Antibacterial mechanism of thymol to methicillin-resistant Staphylococcus aureus
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摘要:目的
探讨百里香酚对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌作用机制，为开发高效低毒的抗MRSA药物提供可靠的理论依据。
方法采用微量肉汤稀释法和菌落计数法测定百里香酚对MRSA标准菌株USA300的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)；通过测定菌液电导率和DNA含量确定百里香酚对USA300细胞膜的影响；通过SDS-PAGE检测百里香酚对USA300可溶性蛋白质代谢的影响；利用透射电镜观察经百里香酚处理后USA300菌体细胞的超微结构；通过结晶紫染色法测定百里香酚对USA300生物被膜形成的影响。
结果百里香酚对USA300具有一定的抑制作用，其MIC和MBC均为256 mg·L–1。与对照组相比，512 mg·L–1百里香酚作用菌体1 h后，菌液电导率增加18.08%±1.80%，DNA外渗量增加(123.40±8.06) mg·L–1，作用24 h后，菌体可溶性蛋白质含量比对照组降低68.20%±0.15%。百里香酚对USA300细胞壁和细胞膜具有破坏作用并干扰其正常的二分裂，亚抑菌浓度下对生物被膜的形成具有一定抑制作用。
结论百里香酚通过改变菌体细胞膜通透性，干扰蛋白质代谢和正常的二分裂来抑制细菌的生长，亚抑菌浓度下能够在不影响细菌生长的前提下抑制其生物被膜的形成。百里香酚具有开发为抗MRSA药物的潜力。
Abstract:ObjectiveTo investigate the antibacterial mechanism of thymol to methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA), and provide a reliable theoretical basis for the exploitation of high efficient and low toxic anti-MRSA medicine.
MethodThe minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of thymol to MRSA standard strain USA300 were determined via microbroth dilution method and colony counting method. Bacterium solution conductivity and DNA amount were detected to investigate the effect of thymol on USA300 cell membrane. SDS-PAGE was used to detect the effect of thymol on USA300 soluble protein synthesis. The ultra structure of USA300 cell treated by thymol was observed through transmission electron microscope. The effect of thymol on USA300 biofilm formation was investigated via crystal violet staining method.
ResultThymol had definite inhibitory activity on USA300, both MIC and MBC of thymol to USA300 were 256 mg·L–1. Compared with the control group, after treating the strain with 512 mg·L–1 thymol for 1 h, the conductivity of bacterium solution was improved by 18.08%±1.80%, and DNA exosmosis amount increased by (123.40±8.06) mg·L–1; after treating for 24 h, the soluble protein content of USA300 was reduced 68.20%±0.15%. Thymol destroyed cytoderm and cytomembrane of USA300, disturbed its normal binary fission, and inhibited biofilm formation at subinhibitory concentration.
ConclusionThymol can inhibit bacterium growth by changing its cytomembrane permeability and disturbing protein synthesis and normal binary fission, and depress biofilm formation at subinhibitory concentration in the premise of not affecting bacterium growth. Thymol has the potential of developing as anti-MRSA medicine.
