Immobilization of lipase on macroporous resin by adsorption-crosslinking method
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摘要:目的
为基于大孔树脂吸附结合环氧交联剂交联法固定脂肪酶等工业用酶奠定基础。
方法使用大孔树脂吸附，而后环氧交联剂交联的方法进行脂肪酶的固定化，研究各因素对吸附–交联固定化的影响，并采用响应面法对固定化条件进行优化，制备固定化酶并考察其稳定性。
结果筛选出大孔树脂HPD750为载体，聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂。最佳固定化条件为：吸附温度45 ℃，给酶量60 mg·g–1，交联温度30 ℃，交联时间12.5 h，pH6.36，交联剂体积分数为0.7%。由上述条件制备所得的固定化酶活力为565.31 U·g–1，酶活力回收率为32.16%。与游离酶相比，固定化酶的热稳定性和酸碱稳定性均有明显提升；连续操作10次，固定化酶活力仍保留34.86%，操作稳定性较好；4 ℃条件下储存30 d，固定化酶活力仍保留64.81%。
结论大孔树脂HPD750为载体，聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂制备的固定化脂肪酶热稳定性、酸碱稳定性均得到显著提升，且具有良好的操作及储存稳定性。
Abstract:ObjectiveTo provide a basis for immobilization of industrial enzymes such as lipase using macroporous resin for adsorption and epoxy crosslinker for crosslinking.
MethodThe immobilization of lipase was performed through adsorption using macroporous resin as the carrier and epoxy crosslinker as the crosslinking agent. We investigated the effects of different factors on adsorption-crosslinking immobilization, and used response surface design to optimize the immobilization conditions. The immobilized enzyme was prepared and its stability was investigated.
ResultMacroporous resin HPD750 was selected as the carrier, and poly (ethylene glycol) diglycidyl ether was selected as the crosslinker. The optimal conditions of lipase immobilization were as follows: Adsorption temperature 45 ℃, enzyme addition amount 60 mg·g–1, crosslinking temperature 30 ℃, crosslinking time 12.5 h, pH6.36, and comcentration of crosslinking agent 0.7%. Under these optimized conditions, the immobilized lipase activity was 565.31 U·g–1 and the recycled rate of lipase activity was 32.16%. Compared with free lipase, the immobilized lipase exhibited obviously better thermal stability and pH stability. The immobilized lipase was of good operation stability and remained 34.86% of the original activity after repeated usage for 10 times. The immobilized lipase also exhibited good storage stability and remained 64.81% of the original activity after storage at 4 ℃ for 30 days.
ConclusionUsing macroporous resin HPD750 as the carrier and poly (ethylene glycol) diglycidyl ether as the crosslinker, the immobilized enzyme has significantly improved thermal stability and pH stability, and it also exhibits good operation stability and storage stability.
