Determination of trifloxystrobin and its metabolite in coffee by liquid chromatography-mass spectrometry
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摘要:目的
建立一种同时测定咖啡中肟菌酯及其代谢物肟菌酸残留量的液相色谱–质谱检测方法。
方法样品中待测农药组分采用含φ为1%乙酸的乙腈匀浆后超声提取，氯化钠和无水硫酸镁盐析及高速离心后，取上清液经C18分散固相萃取净化，采用液相色谱–质谱联用检测，ESI (+)电离和多反应监测(MRM)定量测定。
结果添加肟菌酯质量分数为0.01~2.00 mg·kg–1时，肟菌酯在咖啡全果中的添加回收率为87.8%~106.7%，相对标准偏差(RSD)为1.3%~5.8%；在咖啡豆中添加回收率为83.2%~88.1%，RSD为2.0%~6.2%。肟菌酸在咖啡全果中的添加回收率为71.5%~106.0%，RSD为1.0%~6.1%；在咖啡豆中的添加回收率为84.4%~105.2%，RSD为1.0%~5.2%。肟菌酯及肟菌酸在咖啡中的最小检出量均为2.5×10–12 g，最低检出限均为0.01 mg·kg–1。
结论该方法操作简便、快速和稳定，可以满足咖啡实际样品中肟菌酯及其代谢物肟菌酸的残留检测要求。
Abstract:ObjectiveTo develop a method for determining trifloxystrobin and its metabolite trifloxystrobin acid simultaneously in coffee by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
MethodThe sample was ultrasonically extracted with acetonitrile (including φ=1% acetic acid), and salted out with sodium chloride and anhydrous magnesium sulfate. After high-speed centrifugation, the supernatant was purified by C18 dispersive solid-phase extraction and detected by LC-MS. The quantitative determination was conducted by ESI (+) ionization mode and multi-reaction monitoring (MRM).
ResultThe recovery rates of trifloxystrobin in coffee fruits ranged from 87.8% to 106.7%, and the relative standard deviation (RSD) ranged from 1.3% to 5.8% when the additive amount of trifloxystrobin ranged from 0.01 to 2.00 mg·kg–1. The recovery rates of trifloxystrobin in coffee beans ranged from 83.2% to 88.1%, and the RSD ranged from 2.0% to 6.2%. The recovery rates of trifloxystrobn acid in coffee fruits ranged from 71.5% to 106.0%, and the RSD ranged from 1.0% to 6.1%. The recovery rates of trifloxystrobn acid in coffee beans ranged from 84.4% to 105.2%, and the RSD ranged from 1.0% to 5.2%. The minimum detectable amounts of both trifloxystrobin and trifloxystrobin acid in coffee were 2.5 × 10–12 g, and the minimum limits of quantitation were 0.01 mg·kg–1.
ConclusionThis method is simple, rapid and stable, and can meet the requirement for detecting the residues of trifloxystrobin and its metabolites in coffee samples.