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链式开沟机是一种连续开沟设备，具有结构简单、作业效率高以及开沟深度便于调节的优点，广泛应用于管道、线缆铺设以及农田水利建设和市政工程等开沟作业[1-2]。但链式开沟机作业时容易受地表不平影响，导致开沟深度波动大，严重地影响了作业质量[3]。因此，实现链式开沟机开沟深度的精确控制具有重要意义。赵金辉等[4]采用延迟时间补偿法构建了开沟深度数学模型，利用PLC控制系统实现了开沟深度的有效调节；蔡国华等[5]基于ATmega128单片机，设计了一种播种机开沟器深度自控系统试验台，实现了开沟深度的跟踪控制；Weatherly等[6]设计了一种主动式播种深度控制系统，利用DFS传感器检测土壤含水率，实现了开沟深度自动调节；黄东岩等[7]利用压电薄膜传感器获取播种单体与地面的压力，通过控制空气弹簧实现了播种深度的自适应调整。上述研究主要针对播种机的改良，对于链式开沟机开沟深度控制方面的研究鲜有报道。为此，本文设计了一种基于激光传感器的开沟深度控制系统，以期实现开沟深度的闭环控制，为链式开沟机开沟深度控制问题提供一种解决方法。
1. 系统结构与工作原理
1.1 系统结构
开沟深度控制系统结构框图如图1所示。系统主要由主控单元、液压系统和执行机构组成，其中主控单元由可编程控制器、激光传感器、交互设置界面和电源模块等组成，液压系统由电磁阀组、液压缸和拖拉机液压输出等组成，执行机构由开沟链组合和升降架等组成。链式开沟机结构图如图2所示。链式开沟机通过挂接机构与拖拉机3点悬挂，2个激光传感器对称安装在升降架两侧，电磁阀组安装在机架上，液压缸安装在机架两侧，升降架与机架两侧铰接，开沟链组合通过U型螺栓固定在升降架上。
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图 2 链式开沟机结构图1：挂接机构；2：机架；3：控制阀组；4：液压缸；5：升降架；6：激光传感器；7：开沟链组合Figure 2. The structure diagram of chain trencher1.2 系统设计
1.2.1 执行机构
沟深调节执行机构由机架、液压缸、升降架和开沟链组合等构成(图2)。其中，液压缸上端与机架铰接，下端与升降架铰接；升降架两侧与机架铰接；开沟链组合固定在升降架上。当液压缸上侧(下侧)进油时，活塞伸出(收缩)，带动升降架及固定其上的开沟链组合绕升降架铰接点向下(向上)转动，实现开沟深度调节。研究选用耳环型液压缸，工作行程0~400 mm，开沟深度调节范围0~500 mm。
1.2.2 液压系统
如图3所示，为了实现开沟深度闭环控制，在拖拉机液压输出和液压缸之间加装电磁阀组。电磁阀组包括电液比例控制阀和两位三通电磁阀，电液比例控制阀起到控制液压油流量与流向的作用，两位三通电磁阀用于链式开沟机未切削土壤前的空程快进[8]。具体工作过程：链式开沟机未切削土壤前，电液比例控制阀处于中位，两位三通电磁阀失电右位接入系统，液压缸有杆腔与无杆腔相连形成差动连接，液压缸活塞快速伸出，推动开沟链组合快速到达工作位置。到达工作位置后，两位三通电磁阀得电一直处于左位接入系统的状态，当误差（e）≤最大允许误差（e′）时，电液比例控制阀处于中位，无液压油进入，液压缸无动作；当e>e′且传感器获取的开沟深度（h）<设定目标开沟深度（h′）时，电液比例控制阀处于右位，液压油进入无杆腔，液压缸活塞伸出；当e>e′且h>h′时，电液比例控制阀处于左位，液压油进入有杆腔，液压缸活塞收缩。
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图 3 液压系统原理图1： 拖拉机液压快速接头；2：电液比例控制阀；3：两位三通电磁阀；4：液压缸Figure 3. The schematic diagram of hydraulic system研究选用的拖拉机为东方红LX754，其液压泵型号为CBN-G316，液压泵额定压力为25 MPa，额定流量为50 L·min–1。据此电液比例控制阀选择VTOZ公司生产的MA-DHZO-A型，两位三通电磁阀选择Huade公司生产的4WRE10M16-10B/6AG24NETZ4/M型。
1.2.3 控制系统
系统采用的控制器为STC12C5A60S2系列单片机，完全兼容传统8051，内部集成MAX810专用复位电路，2路PWM，8路高速10位A/D转换(250 K/S)，I/O端口丰富；采用LM2576HVT-5.0集成电路将拖拉机12 V直流转化成5 V直流[6],为单片机供电[9-10]；驱动器选用东驰ET-HX型电子放大器。控制器连接示意图见图4。控制器在固定频率下输出PWM信号，根据开沟深度检测值与目标值的差值，调节PWM波的占空比，获得对应输出电流，经驱动器放大后加载到电液比例控制阀，控制电液比例控制阀阀芯的移动方向和阀口开度，实现对液压系统流方向和流量的比例控制。
根据臧盛超[11]的方法，使用Keil uvision 5编译器进行程序编写与编译。主流程图如图5所示。
1.3 测距原理