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谷子Setaria italica又称为粟，去壳后称为小米，在植物学上属禾本科Gramineae狗尾草属Setaria，起源于8 700年以前中国的黄河流域，栽培历史悠久[1-2]。小米营养丰富，除了富含碳水化合物、蛋白质、脂肪三大营养素和多种维生素、矿物质等微量营养物质外，小米特有的黄色素和小米多酚具有预防癌症、抗氧化和抑菌等生理保健功能[3-6]。但是，小米中赖氨酸含量远低于FAO/WHO建议的理想水平，所以在开发食品时研究人员常用赖氨酸含量较高的大豆进行复配[7]。
随着社会生活节奏的逐渐加快，耗时耗力的传统蒸煮烹饪方式已经不能适应当代人们的需求，方便速食粥的开发就变得尤为重要。方便粥的加工方式主要有生化法、浸泡法、喷雾干燥法、超高压法和挤压膨化法等，其中挤压膨化法由于其方便高效、生产成本低廉而被广泛应用[8-12]。食品挤压膨化技术属于高温高压加工技术，特指利用螺杆挤压方式，通过压力、剪切力、摩擦力及加温等作用所形成的对于固体原料的破碎、捏合、混炼、熟化、杀菌、预干燥和成型等加工处理方式[13]。本文以小米复配大豆为原料，利用双螺杆挤压加工方式，研发出一种升糖指数(Glycemic index，GI)较低的小米方便粥，为挤压方便粥的工业化生产提供一定的理论依据，具有一定的现实指导意义。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
试验用小米购于甘肃省庆阳市农科院，小米的淀粉质量分数为66.10%(以干基计)，小米经粉碎机粉碎后，过80目筛，于−4 ℃贮存备用，试验用脱脂大豆粉购于新龙亚洲(龙口)大豆食品有限公司，试验用PI-3200真空上料系统、FM50-24型挤压机、FMFC-600型流化床系统和FMDR-400型烤箱均由湖南富马科食品工程技术有限公司生产。
1.2 小米蛋白质含量测定、必需氨基酸分析及氨基酸评分(Amino acid score，AAS)的计算
委托黑龙江省出入境检验检疫局检验检疫技术中心进行蛋白质含量及必需氨基酸的检测，其中蛋白质含量根据《GB 5009.5—2016》[14]的方法进行测定，苯丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸含量根据《GB 5009.124—2016》[15]的方法进行测定，色氨酸含量根据《GB/T 18246—2019》[16]的方法进行测定。AAS计算公式如下[17]：
$$ {\rm{AAS}} = \frac{{100\;{\rm{g}}{\text{样品中蛋白质氨基酸含量}}}}{{100\;{\rm{g\;FAO}}/{\rm{WHO}}{\text{的标准氨基酸含量}}}} {\text{。}}$$ 1.3 小米方便粥的制备及其性质测定
1.3.1 小米方便粥制备工艺流程
小米方便粥制备工艺流程如图1所示。
1.3.2 单因素试验设计
利用单因素试验分别考察挤压温度(80、100、120、140和160 ℃)、物料含水量(w为8%、30%、32%、34%和36%)、螺杆转速(200、220、240、260和280 r/min)以及焙烤温度(160、180、200、220和240 ℃)对方便粥的糊化度、升糖指数、复水率的测定和感官品质的影响。各因素固定工艺条件为挤压温度120 ℃、物料含水量(w)32%、螺杆转速240 r/min、焙烤温度200 ℃，产品在烤箱中滞留时间约为20 s。
1.3.3 响应面优化试验设计
根据单因素试验结果和Box-Benhnken中心组合试验的设计原理，选取挤压温度、物料含水量和螺杆转速3个影响因子，各取3个水平，进行因素水平共17个试验点的响应面分析试验，并运用Minitable 15数据统计分析软件进行数据分析，进而得到最佳生产工艺条件。
试验因素水平见表1。
表 1 试验因素水平表Table 1. Factor levels of the test水平
Level挤压温度/℃
Extrusion
temperature
(A)螺杆转速/
(r·min−1)
Screw speed
(B)w(水) /%
Moisture
content
(C)−1 120 180 30 0 140 200 33 1 160 220 36 1.3.4 升糖指数的测定
采用Ferrer-Mairal等[18]的方法测定样品升糖指数。准确称取方便粥样品0.1~0.2 g(含淀粉约50 mg，精确到0.001 g)加入到10 mL 浓度为0.1 mol/L的HCl-KCl缓冲液(pH 1.5)中，然后加入1 mg/mL的胃蛋白酶溶液0.2 mL，在40 ℃水浴锅中保温1 h，并不停搅拌。然后将水浴锅温度调至37 ℃，向其中加入15 mL PBS缓冲溶液(pH 6.9)和5 mL α−淀粉酶(2.6 U)，方便速食粥样品中的淀粉酶解反应开始，此反应在37 ℃条件下保温3 h，每0.5 h取样一次，每次取样1 mL，将取出的样液在100 ℃水中加热5 min 使酶灭活，然后冷却至室温，在3 000 r/min下离心10 min，取上清液。采用DNS 法测待测液中的葡萄糖浓度。以酶解反应时间为横坐标，以淀粉水解率为纵坐标，进行淀粉水解曲线的绘制。其中淀粉水解率(SR)为：
