) 0.669** 0.595** 0.628** 活性有机碳含量 Labile organic carbon content (LOC) 0.755** 0.533** 0.651** 碳库管理指数 Carbon pool management index (ICPM) 0.750** 0.545** 0.620** 1) “**” 表示相关性达到 0.01 的显著水平，r0.01=0.372 1，n=45
1) “**” indicates significant correlation at P<0.01 level,r0.01=0.372 1, n=453. 讨论与结论
3.1 施氮处理对土壤碳库的影响
土壤碳库的微小变化对整个大气的CO2浓度甚至全球的碳平衡产生重大影响，在某种程度上甚至可以认为，大气CO2浓度的高低取决于土壤碳库的变化[18]，因此正向培育土壤碳库具有重大的现实意义。有研究表明，适量施用无机氮肥较不施肥处理使土壤碳储量平均增加21 t·hm–2[19]。李亚杰[20]发现，滴灌条件下适量增施氮肥可以增加土壤SOC含量。李玲等[21]研究表明，6年单施氮肥能明显提高坡旱地土壤有机碳含量，比不施肥平均增加14.8%，因为施氮促进了作物生长并因此带来了更多的土壤碳输入[22]。此外，Russell等[23]研究表明，施用氮肥一方面可以促进土壤中作物残体的腐殖化作用，以此来增加土壤有机碳含量，另一方面也可以加速碳的矿化作用，以减少土壤有机碳的含量。与以往研究结果相似，本试验表明，与不施氮处理N0相比，ADI方式时N1~N4处理的LOC含量提高18.6%~85.6%，差异均显著，N1~N3处理的SOC含量均显著提高，N4处理有所提高，但未达显著水平，表明不同滴灌施氮量对土壤碳库有一定的影响。这可能是因为滴灌施氮影响了土壤微生物的活性与功能，也有可能是不同滴灌施氮量对土壤碳的矿化程度不同，改变了土壤中碳的循环与转化，但其生物学机理还需要进一步研究。
3.2 滴灌方式对土壤碳库的影响
本研究表明，与常规滴灌相比，交替滴灌能显著提高土壤活性有机碳含量。以往研究也发现，交替滴灌有利于土壤有机碳的积累[24]和可溶性有机碳的活性[25]。王金凤等[26]研究发现，由于交替灌溉使两侧根区土壤处于交替干燥和湿润状态，在提供生命活动所需水分的同时，使根区土壤处于良好的通气状态，为土壤微生物提供了有益的生存条件，与本研究结果相对应，因此交替滴灌方式较常规滴灌和固定滴灌更有利于土壤碳的固持。
3.3 土壤碳库与酶活性的相关性
土壤酶活性是评价土壤肥力状况的重要指标[27]。脲酶对土壤氮素循环的促进作用具有重要意义；过氧化氢酶可以氧化对生物体(包括土壤)有危害的具有很强氧化作用的过氧化氢，常用以表征土壤的氧化强度；转化酶又称蔗糖酶，对土壤中碳素转化以及土壤有机碳含量的变化均有重要的作用[28-29]。有研究显示，与常规滴灌相比，交替滴灌在不同时期可提高其湿润区土壤转化酶、脲酶和过氧化氢酶活性[30-31]。
张笑培等[32]发现，土壤有机碳含量与土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性呈极显著或显著相关。张静等[33]在不同土地利用方式下赤红壤生物学性状及其与土壤肥力的关系研究中发现，土壤有机碳含量与脲酶和转化酶活性均呈极显著正相关，与本研究的结果相似。然而，文月荣[34]在不同植被恢复模式下煤矿排土场土壤碳库管理指数与土壤酶活性的研究结果显示，土壤有机碳含量与脲酶活性之间关系不显著，土壤有机碳含量与过氧化氢酶活性呈极显著的负相关关系，与本试验结果有所不同。这可能是不同土壤类型下土壤酶活性不同，或交替滴灌条件下3种土壤酶活性总体较高的缘故，此外，还可能是土壤有机碳库变化较为缓慢，本研究前后时间相对较短造成的，因此，需要进一步研究。
3.4 结论
本试验条件下，与N0-CDI相比，N2-ADI处理土壤有机碳含量提高55.2%，活性有机碳含量提高111.8%，土壤碳库管理指数提高90.5%。此外，土壤有机碳含量、活性有机碳含量和碳库管理指数与土壤过氧化氢酶、脲酶、转化酶活性之间的关系显著。因此，滴灌施氮量0.18 g·kg–1结合交替滴灌处理是赤红壤碳库管理的最佳滴灌施氮模式。
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图 1 各因素对脂肪酶吸附固定化的影响
Figure 1. Influence of various factors on the adsorption immobilization of lipase
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图 2 不同交联剂的交联效果
Ⅰ：戊二醛，Ⅱ：乙二醇二缩水甘油醚，Ⅲ：聚乙二醇二缩水甘油醚，Ⅳ：新戊二醇二缩水甘油醚，Ⅴ：空白对照
Figure 2. The crosslinking effect of different crosslinker
Ⅰ: Glutaric dialdehyde, Ⅱ: Ethylene glycol diglycidyl ether, Ⅲ: Poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Ⅳ: Neopentyl glycol diglycidyl ether, Ⅴ: Blank control