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Keywords:
- trifloxystrobin /
- trifloxystrobin acid /
- LC-MS /
- pesticide residue /
- coffee
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肟菌酯(Trifloxystrobin)，化学名称为甲基(E)−甲氧基亚胺基−{(E)−α−[1−(α,α,α−三氟间甲苯基)亚乙基氨基氧基]邻甲苯基}乙酸乙酯，化学分子式为C20H19F3N2O4，相对分子质量为408.37，属甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，是一种呼吸链抑制剂，杀菌谱广，活性高，对子囊菌亚门Ascomycotina、担子菌门Basidiomycota、半知菌纲Deuteromycetes和卵菌纲Oomycetes真菌都具有良好的活性[1]。植物吸收肟菌酯后，会被代谢为肟菌酸(Trifloxystrobin acid，编号为CGA321113)，而肟菌酸毒性高于母体[2]。因此，有必要同时对其代谢物进行检测。美国规定，肟菌酯在咖啡豆中的农药最高残留限量(MRL)为0.02 mg·kg–1。我国暂未制定肟菌酯在咖啡中的MRL值。
目前，关于肟菌酯残留检测方法的报道较多，主要有液相色谱法[3-4]、气相色谱法[5-6]、液相色谱–串联质谱[7-8]及气相色谱–串联质谱法[9-10]等，也有关于同时检测肟菌酯和代谢物肟菌酸的研究[11-14]。但鲜见有同时检测咖啡中肟菌酯和代谢物肟菌酸的报道。本试验采用含φ为1%乙酸的乙腈超声提取，C18净化，液相色谱–质谱联用(LC-MS)测定，以期建立一种同时检测咖啡全果和咖啡豆样品中肟菌酯和代谢物肟菌酸残留的简便、快速、灵敏的分析方法。
1. 材料与方法
1.1 材料
肟菌酯标准品：纯度(φ)为98.7%，由Dr. Ehrenstorfer公司提供；肟菌酸标准品：纯度(φ)为99.6%，由Sigma-Aldich公司提供。
色谱级乙腈购自天津市富宇精细化工有限公司，分析级乙腈、C18净化剂和有机相针式尼龙过滤器(13 mm×0.22 μm)购自上海安谱实验科技股份有限公司。
Waters TS-Q三重四级杆质谱仪(美国Waters公司)；JY2002T电子天平(上海衡平仪器仪表厂)；KQ-500超声清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；SC-3612低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；D1008E掌上离心机(大龙兴创实验仪器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液和基质溶液的配制
准确称取10.1 mg(精确至0.1 mg)肟菌酯和肟菌酸标准品，用乙腈定容至10 mL，配成质量浓度为10 000 mg·L–1的标准储备液，–20 ℃保存，备用。使用时用乙腈逐级稀释成50、10、5、1、0.5 μg·L–1系列质量浓度的标准工作溶液，–20 ℃下保存，备用。将10 000 mg·L–1的标准储备液用咖啡全果和咖啡豆空白基质分别稀释成50、10、5、1、0.5 μg·L–1系列质量浓度的标准工作溶液，–20 ℃保存，备用。
1.2.2 样品前处理
准确称取5.0 g(精确至0.1 g)粉碎后的咖啡全果和咖啡豆样品，置50 mL离心管内，加入3 mL去离子水，再加入10 mLφ为1%乙酸的乙腈溶液，超声提取30 min；加1 g 氯化钠和2 g无水硫酸镁，超声溶解2 min，在3 500 r·min–1下离心3 min。取1 mL上清液置于预先装有20 mg C18的塑料离心管中，涡旋1 min，10 000 r·min–1离心1 min取上清液，经0.22 μm针式尼龙过滤器过滤，置于自动进样瓶中，上机检测。
1.2.3 液相色谱–质谱条件
色谱柱：Acquity UPLC BEH C18，2.1 mm×50 mm×1.7 µm；柱温30 ℃，进样量5 μL，色谱流动相条件见表1。电离方式：ESI(+)电离，多反应监测(MRM)定量测定；离子喷雾电压1.0 kV；锥孔气：氮气，150 L·h–1；离子源温度150 ℃；干燥气体：氮气，650 L·h–1，温度350 ℃；碰撞气体：氩气，0.25 mL·min–1。外标法定量，其他质谱条件见表2。
表 1 色谱条件Table 1. Chromatographic conditionst/min 流速/(mL·min–1)
Flow velocity流动相1)
Mobile phase0 0.3 60:40 0.5 0.3 60:40 3.0 0.3 20:80 4.0 0.3 20:80 5.0 0.3 60:40 1) V (乙腈)∶V(φ为0.2%的甲酸水溶液)