$$ {\rm{SR}} = \frac{{\left( {{C_{{t}}} - {C_0}} \right) \times 30.2 \times 0.9}}{{50}} \times 100{\text{%}} , $$ (1) 式中: Ct为在反应时间为t时反应溶液体系中葡萄糖质量浓度，mg/mL；C0为酶解反应开始时，即0 min时反应溶液体系中葡萄糖质量浓度，mg/mL；30.2为酶解反应初始体积，mL；0.9 为葡萄糖与淀粉的转化当量。
因为淀粉水解曲线方程符合一级反应方程，也就是葡萄糖生成曲线符合一级反应方程，所以将淀粉水解曲线转换成葡萄糖生成曲线后，按下式计算酶解反应常数：
$$ {C_t} - {C_0} = {C_{\max }} \times \left( {1 - {{\rm{e}}^{ - kt}}} \right), $$ (2) 式中: Cmax为生成葡萄糖最大质量浓度，mg/mL；k为酶解反应常数，min−1。当算得酶解反应常数后，按照下式计算淀粉水解曲线下面积(AUC)：
$$ {\rm{AUC}} = {C_{\max }} \times \left( {{t_{\rm{f}}}{\rm{ - }}{t_0}} \right) - {{{C}}_{\max} } \times \frac{{1 - {{\rm{e}}^{ - k\left( {{t_{\rm{f}}}{\rm{ - }}{t_0}} \right)}}}}{k}, $$ (3) 式中: tf为酶解反应结束时间，min; t0为酶解反应开始时间，min。然后计算GI ：
$$ {\rm{GI}} = 0.862 \times {I_{{\rm{Sh}}}} + 8.189 = 0.862 \times \frac{{{\rm{AU}}{{\rm{C}}_{\text{方便粥}}}}}{{{\rm{AU}}{{\rm{C}}_{\text{白面包}}}}} + 8.198, $$ (4) 式中: ISh为淀粉水解指数；AUC方便粥为方便粥AUC；AUC白面包为白面包AUC。
1.3.5 复水率的测定
准确称取方便粥的成品米粒质量(m1/g)，置于烧杯中，加5倍沸水后立即加盖，复水5 min后立即沥干水分，并用滤纸滤干表面水分，称质量为(m2/g)，复水率则用m1/m2表示[19]。
1.3.6 感官评分的确定
邀请10名食品专业的老师和同学对复水后的方便粥进行感官评价，评价指标及分值参考《GB/T15682—2008稻谷、大米蒸煮食用品质感官评价方法》[20]。
1.4 数据分析
运用SPSS 20.0软件和Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行分析，采用Origin 8.0软件作图。
2. 结果与分析
2.1 原料必需氨基酸评分
经测定，原料小米的蛋白质质量分数为11.96%，含有人体必需的8种氨基酸，但其含量不成比例。原料小米的氨基酸评分如表2所示。其中色氨酸和亮氨酸评分较高，赖氨酸却严重不足。复配了30%(w)大豆粉后的小米粉的氨基酸评分如表2所示，符合FAO/WHO的标准模式[17]。
表 2 小米方便粥原料的必需氨基酸评分Table 2. The scores of essential amino acids in raw materials of millet instant porridge原料
Raw material异亮氨酸 Ile 甲硫氨酸 Met 苯丙氨酸 Phe 色氨酸Try 苏氨酸Thr 亮氨酸Lue 赖氨酸Lys 缬氨酸Val 小米 Millet 1.22 1.25 1.86 2.32 1.31 2.66 0.42 1.46 小米−大豆(w=10%) Millet-defatted soybean flour 1.28 1.19 1.81 2.11 1.34 2.42 0.63 1.41 小米−大豆(w=20%) Millet-defatted soybean flour 1.33 1.11 1.74 2.04 1.36 2.28 0.91 1.39 小米−大豆(w=30%) Millet-defatted soybean flour 1.37 1.05 1.63 1.97 1.40 2.13 1.16 1.36 2.2 小米方便粥加工参数单因素试验
2.2.1 挤压温度对小米方便粥品质的影响
挤压温度对方便粥品质的影响如图2所示，随着挤压温度的升高，样品的糊化度先升高后降低，最大值出现在140 ℃，此时糊化度为87.62%；样品的复水率也有相同的趋势，最大值也出现在140 ℃，此时复水率为329%；样品的升糖指数随着挤压温度的升高而升高，低温时升高较明显；挤压温度对产品的感官品质影响也比较大，感官品质得分随着挤压温度的升高而先升高后降低，低温时升高较明显。