激光三角法测距技术是光电检测技术的一种，与其他非接触测量方法相比，具有结构简单，使用灵活，测量迅速，对待测表面要求较低等优点[12-13]。本研究采用激光三角反射式位移传感器，其测距原理如图6所示，半导体激光器 (Laser diode，LD)[1]发出的光束经会聚透镜垂直投射并聚焦到被测物体表面上形成光斑，由于物体表面具有一定粗糙度，引起光斑在物体表面发生漫反射，其中一部分散射光经过接收透镜成像于光电探测器件 (Charge coupled device，CCD)[2]上。当被测物体发生微小位移或表面高低发生变化，光点将沿激光束的方向产生微小移动，致使CCD上像点随之移动[14-15]。系统采集像点移动信号，经调理电路处理反馈给控制器计算求出物体产生的位移。若像点在CCD上移动的距离为N，被测物体表面移动的距离为M，由相似三角形得出：
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图 6 激光三角反射式位移传感器测距原理图Figure 6. The principle diagram of distance measurement of laser triangular reflection displacement sensor$$ \frac{{L'}}{N} = \frac{{L + M\cos \alpha }}{{M\sin \alpha }} , $$ (1) 整理后有：
$$ M = \frac{{NL}}{{L'\sin \alpha - N\cos \alpha }} , $$ (2) 式中：L′为接收透镜后主面到成像面中心点的距离；L为激光束光轴的交点到接收透镜前主面的距离；α为激光束光轴与接收透镜光轴之间的夹角[4]。
本研究采用的激光传感器型号为德国MICRO-EPSILON公司的1700BL型，测距范围为2~1 000 mm，分辨率为0.03 μm，波长为405 nm (可视/红色)，最大输出功率1 mW，能够满足开沟深度检测的要求。
1.4 工作原理
在升降架两侧相同位置安装2个激光传感器，形成双激光检测模块，安装位置与开沟链组合底部的垂直距离为h1。当链式开沟机工作时，双激光检测模块同步检测对地距离为h2和h3，为有效地减少因地表不平造成的检测误差，取h2和h3的平均值作为最终检测结果。根据以上参数计算开沟深度检测值(h)：
$$ h = {h_1} - \left( {\frac{{{h_2} + {h_3}}}{2}} \right) , $$ (3) 设定e为链式开沟深度的检测值(h)与目标值(h′)之差的绝对值：
$$ e = \left| {h - h'} \right| , $$ (4) 系统工作前，首先在交互设置界面中设定开沟深度目标值(h′)和开沟深度最大允许误差(e′)，当e≤e′，开沟深度符合设定要求，控制器无信号输出，液压缸不动作；当e>e′，开沟深度不符合设定要求，控制器输出响应信号驱动电磁阀组动作，通过液压缸推动执行机构，调节开沟深度直到符合设定的最大允许误差，控制器将停止信号输出，电磁阀组失电，停止深度调节。
2. 试验结果
2.1 静态响应试验
静态响应试验在南京农业大学工学院控制系统综合试验台上进行。分别在升降架两侧安装激光传感器，然后连接传感器、控制器和电磁阀组，完成控制系统的组装；根据蔡国华等[5]的方法，在传感器下方放置可上下移动的平板用于模拟地表；选用NI USB-6009数据采集卡采集激光传感器检测的开沟深度(h)，采样频率设定为100 Hz。
在交互设置界面设置h1=700 mm、h′=300 mm、e′=5 mm，调整平板与传感器的距离分别为350和450 mm，即模拟开沟深度过深或过浅50 mm。启动系统，静态响应曲线如图7所示。由静态响应曲线可知，当开沟深度比目标开沟深度深50 mm时，响应时间0.19 s，控制误差2 mm；浅50 mm时，响应时间0.31 s，控制误差3 mm。表明开沟深度控制系统响应迅速，控制误差能够满足设置要求。
2.2 田间试验
田间试验于2017年8月在南京市高淳区桠溪镇禾田坊家庭农场进行，试验地块长74.3 m、宽52.6 m，土壤类型为水稻土[16-17]，试验前测定0~400 mm土壤容重、含水量和坚实度，结果如表1所示。根据秸秆集中沟埋还田对开沟深度的要求[18-19]，选定开沟深度分别为200、300和400 mm；根据链式开沟机常用作业速度范围[20-21]和当地实际作业情况，选择在机具前进速度为3 km·h–1的条件下进行试验。链式开沟机沿田块长边进行开沟作业，每个开沟深度重复作业10个行程，前5个行程不启用控制系统，后5个行程在机具启动后，行进前启用控制系统。根据《田间开沟机械作业质量》标准[22]，每个行程的作业距离均大于50 m。同一开沟深度条件下，系统启用前后各随机选取2个作业行程，每个行程内等距(10 m)取5点，共10点，用卷尺测量实际开沟深度，每个点重复测量3次，取平均值进行数据分析，测量结果见表2。