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图 3 各因素对脂肪酶交联固定化的影响
Figure 3. Influence of various factors on the crosslinking immobilization of lipase
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图 4 各因素对固定化酶活力影响的响应面三维图
Figure 4. 3D response surface plots of the effects of various factors on immobilized enzyme activity
表 1 Plackett-Burman试验因素和水平
Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels
水平
Level给酶量/(mg·g–1)
Enzyme addition amountpH θ吸附/℃
Absorption temperaturet吸附/h
Absorption timeφ(交联剂)/%
Crosslinker
concentrationθ交联/℃
Crosslinking temperaturet交联/h
Crosslinking time–1 50 5.5 40 6 0.5 25 10 0 60 6.0 45 8 0.7 30 12 1 70 6.5 50 10 0.9 35 14 
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表 2 不同大孔树脂吸附固定化效果
Table 2 Absorption and immobilization effect of different macroporous resins
树脂类型
Resin type固定化酶活力/(U·g–1)
Immobilized enzyme activity脂肪酶吸附率/%
Lipase adsorption
rateAB-8 192.52±5.71 18.64 DA-201 271.06±7.58 82.82 D-101 220.59±7.78 60.58 D4020 247.16±9.52 92.36 HPD750 275.50±8.30 76.86 H103 80.36±9.38 78.29 NKA-9 112.28±9.31 67.05
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表 3 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 3 Plackett-Burman experimental design and result
序号
No.因素及水平 Factor and level 固定化酶活力/(U·g–1)
Immobilized enzyme
activity给酶量
Enzyme addition
amountφ(交联剂)
Crosslinker
concentrationθ吸附
Absorption
temperaturet吸附
Absorption
timeθ交联
Crosslinking
temperaturet交联
Crosslinking
timepH 1 –1 1 1 1 –1 –1 1 246.79 2 1 –1 1 1 –1 1 –1 276.53 3 1 1 –1 –1 –1 1 –1 307.52 4 –1 1 1 –1 1 1 –1 244.66 5 –1 –1 –1 1 –1 1 1 260.27 6 1 1 1 –1 –1 –1 1 230.77 7 –1 –1 –1 –1 –1 –1 –1 286.18 8 1 –1 1 1 1 –1 –1 247.72 9 1 –1 –1 –1 1 –1 1 276.55 10 1 1 –1 1 1 –1 –1 265.39 11 –1 –1 1 –1 1 1 1 290.17 12 –1 1 –1 1 1 1 1 258.68
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表 4 Plackett-Burman试验结果方差分析1)
Table 4 Analysis of variance for Plackett-Burman experimental result
来源 Source SS MS F P 模型 Model 5 103.70 729.10 9.11 0.024 8* 给酶量 Enzyme addition amount 26.20 26.20 0.33 0.597 9 φ(交联剂) Volume fraction of crosslinker 582.55 582.55 7.28 0.054 2 θ吸附 Absorption temperature 1 159.35 1 159.35 14.48 0.019 0* t吸附 Absorption time 539.62 539.62 6.74 0.060 3 θ交联 Crosslinking temperature 797.89 797.89 9.96 0.034 3* t交联 Crosslinking time 772.97 772.97 9.65 0.036 0* pH 1 225.13 1 225.13 15.30 0.017 4* 1) “*” 表示模型影响显著 (P<0.05)