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图 2 挤压温度对小米方便粥品质的影响相同指标柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 2. Effects of extrusion temperature on quality characteristics of millet instant porridgeDifferent lowercase letters above the same indicator columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s test)2.2.2 螺杆转速对小米方便粥品质的影响
螺杆转速对产品品质的影响如图3所示，开始时随着螺杆转速的增加物料的糊化度、复水率和升糖指数随之增加，这说明在低转速下剪切作用的增强有利于淀粉的糊化和复水，在螺杆转速达到200 r/min时，物料的糊化度、升糖指数和复水率均达到最大值，分别为84.22%，67.42和316%。随后，物料的糊化度、升糖指数和复水率随着螺杆转速的升高而迅速下降。随着螺杆转速的增加，感官评分呈先升高后降低的趋势，并在240 r/min时达到最佳。
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图 3 螺杆转速对小米方便粥品质的影响相同指标柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 3. Effects of screw speed on quality characteristics of millet instant porridgeDifferent lowercase letters on the same indicator columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s test)2.2.3 物料水分含量对小米方便粥品质的影响
物料水分含量对产品品质的影响如图4所示，随着进料水分的增加，糊化度先快速升高，在水分含量(w)为30%时糊化度达到83.56%，随后样品的糊化度升高不明显；升糖指数在含水量(w)为33%时达到最大值，随后略有降低；复水率在开始时随物料含水量升高而升高，含水量(w)为33%时达到最大值，随后降低，这是因为虽然物料含水量进一步升高，但是糊化度的升高导致产品黏性过大，反而使复水率有所下降；物料的水分含量越高产品的感官得分越高。
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图 4 物料含水量对小米方便粥品质的影响相同指标柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 4. Effects of moisture content of material on quality characteristics of millet instant porridgeDifferent lowercase letters on the same indicator columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s test)2.2.4 焙烤温度对小米方便粥品质的影响
焙烤是样品加工的最后一道工序，起到使样品二次膨化和干燥并延长样品货架期的重要作用，焙烤温度对产品品质的影响如图5所示。与其他加工条件相比焙烤温度对产品的糊化度、升糖指数和复水率影响不大，其分别为80.23%~83.56%、63.21~67.52和306%~312%，而对感官品质影响极大。
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图 5 焙烤温度对小米方便粥品质的影响相同指标柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 5. Effect of baking temperature on quality characteristics of millet instant porridgeDifferent lowercase letters on the same indicator columns indicated significant differences (P<0.05, Duncan’s test)2.3 小米方便粥加工工艺条件优化
为了得到更加精确的方便小米粥加工工艺条件，使用Design-Expert软件，设计了3因素3水平响应面分析试验，试验结果如表3所示。由表3可以看出，第1组试验条件下的糊化度最高，第3组试验条件下的升糖指数最低，第4组试验条件下的复水率最大，第17组试验条件下的感官评分最高。
表 3 方便粥加工工艺三因素三水平的响应面分析结果Table 3. Response surface analysis results of three factors and three levels of instant porridge processing technology序号