1) V (Acetonitrile)∶ V (0.2% Formic acid)表 2 肟菌酯和肟菌酸质谱条件Table 2. Mass spectrometry conditions of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid项目 Item 母离子 (m/z)
Parent ion子离子 (m/z)1)
Daughter ion保留时间/min
Retention time锥孔电压 /V
Cone voltage碰撞能量 /V
Collision energy肟菌酯 Trifloxystrobin 409.00 145.20* 2.94 30 40 409.00 186.00 2.94 30 16 肟菌酸 Trifloxystrobin acid 395.10 145.00* 2.36 35 38 395.10 186.20 2.36 35 14 1) “*”为定量离子
1) “*” was an ion for quantitative analysis1.2.4 添加回收试验
在咖啡全果空白样品中添加肟菌酯及其代谢物肟菌酸的标准溶液，添加的质量分数分别为0.01、0.05、0.50和2.00 mg·kg–1，每个水平重复5次；在咖啡豆空白样品中添加肟菌酯及其代谢物肟菌酸的标准溶液，添加的质量分数分别为0.01、0.05和0.50 mg·kg–1，每个水平重复5次，采用上述液相色谱−质谱联用分析方法测定回收率。在咖啡全果空白样品中添加质量分数为0.50和2.00 mg·kg–1时，因响应值超过线性范围，进样前分别稀释10和100倍；在咖啡豆空白样品中添加的质量分数为0.50 mg·kg–1时，因响应值超过线性范围，进样前稀释10倍。
2. 结果与分析
2.1 液相色谱条件的优化
采用梯度洗脱分离样品中的肟菌酯和肟菌酸，可以降低基质中杂质干扰，且可提高分离效果。通过比较甲醇−水、乙腈−水、甲醇−φ为0.2%甲酸水溶液、乙腈−φ为0.2%甲酸水溶液等不同的流动相，发现采用乙腈−φ为0.2%甲酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱时，2种农药均有较高的的灵敏度和分辨率，因此选用流动相为乙腈–φ为0.2%甲酸水溶液。
2.2 提取条件的选择
匀浆后的咖啡样品分别用甲醇、乙腈和丙酮作为溶剂进行提取，发现用甲醇和丙酮提取时，离心后分层不明显，上清液浑浊；用乙腈提取，离心后分层明显，且盐析效果好于前两者，有利于下一步的前处理，因此选择乙腈为提取溶剂。另外，由于肟菌酯在25 ℃中性和弱酸性条件下稳定，不易水解；在碱性条件下遇水转化成酸易离解成盐溶解于水中，且水解速率随pH的增加而增加[9]。故选择含有φ为1%乙酸的乙腈作为提取剂。在对样品进行超声提取时发现，肟菌酯和肟菌酸的提取率会随超声时间的延长而增加，但在超声30 min后，继续延长超声提取时间，肟菌酯和肟菌酸的提取率增长趋势并不明显，因此本试验选择30 min为超声提取时间。
2.3 样品净化条件的选择
咖啡中基质较复杂，且颗粒较细，油脂及色素等杂质含量较高[15]。本研究选用N–丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化碳黑粉(GCB)等净化剂进行试验，结果发现，PSA对目标物肟菌酸有较强的吸附作用；GCB对2种目标物均有较强的吸附作用，导致回收率偏低，达不到农药残留检测要求；而C18具有疏水作用，对非极性至中等极性的化合物具有吸附作用，且分离效果好，对pH具有较宽适应性。本试验采用C18作为净化剂，结果显示其具有良好的回收率(表3)，咖啡豆中肟菌酯的添加回收率为83.2%~88.1%，肟菌酸的添加回收率为84.4%~105.2%。咖啡豆添加样品色谱图见图1，肟菌酯出峰时间为2.94 min，肟菌酸出峰时间为2.36 min。
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图 1 肟菌酯和肟菌酸在咖啡豆样品中的液相色谱–质谱图Figure 1. Liquid chromatography-mass spectrometry maps of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid in coffee bean samples表 3 肟菌酯及肟菌酸在咖啡样品中的添加回收率 (RR)Table 3. The recovery rates (RR) of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid in coffee samples %样品 Sample w添加/
(mg·kg–1)
Additive肟菌酯
Trifloxystrobin肟菌酸