1) “*” indicates the model has significant effect (P<0.05)
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表 5 Box-Behnken试验设计及结果1)
Table 5 Box-Behnken experimental design and result
序号 No. 因素及水平 Factor and level Y/(U·g–1) A B C D 1 0 0 1 –1 359.34 2 0 0 0 0 480.07 3 0 0 0 0 439.89 4 0 1 0 –1 254.92 5 0 0 0 0 468.56 6 0 1 0 1 263.72 7 1 1 0 0 238.19 8 0 0 0 0 470.06 9 0 0 1 1 371.04 10 1 0 –1 0 264.04 11 1 0 0 –1 285.73 12 –1 1 0 0 343.33 13 0 –1 0 –1 323.32 14 0 1 1 0 430.38 15 0 0 –1 1 370.96 16 0 –1 –1 0 417.08 17 1 0 1 0 297.53 18 1 –1 0 0 395.44 19 1 0 0 1 363.52 20 0 0 –1 –1 293.53 21 0 0 0 0 490.29 22 0 –1 0 1 438.15 23 –1 0 –1 0 345.04 24 –1 0 1 0 427.22 25 –1 –1 0 0 335.36 26 0 1 –1 0 285.00 27 –1 0 0 1 345.51 28 0 –1 1 0 370.19 29 –1 0 0 –1 384.46 1) A: θ吸附, B: pH, C: θ交联, D: t交联, Y: 固定化酶活力
1) A: Absorption temperature, B: pH, C: Crosslinking temperature, D: Crosslinking time, Y: Immobilized enzyme activity
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表 6 Box-Behnken模型方差分析1)
Table 6 Analysis of variance for Box-Behnken model
来源 Source SS MS F P 模型 Model 134 000.00 9 574.10 9.09 <0.000 1 A 9 434.34 9 434.34 8.96 0.009 7** B 17 941.33 17 941.33 17.04 0.001 0** C 6 535.67 6 535.67 6.21 0.025 9* D 5 275.21 5 275.21 5.01 0.042 0* AB 6 824.41 6 824.41 6.48 0.023 3* AC 592.68 592.68 0.56 0.465 5 AD 3 407.06 3 407.06 3.24 0.093 6 BC 9 241.94 9 241.94 8.78 0.010 3* BD 2 810.59 2 810.59 2.67 0.124 5 CD 1 080.11 1 080.11 1.03 0.328 3 A2 35 048.69 35 048.69 33.29 <0.000 1** B2 27 231.69 27 231.69 25.87 0.000 2** C2 14 795.74 14 795.74 14.05 0.002 2** D2 31 696.36 31 696.36 30.11 <0.000 1** 残差 Residual 14 738.24 1 052.73 失拟项
Lack of fit13 316.72 1 331.67 3.75 0.107 4 纯误差
Pure Error1 421.52 355.38 合计 Total 148 800.00 1) A：θ吸附，B：pH，C：θ交联，D：t交联；“*” 和 “**” 分别表示模型影响达到 0.05 和 0.01 的显著水平
1) A: Absorption temperature, B: pH, C: Crosslinking temperature, D: Crosslinking time; “*” and “**” indicate that the model effect reaches 0.05 and 0.01 significance levels, respectively
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百度学术
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