No.挤压温度/℃
Extrusion
temperature螺杆转速/(r·min−1)
Screw
speedw(水)/%
Moisture
content糊化度/%
Degree of
gelatinization升糖指数
Glycemic
index复水率/%
Rehydration
rate感官评分
Sensory
score1 160 200 36 92.15 77.54 328 87 2 140 200 33 88.06 80.97 332 91 3 140 220 36 91.41 56.88 316 94 4 120 220 33 84.67 60.02 334 89 5 140 200 33 85.31 81.27 328 93 6 120 200 30 85.56 72.25 326 86 7 140 200 33 85.36 81.24 333 90 8 120 200 36 86.25 70.56 315 88 9 160 180 33 85.24 74.23 325 87 10 120 180 33 83.06 64.31 320 87 11 140 180 30 87.62 67.58 321 90 12 140 200 33 85.29 80.52 327 91 13 140 200 33 85.27 80.97 332 92 14 140 220 30 85.47 77.12 329 90 15 160 200 30 84.22 80.62 327 80 16 160 220 33 84.06 66.31 331 87 17 140 180 36 91.52 66.12 316 95 通过Design-Expert软件，对方便小米粥的糊化度(Y1)、升糖指数(Y2)、复水率(Y3)和感官评分(Y4)进行回归分析，得到各自的二次回归方程，如表4所示。分析表4中的数据可知：糊化度(Y1)回归方程的显著性F值为10.55，对应的P为0.002 6(P<0.01)，说明此模型拟合性极显著；失拟项F为0.49，对应的P为0.710 5(P>0.05)，说明失拟性不显著，在试验范围内误差较小，回归模型与实际情况拟合程度很高。R2越接近1，模型拟合度越好，糊化度(Y1)回归方程的R2为0.934 1，表明此模型可以解释响应值93.41%的变化。综上所述，此模型方程可以很好地分析和预测糊化度指标。同理，对其他3个模型方程进行相应的分析，由表4结果可知，这3个模型方程也都可以对升糖指数、复水率和感官评价进行很好地预测和分析。
表 4 单指标回归方程及分析结果Table 4. Regression equation of single index and analysis result指标
Indicator模型方程1)
Model equationF P 失拟项 Lack of fit R2 F P 糊化度(Y1)
Degree of gelatinizationY1=85.86+0.77A−0.23B+2.31C−0.7AB+
1.81AC+0.51BC−1.78A2+0.18B2+3.97C210.55 0.002 6 0.49 0.710 5 0.934 1 升糖指数(Y2)
Glycemic indexY2=80.99+3.95A−1.36B−3.43C−0.91AB−
0.35AC−4.45BC−3.10A2−11.67B2−2.65C212.50 0.001 6 232.05 0.065 2 0.940 3 复水率(Y3)
Rehydration rateY3=345.60+0.5A−3.50B−5.00C−2.00AB−
2.00BC−8.80A2−9.30B2−15.80C241.18 <0.000 1 1.55 0.332 4 0.983 8 感官评分(Y4)
Sensory scoreY4=91.40−1.13A+0.13B+2.25C−0.50AB−
0.25BC−5.54A2+1.55B2−0.70C215.93 0.000 7 1.09 0.449 5 0.953 5 1)A：挤压温度/℃；B：螺杆转速/(r·min−1)；C：w(水)/%
1)A: Extrusion temperature; B: Screw speed; C: Moisture content另外，通过比较各模型方程回归系数绝对值的大小可以得出结论：挤压温度(A)、螺杆转速(B)、水分含量(C) 对糊化度(Y1) 影响程度的排序为C>A>B，对升糖指数 (Y2) 影响程度的排序为A>C>B，对复水率 (Y3) 影响程度的排序为C>B>A，对感官评分 (Y4) 影响程度的排序为C>A>B。
本文将这4个指标的重要性设置为1∶1∶1∶1。通过响应面试验最终获得糊化度较高、升糖指数较低、复水率较高并且感官评分较好的加工参数为：挤压温度144.53 ℃、螺杆转速220 r/min、w(水)35.12%。但考虑实际的加工情况，将最终的加工参数调整为：挤压温度145 ℃、螺杆转速220 r/min、w(水)35%、焙烤温度200 ℃。预测试验结果为：糊化度89.54%，升糖指数61.53，复水率324%，感官评分93。