Trifloxystrobin acidRR RSD RR RSD 咖啡全果 Coffee fruit 0.01 87.8 5.8 71.5 6.1 0.05 106.7 3.1 99.7 2.9 0.50 97.9 5.2 106.0 3.0 2.00 90.5 1.3 92.0 1.0 咖啡豆 Coffee bean 0.01 86.9 6.2 86.2 5.1 0.05 83.2 2.0 84.4 1.0 0.50 88.1 5.3 105.2 5.2 2.4 标准曲线
在质量浓度为0.000 5~0.050 0 mg·L–1范围内，肟菌酯和肟菌酸的进样质量浓度(x)与色谱峰面积(y)之间呈较好的线性关系。肟菌酯的标准曲线为：y=60 000 000x+30 786，r=0.999 0；肟菌酸的标准曲线为：y=20 000 000x–3 732，r=0.999 8。肟菌酯在咖啡全果和咖啡豆中的保留时间分别为2.91和2.94 min；肟菌酸在咖啡全果和咖啡豆中的保留时间分别为2.31和2.36 min。
2.5 基质效应评价
咖啡样品中的油脂、糖、蛋白质和色素等杂质，会影响目标峰的色谱信号，造成基质效应。可通过基质匹配校准曲线和溶剂标准曲线斜率的对比，来评估基质效应的大小。如果斜率为0~±20%，表明样品存在弱基质效应；斜率在±20%~±50之间，则存在中等基质效应；斜率超过±50%之间，则为强基质效应[16]。利用不含目标分析物的空白基质的提取液来配制标准溶液，从而消除和补偿基质效应[17]。基质效应计算公式为：基质效应=[(基质斜率/溶剂斜率)–1]×100%。由表4可见，肟菌酯在咖啡全果中基质效应为25.28%，说明咖啡全果对肟菌酯的色谱响应存在增强基质效应，肟菌酯在咖啡豆中基质效应为–36.30%，说明咖啡豆对肟菌酯的色谱响应存在减弱效应；肟菌酸在咖啡中基质效应为49.05%~144.48%，表明咖啡中的杂质对肟菌酸的色谱信号有明显的基质增强效应。因此，本试验采用基质标准曲线来消除基质效应，以使肟菌酯和肟菌酸的残留测定获得更准确的结果。
表 4 肟菌酯和肟菌酸的基质标准曲线和溶剂效应Table 4. The matrix standard curve and solvent effect of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid目标物
Taget基质
Matrix线性方程1)
Linear equation相关系数
(R)斜率比
Slope ratio基质效应/%
Matrix effect肟菌酯
Trifloxystrobin乙腈 Acetoritrile y=24 725.3x+1 886.16 0.999 526 咖啡全果 Coffee fruit y=30 974.8x+24 869.2 0.990 944 1.25 25.28 咖啡豆 Coffee bean y=15 750.2x－670.587 0.994 495 0.64 –36.30 肟菌酸
Trifloxystrobin acid乙腈 Acetoritrile y=22 003.2x+745.203 0.998 879 咖啡全果 Coffee fruit y=53 794.7x－639.725 0.990 473 2.44 144.48 咖啡豆 Coffee bean y=32 796.6x－256.338 0.996 596 1.49 49.05 1) x：标准质量浓度，y：峰面积
1) x: Standard concentration, y: Peak area2.6 方法的添加回收率和精密度
添加回收率试验结果(表3)表明，当咖啡全果中添加肟菌酯或肟菌酸为0.01~2.00 mg·kg–1时，肟菌酯的添加回收率为87.8%~106.7%，RSD为1.3%~5.8%；肟菌酸的添加回收率为71.5%~106.0%，RSD为1.0%~6.1%。当咖啡豆中添加肟菌酯或肟菌酸为0.01~0.50 mg·kg–1时，肟菌酯的添加回收率为83.2%~88.1%，RSD为2.0%~6.2%；肟菌酸的添加回收率为84.4%~105.2%，RSD为1.0%~5.2%。肟菌酯和肟菌酸的最小检出量均为2.5×10–12 g，最低检出限均为0.01 mg·kg–1。测定结果均达到农药残留试验准则(NY-T 788—2004)[18]的要求。
3. 结论
本研究采用分散固相萃取净化–液质联用技术，建立了同时测定咖啡中肟菌酯及其代谢物肟菌酸残留的方法。样品用含φ为1%乙酸的乙腈超声提取，氯化钠和无水硫酸镁盐析后，C18吸附剂净化，液相色谱–质谱联用检测。该方法优化了样品前处理及LC-MS检测条件，整个检测过程仅需5 min，大大缩短检测时间。本方法采用基质标准曲线定量，在0.01~2.00 mg·kg–1添加水平下，肟菌酯及代谢物肟菌酸的添加回收率为71.5%~106.7%之间，RSD为1.0%~6.1%，最小检出量均为2.5×10–12 g，最低检出限均为0.01 mg·kg–1，各项指标均符合农药残留检测的要求。本方法适用于咖啡样品中肟菌酯和肟菌酸残留的分析。本文中提取和净化条件仅在单因素试验上被优化，并未考虑各因素之间的交叉作用对试验结果的影响，所以可以采用正交试验或响应面试验进一步综合优化。
