Over-expression of rabies virus G protein and its inhibitory effect on the virus in neuroblastoma cells
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摘要:目的
探究G蛋白在狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)复制中的作用，以揭示携带双G基因的重组RABV的Hep-dG与亲代毒株rHep-Flury在神经母细胞瘤(NA)细胞中滴度差异的原因，为RABV致病机制的研究奠定基础。
方法通过病毒吸附、入侵、荧光定量PCR、Western-blot以及中和抗体阻断等试验，检测G蛋白过表达对IFN-β以及相关因子转录的影响。
结果Hep-dG感染能显著上调NA细胞中IFN-β mRNA的表达，激活了下游因子STAT1的表达与磷酸化，在较低的感染复数(MOI=0.01)下，Hep-dG感染后24 h即可显著促进IFN-β 基因的表达，36 h达到最高水平(P<0.001)。该病毒进入细胞后，产生了更多的病毒Leader RNA和RIG-I mRNA，且与IFN-β mRNA的表达高度一致。抗体阻断IFN-β后，Hep-dG在NA细胞中的病毒滴度显著上升(P<0.01)，约为阻断前的7.9倍，且与亲代毒株rHep-Flury无显著差异。与阴性对照比较，5 μg的pH-G质粒转染能刺激IFN-β的转录(P<0.05)，表明真核表达RABV G蛋白能在一定程度上刺激IFN-β的转录。
结论本研究初步揭示了G蛋白激活先天性免疫应答的原因和作用。RABV G蛋白的过表达，通过促进病毒Leader RNA的转录，激活了RIG-I介导的IFN-β通路，进而抑制了Hep-dG在NA细胞的繁殖。G蛋白的过表达也对干扰素通路起到一定的作用。
Abstract:ObjectiveTo explore the role of G protein in rabies virus (RABV) replication, reveal the reason for the difference of virus titer in neuroblastoma (NA) cells between the recombinant RABV Hep-dG with dual copy of G gene and the parental strain rHep-Flury, and lay a foundation for the study of RABV pathogenesis.
MethodThe effects of G protein over-expression on transcriptions ofIFN-β and related factors were examined by the virus binding assay, virus entry assay, fluorescence quantitative PCR, Western-blot and neutralizing antibody blocking assay.
ResultHep-dG infection significantly increased the expression of IFN-β mRNA and activated the expression of the downstream factor STAT1 in NA cells. Under the low multiplicity of infection (MOI=0.01), the expression of IFN-β gene significantly increased at 24 h after Hep-dG infection and reached the highest level at 36 h. After the virus entered the cells, there were more viral Leader RNA and RIG-I mRNA, which were highly consistent with the expression of IFN-β mRNA. The block of IFN-β expression by neutralizing antibody in NA cells significantly increased the virus titer of Hep-dG in cell culture supernatant(P<0.01), which was 7.9 times before blocking. Meanwhile the virus titer of Hep-dG had no significant difference with the parental strain rHep-Flury. Compared with the negative control, transfection of 5 μg pH-G plasmid could stimulate the transcription ofIFN-β(P<0.05), which showed that eukaryotic expression of RABV G protein could stimulateIFN-β transcription to a certain extent.
ConclusionThis study preliminarily reveals the cause and role of G protein in activating innate immune response. Over-expression of RABV G protein activates the RIG-I-mediated IFN-β pathway by promoting transcription of the viral Leader RNA, which in turn inhibits Hep-dG replication in NA cells and finally results in the lower virus titer in NA cells.