以优化出的条件进行试验，重复3次，获得挤压方便粥的各项指标为：糊化度86.72%(与预测值相差3.14%)，升糖指数63.21(与预测值相差 2.73%)，复水率305% (与预测值相差6.05%)，感官评分93(与预测值吻合)。最终得到结果与预测较接近，说明通过模型得到的优化条件具有实用价值。
3. 讨论与结论
通过单因素试验可以看出：挤压温度在120~160 ℃范围内，产品的糊化度、复水率和感官评分达到最佳值，但是产品的升糖指数偏高。当挤压温度在100 ℃以下时，样品的糊化度仅为60%左右，不能达到作为速食粥的要求，所以选择120~160 ℃范围进行响应面试验；螺杆转速在180~220 r/min范围内产品的糊化度和复水率达到最佳值，升糖指数偏高，螺杆转速对产品感官品质影响不明显，所以综合考虑选择该螺杆转速范围进行响应面试验；w(水)为30%~36%范围内产品的糊化度、复水率和感官品质达到最佳值，升糖指数偏高，所以综合考虑选择该水分含量范围进行响应面试验；焙烤温度仅对产品的感官品质影响显著，在200 ℃时达到最佳，所以确定焙烤温度200 ℃对前3个因素进行响应面试验。
随着挤压温度的升高，产品的4个指标均有明显的升高。物料中淀粉的糊化是在适当的温度并吸收足够热量的条件下进行的，只有吸收了足够的热量，才能完成淀粉的糊化。但是机筒温度过高时可能会造成原料中的蛋白质与淀粉降解的糖发生美拉德反应，导致糊化度和复水率的降低，高温下产品过度膨化，产生裂纹会导致产品的感官品质降低[21]。随着螺杆转速的增加，产品的糊化度、升糖指数和复水率呈逐渐下降的趋势，这是由于螺杆转速的提高缩短了物料在挤压机机筒内的滞留时间，与剪切作用相比，滞留时间产生的作用占据了更主要的因素，这与王东[22]的研究基本一致。然而螺杆转速对产品的感官品质影响不明显，这可能是因为这些性质的变化对于产品的口感、气味等因素影响不明显，所以评价人员无法识别其中的差异所致。随着物料含水量的增加，产品的感官品质逐渐提高，这可能是由于物料的含水量越高，在高温作用下的产品外表较圆润，裂纹较少，所以有良好的外观和较好的适口性。改变焙烤温度，对产品的糊化度、升糖指数和复水率影响不明显，是因为产品在烤炉中停留时间较短，无法对产品内部产生大的影响[23]，而随着焙烤温度的升高，产品的色泽逐渐变黄加深，但是当温度高于200 ℃时产品色泽逐渐变为深褐色，并且产生焦糊等对产品不利的气味，所以对产品最终的感官品质影响极大。
目前，通过优化挤压工艺生产低升糖指数食品的研究还鲜有报道，所以挤压加工参数对食品升糖指数的影响机理还需更深入的研究。但近年来，有研究学者通过添加辅料的方式来实现降低食品的升糖指数。例如，蔡乔宇等[24]最新研究发现，挤压重组米可以通过添加0.35%(w)的芦丁或富铬酵母改善体外的消化情况，从而减缓糖的吸收；马艳丽等[25-26]揭示了白芸豆提取物(白芸豆α-AI)对α−淀粉酶的抑制作用机制，并将其应用到低升糖指数方便粥的研发当中，发现将白芸豆α−淀粉酶抑制剂按3.0%(w)的添加量添加到方便粥(燕麦粥、青稞粥和莲子粥)中，升糖指数显著降低。此外，在方便粥的生产工艺中加入乳化剂、增稠剂和营养物质(例如B族维生素)等添加剂可以获得具有更好感官品质和营养价值的方便粥产品，此类问题还有待于进一步研究。
本文采用单因素试验探讨工艺条件对挤压方便粥品质的影响后，通过响应面法进行挤压参数优化，得到最佳的加工工艺条件为：挤压温度145 ℃、螺杆转速220 r/min和水分含量35%(w)。以优化出的条件进行验证试验，获得挤压方便粥的各项指标为：糊化度86.72%，升糖指数63.21，复水率 305%，感官评分93分。低升糖指数小米方便粥的开发不但创新了小米的精深加工方式，丰富了方便谷物食品的种类，同时还会对肥胖和二型糖尿病的预防起到一定的积极作用。
致谢：感谢国家粮食和物资储备局科学研究院刘明博士和谷伊家(山东)食品有限公司给予的支持和帮助！
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图 1 各因素对脂肪酶吸附固定化的影响
Figure 1. Influence of various factors on the adsorption immobilization of lipase
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图 2 不同交联剂的交联效果
Ⅰ：戊二醛，Ⅱ：乙二醇二缩水甘油醚，Ⅲ：聚乙二醇二缩水甘油醚，Ⅳ：新戊二醇二缩水甘油醚，Ⅴ：空白对照
Figure 2. The crosslinking effect of different crosslinker
Ⅰ: Glutaric dialdehyde, Ⅱ: Ethylene glycol diglycidyl ether, Ⅲ: Poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Ⅳ: Neopentyl glycol diglycidyl ether, Ⅴ: Blank control