表 1 田间试验的土壤参数Table 1. Parameters of soil in the field experiment深度/mm 容重/(g·cm–3) 含水量(w)/％ 坚实度/MPa 0~100 1.31 21.63 0.91 100~200 1.48 18.45 1.89 200~300 1.55 16.83 2.34 300~400 1.58 15.97 2.87 表 2 不同的选定开沟深度下系统启用前后的实际测量结果Table 2. The measurement results of different selected trenching depths before and after enabling the system mm试验点 200 mm 300 mm 400 mm 关闭 启动 关闭 启动 关闭 启动 1 156 213 351 296 422 366 2 181 172 269 319 353 421 3 233 166 344 271 371 396 4 165 187 278 288 353 373 5 178 191 353 323 465 425 6 189 209 286 262 356 376 7 233 196 336 271 449 428 8 239 179 245 322 386 386 9 196 189 329 289 331 389 10 206 216 347 311 418 438 平均值 184.6 191.8 313.8 295.2 390.4 399.8 根据实际开沟深度测量结果，计算开沟深度稳定性系数，结果如图8所示。
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图 8 开沟深度稳定性系数Figure 8. The stability coefficient of trenching depth of chain trencher设定开沟深度为200、300和400 mm时，关闭开沟深度控制系统，实际测量的开沟深度平均值分别为184.6、313.8和390.4 mm，开沟深度稳定性系数为86.8%、87.2%和88.3%；启动系统后，平均值分别为191.8、295.2和399.8 mm，稳定性系数分别为91.1%、92.3%和93.5%。表明启动开沟深度控制系统后，链式开沟机开沟深度的控制精度和稳定性得到提高，控制精度提高2.3%，稳定性系数提高4.3%。
3. 结论
基于激光三角反射式测距原理，设计了针对链式开沟机的开沟深度控制系统，通过双激光检测模块实时采集开沟深度，实现开沟深度自适应实时调节。静态响应试验表明，当开沟深度与目标值相差±50 mm时，系统响应时间分别为0.19和0.31 s，最大控制误差3 mm，系统响应迅速，控制误差在设定范围内。田间试验表明，启动系统后，控制精度提高了2.3%，稳定性系数提高了4.3%。本研究结果为链式开沟机开沟深度控制问题提供了一种解决方法。
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图 1 不同质量浓度的百里香酚对USA300在BHI液体培养基中生长的影响
Figure 1. Effects of different mass concentrations of thymol on USA300 growth in BHI liquid medium
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图 2 512 mg·L–1百里香酚对USA300菌液电导率的影响
“**”表示相同培养时间的对照组和512 mg·L–1百里香酚处理组间差异极显著(P<0.01，t检验)
Figure 2. Effect of 512 mg·L–1 thymol on conductivity of USA300 bacterium solution
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图 3 512 mg·L–1百里香酚对USA300 DNA外渗量的影响
“**”表示相同作用时间的对照组和512 mg·L–1百里香酚处理组间差异极显著(P<0.01，t检验)
Figure 3. Effect of 512 mg·L–1 thymol on DNA exosmosis amount of USA300
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图 4 512 mg·L–1百里香酚对USA300可溶性蛋白质代谢的影响
M：标准分子量蛋白Marker；1：16 h对照组；2：16 h 512 mg·L–1 百里香酚处理组；3：24 h对照组；4：24 h 512 mg·L–1百里香酚处理组
Figure 4. Effect of 512 mg·L–1 thymol on soluble protein synthesis of USA300
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图 5 512 mg·L–1 百里香酚不同作用时间对USA300菌体细胞超微结构的影响
A1：4 h 百里香酚处理组；A2：4 h对照组；B1：16 h 百里香酚处理组；B2：16 h对照组；C1：24 h 百里香酚处理组；C2：24 h对照组
Figure 5. Effects of different treating time of 512 mg·L–1 thymol on ultra structures of USA300 cells
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