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图 1 肟菌酯和肟菌酸在咖啡豆样品中的液相色谱–质谱图
Figure 1. Liquid chromatography-mass spectrometry maps of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid in coffee bean samples
表 1 色谱条件
Table 1 Chromatographic conditions
t/min 流速/(mL·min–1)
Flow velocity流动相1)
Mobile phase0 0.3 60:40 0.5 0.3 60:40 3.0 0.3 20:80 4.0 0.3 20:80 5.0 0.3 60:40 1) V (乙腈)∶V(φ为0.2%的甲酸水溶液)
1) V (Acetonitrile)∶ V (0.2% Formic acid)
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表 2 肟菌酯和肟菌酸质谱条件
Table 2 Mass spectrometry conditions of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid
项目 Item 母离子 (m/z)
Parent ion子离子 (m/z)1)
Daughter ion保留时间/min
Retention time锥孔电压 /V
Cone voltage碰撞能量 /V
Collision energy肟菌酯 Trifloxystrobin 409.00 145.20* 2.94 30 40 409.00 186.00 2.94 30 16 肟菌酸 Trifloxystrobin acid 395.10 145.00* 2.36 35 38 395.10 186.20 2.36 35 14 1) “*”为定量离子
1) “*” was an ion for quantitative analysis
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表 3 肟菌酯及肟菌酸在咖啡样品中的添加回收率 (RR)
Table 3 The recovery rates (RR) of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid in coffee samples %
样品 Sample w添加/
(mg·kg–1)
Additive肟菌酯
Trifloxystrobin肟菌酸
Trifloxystrobin acidRR RSD RR RSD 咖啡全果 Coffee fruit 0.01 87.8 5.8 71.5 6.1 0.05 106.7 3.1 99.7 2.9 0.50 97.9 5.2 106.0 3.0 2.00 90.5 1.3 92.0 1.0 咖啡豆 Coffee bean 0.01 86.9 6.2 86.2 5.1 0.05 83.2 2.0 84.4 1.0 0.50 88.1 5.3 105.2 5.2
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表 4 肟菌酯和肟菌酸的基质标准曲线和溶剂效应
Table 4 The matrix standard curve and solvent effect of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid
目标物
Taget基质
Matrix线性方程1)
Linear equation相关系数
(R)斜率比
Slope ratio基质效应/%
Matrix effect肟菌酯
Trifloxystrobin乙腈 Acetoritrile y=24 725.3x+1 886.16 0.999 526 咖啡全果 Coffee fruit y=30 974.8x+24 869.2 0.990 944 1.25 25.28 咖啡豆 Coffee bean y=15 750.2x－670.587 0.994 495 0.64 –36.30 肟菌酸
Trifloxystrobin acid乙腈 Acetoritrile y=22 003.2x+745.203 0.998 879 咖啡全果 Coffee fruit y=53 794.7x－639.725 0.990 473 2.44 144.48 咖啡豆 Coffee bean y=32 796.6x－256.338 0.996 596 1.49 49.05 1) x：标准质量浓度，y：峰面积
1) x: Standard concentration, y: Peak area
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