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图 3 各因素对脂肪酶交联固定化的影响
Figure 3. Influence of various factors on the crosslinking immobilization of lipase
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图 4 各因素对固定化酶活力影响的响应面三维图
Figure 4. 3D response surface plots of the effects of various factors on immobilized enzyme activity
表 1 Plackett-Burman试验因素和水平
Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels
水平
Level给酶量/(mg·g–1)
Enzyme addition amountpH θ吸附/℃
Absorption temperaturet吸附/h
Absorption timeφ(交联剂)/%
Crosslinker
concentrationθ交联/℃
Crosslinking temperaturet交联/h
Crosslinking time–1 50 5.5 40 6 0.5 25 10 0 60 6.0 45 8 0.7 30 12 1 70 6.5 50 10 0.9 35 14 
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表 2 不同大孔树脂吸附固定化效果
Table 2 Absorption and immobilization effect of different macroporous resins
树脂类型
Resin type固定化酶活力/(U·g–1)
Immobilized enzyme activity脂肪酶吸附率/%
Lipase adsorption
rateAB-8 192.52±5.71 18.64 DA-201 271.06±7.58 82.82 D-101 220.59±7.78 60.58 D4020 247.16±9.52 92.36 HPD750 275.50±8.30 76.86 H103 80.36±9.38 78.29 NKA-9 112.28±9.31 67.05
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表 3 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 3 Plackett-Burman experimental design and result
序号
No.因素及水平 Factor and level 固定化酶活力/(U·g–1)
Immobilized enzyme
activity给酶量
Enzyme addition
amountφ(交联剂)
Crosslinker
concentrationθ吸附
Absorption
temperaturet吸附
Absorption
timeθ交联
Crosslinking
temperaturet交联
Crosslinking
timepH 1 –1 1 1 1 –1 –1 1 246.79 2 1 –1 1 1 –1 1 –1 276.53 3 1 1 –1 –1 –1 1 –1 307.52 4 –1 1 1 –1 1 1 –1 244.66 5 –1 –1 –1 1 –1 1 1 260.27 6 1 1 1 –1 –1 –1 1 230.77 7 –1 –1 –1 –1 –1 –1 –1 286.18 8 1 –1 1 1 1 –1 –1 247.72 9 1 –1 –1 –1 1 –1 1 276.55 10 1 1 –1 1 1 –1 –1 265.39 11 –1 –1 1 –1 1 1 1 290.17 12 –1 1 –1 1 1 1 1 258.68
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表 4 Plackett-Burman试验结果方差分析1)
Table 4 Analysis of variance for Plackett-Burman experimental result
来源 Source SS MS F P 模型 Model 5 103.70 729.10 9.11 0.024 8* 给酶量 Enzyme addition amount 26.20 26.20 0.33 0.597 9 φ(交联剂) Volume fraction of crosslinker 582.55 582.55 7.28 0.054 2 θ吸附 Absorption temperature 1 159.35 1 159.35 14.48 0.019 0* t吸附 Absorption time 539.62 539.62 6.74 0.060 3 θ交联 Crosslinking temperature 797.89 797.89 9.96 0.034 3* t交联 Crosslinking time 772.97 772.97 9.65 0.036 0* pH 1 225.13 1 225.13 15.30 0.017 4* 1) “*” 表示模型影响显著 (P<0.05)