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Keywords:
- rabies virus /
- glycoprotein /
- IFN-β pathway /
- interferon-β /
- virus titer
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链式开沟机是一种连续开沟设备，具有结构简单、作业效率高以及开沟深度便于调节的优点，广泛应用于管道、线缆铺设以及农田水利建设和市政工程等开沟作业[1-2]。但链式开沟机作业时容易受地表不平影响，导致开沟深度波动大，严重地影响了作业质量[3]。因此，实现链式开沟机开沟深度的精确控制具有重要意义。赵金辉等[4]采用延迟时间补偿法构建了开沟深度数学模型，利用PLC控制系统实现了开沟深度的有效调节；蔡国华等[5]基于ATmega128单片机，设计了一种播种机开沟器深度自控系统试验台，实现了开沟深度的跟踪控制；Weatherly等[6]设计了一种主动式播种深度控制系统，利用DFS传感器检测土壤含水率，实现了开沟深度自动调节；黄东岩等[7]利用压电薄膜传感器获取播种单体与地面的压力，通过控制空气弹簧实现了播种深度的自适应调整。上述研究主要针对播种机的改良，对于链式开沟机开沟深度控制方面的研究鲜有报道。为此，本文设计了一种基于激光传感器的开沟深度控制系统，以期实现开沟深度的闭环控制，为链式开沟机开沟深度控制问题提供一种解决方法。
1. 系统结构与工作原理
1.1 系统结构
开沟深度控制系统结构框图如图1所示。系统主要由主控单元、液压系统和执行机构组成，其中主控单元由可编程控制器、激光传感器、交互设置界面和电源模块等组成，液压系统由电磁阀组、液压缸和拖拉机液压输出等组成，执行机构由开沟链组合和升降架等组成。链式开沟机结构图如图2所示。链式开沟机通过挂接机构与拖拉机3点悬挂，2个激光传感器对称安装在升降架两侧，电磁阀组安装在机架上，液压缸安装在机架两侧，升降架与机架两侧铰接，开沟链组合通过U型螺栓固定在升降架上。
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图 2 链式开沟机结构图1：挂接机构；2：机架；3：控制阀组；4：液压缸；5：升降架；6：激光传感器；7：开沟链组合Figure 2. The structure diagram of chain trencher1.2 系统设计
1.2.1 执行机构
沟深调节执行机构由机架、液压缸、升降架和开沟链组合等构成(图2)。其中，液压缸上端与机架铰接，下端与升降架铰接；升降架两侧与机架铰接；开沟链组合固定在升降架上。当液压缸上侧(下侧)进油时，活塞伸出(收缩)，带动升降架及固定其上的开沟链组合绕升降架铰接点向下(向上)转动，实现开沟深度调节。研究选用耳环型液压缸，工作行程0~400 mm，开沟深度调节范围0~500 mm。
1.2.2 液压系统
如图3所示，为了实现开沟深度闭环控制，在拖拉机液压输出和液压缸之间加装电磁阀组。电磁阀组包括电液比例控制阀和两位三通电磁阀，电液比例控制阀起到控制液压油流量与流向的作用，两位三通电磁阀用于链式开沟机未切削土壤前的空程快进[8]。具体工作过程：链式开沟机未切削土壤前，电液比例控制阀处于中位，两位三通电磁阀失电右位接入系统，液压缸有杆腔与无杆腔相连形成差动连接，液压缸活塞快速伸出，推动开沟链组合快速到达工作位置。到达工作位置后，两位三通电磁阀得电一直处于左位接入系统的状态，当误差（e）≤最大允许误差（e′）时，电液比例控制阀处于中位，无液压油进入，液压缸无动作；当e>e′且传感器获取的开沟深度（h）<设定目标开沟深度（h′）时，电液比例控制阀处于右位，液压油进入无杆腔，液压缸活塞伸出；当e>e′且h>h′时，电液比例控制阀处于左位，液压油进入有杆腔，液压缸活塞收缩。
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图 3 液压系统原理图1： 拖拉机液压快速接头；2：电液比例控制阀；3：两位三通电磁阀；4：液压缸Figure 3. The schematic diagram of hydraulic system研究选用的拖拉机为东方红LX754，其液压泵型号为CBN-G316，液压泵额定压力为25 MPa，额定流量为50 L·min–1。据此电液比例控制阀选择VTOZ公司生产的MA-DHZO-A型，两位三通电磁阀选择Huade公司生产的4WRE10M16-10B/6AG24NETZ4/M型。
1.2.3 控制系统