1) “*” indicates the model has significant effect (P<0.05)
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表 5 Box-Behnken试验设计及结果1)
Table 5 Box-Behnken experimental design and result
序号 No. 因素及水平 Factor and level Y/(U·g–1) A B C D 1 0 0 1 –1 359.34 2 0 0 0 0 480.07 3 0 0 0 0 439.89 4 0 1 0 –1 254.92 5 0 0 0 0 468.56 6 0 1 0 1 263.72 7 1 1 0 0 238.19 8 0 0 0 0 470.06 9 0 0 1 1 371.04 10 1 0 –1 0 264.04 11 1 0 0 –1 285.73 12 –1 1 0 0 343.33 13 0 –1 0 –1 323.32 14 0 1 1 0 430.38 15 0 0 –1 1 370.96 16 0 –1 –1 0 417.08 17 1 0 1 0 297.53 18 1 –1 0 0 395.44 19 1 0 0 1 363.52 20 0 0 –1 –1 293.53 21 0 0 0 0 490.29 22 0 –1 0 1 438.15 23 –1 0 –1 0 345.04 24 –1 0 1 0 427.22 25 –1 –1 0 0 335.36 26 0 1 –1 0 285.00 27 –1 0 0 1 345.51 28 0 –1 1 0 370.19 29 –1 0 0 –1 384.46 1) A: θ吸附, B: pH, C: θ交联, D: t交联, Y: 固定化酶活力
1) A: Absorption temperature, B: pH, C: Crosslinking temperature, D: Crosslinking time, Y: Immobilized enzyme activity
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表 6 Box-Behnken模型方差分析1)
Table 6 Analysis of variance for Box-Behnken model
来源 Source SS MS F P 模型 Model 134 000.00 9 574.10 9.09 <0.000 1 A 9 434.34 9 434.34 8.96 0.009 7** B 17 941.33 17 941.33 17.04 0.001 0** C 6 535.67 6 535.67 6.21 0.025 9* D 5 275.21 5 275.21 5.01 0.042 0* AB 6 824.41 6 824.41 6.48 0.023 3* AC 592.68 592.68 0.56 0.465 5 AD 3 407.06 3 407.06 3.24 0.093 6 BC 9 241.94 9 241.94 8.78 0.010 3* BD 2 810.59 2 810.59 2.67 0.124 5 CD 1 080.11 1 080.11 1.03 0.328 3 A2 35 048.69 35 048.69 33.29 <0.000 1** B2 27 231.69 27 231.69 25.87 0.000 2** C2 14 795.74 14 795.74 14.05 0.002 2** D2 31 696.36 31 696.36 30.11 <0.000 1** 残差 Residual 14 738.24 1 052.73 失拟项
Lack of fit13 316.72 1 331.67 3.75 0.107 4 纯误差
Pure Error1 421.52 355.38 合计 Total 148 800.00 1) A：θ吸附，B：pH，C：θ交联，D：t交联；“*” 和 “**” 分别表示模型影响达到 0.05 和 0.01 的显著水平
1) A: Absorption temperature, B: pH, C: Crosslinking temperature, D: Crosslinking time; “*” and “**” indicate that the model effect reaches 0.05 and 0.01 significance levels, respectively
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