系统采用的控制器为STC12C5A60S2系列单片机，完全兼容传统8051，内部集成MAX810专用复位电路，2路PWM，8路高速10位A/D转换(250 K/S)，I/O端口丰富；采用LM2576HVT-5.0集成电路将拖拉机12 V直流转化成5 V直流[6],为单片机供电[9-10]；驱动器选用东驰ET-HX型电子放大器。控制器连接示意图见图4。控制器在固定频率下输出PWM信号，根据开沟深度检测值与目标值的差值，调节PWM波的占空比，获得对应输出电流，经驱动器放大后加载到电液比例控制阀，控制电液比例控制阀阀芯的移动方向和阀口开度，实现对液压系统流方向和流量的比例控制。
根据臧盛超[11]的方法，使用Keil uvision 5编译器进行程序编写与编译。主流程图如图5所示。
1.3 测距原理
激光三角法测距技术是光电检测技术的一种，与其他非接触测量方法相比，具有结构简单，使用灵活，测量迅速，对待测表面要求较低等优点[12-13]。本研究采用激光三角反射式位移传感器，其测距原理如图6所示，半导体激光器 (Laser diode，LD)[1]发出的光束经会聚透镜垂直投射并聚焦到被测物体表面上形成光斑，由于物体表面具有一定粗糙度，引起光斑在物体表面发生漫反射，其中一部分散射光经过接收透镜成像于光电探测器件 (Charge coupled device，CCD)[2]上。当被测物体发生微小位移或表面高低发生变化，光点将沿激光束的方向产生微小移动，致使CCD上像点随之移动[14-15]。系统采集像点移动信号，经调理电路处理反馈给控制器计算求出物体产生的位移。若像点在CCD上移动的距离为N，被测物体表面移动的距离为M，由相似三角形得出：
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图 6 激光三角反射式位移传感器测距原理图Figure 6. The principle diagram of distance measurement of laser triangular reflection displacement sensor$$ \frac{{L'}}{N} = \frac{{L + M\cos \alpha }}{{M\sin \alpha }} , $$ (1) 整理后有：
$$ M = \frac{{NL}}{{L'\sin \alpha - N\cos \alpha }} , $$ (2) 式中：L′为接收透镜后主面到成像面中心点的距离；L为激光束光轴的交点到接收透镜前主面的距离；α为激光束光轴与接收透镜光轴之间的夹角[4]。
本研究采用的激光传感器型号为德国MICRO-EPSILON公司的1700BL型，测距范围为2~1 000 mm，分辨率为0.03 μm，波长为405 nm (可视/红色)，最大输出功率1 mW，能够满足开沟深度检测的要求。
1.4 工作原理
在升降架两侧相同位置安装2个激光传感器，形成双激光检测模块，安装位置与开沟链组合底部的垂直距离为h1。当链式开沟机工作时，双激光检测模块同步检测对地距离为h2和h3，为有效地减少因地表不平造成的检测误差，取h2和h3的平均值作为最终检测结果。根据以上参数计算开沟深度检测值(h)：
$$ h = {h_1} - \left( {\frac{{{h_2} + {h_3}}}{2}} \right) , $$ (3) 设定e为链式开沟深度的检测值(h)与目标值(h′)之差的绝对值：
$$ e = \left| {h - h'} \right| , $$ (4) 系统工作前，首先在交互设置界面中设定开沟深度目标值(h′)和开沟深度最大允许误差(e′)，当e≤e′，开沟深度符合设定要求，控制器无信号输出，液压缸不动作；当e>e′，开沟深度不符合设定要求，控制器输出响应信号驱动电磁阀组动作，通过液压缸推动执行机构，调节开沟深度直到符合设定的最大允许误差，控制器将停止信号输出，电磁阀组失电，停止深度调节。
2. 试验结果
2.1 静态响应试验
静态响应试验在南京农业大学工学院控制系统综合试验台上进行。分别在升降架两侧安装激光传感器，然后连接传感器、控制器和电磁阀组，完成控制系统的组装；根据蔡国华等[5]的方法，在传感器下方放置可上下移动的平板用于模拟地表；选用NI USB-6009数据采集卡采集激光传感器检测的开沟深度(h)，采样频率设定为100 Hz。
在交互设置界面设置h1=700 mm、h′=300 mm、e′=5 mm，调整平板与传感器的距离分别为350和450 mm，即模拟开沟深度过深或过浅50 mm。启动系统，静态响应曲线如图7所示。由静态响应曲线可知，当开沟深度比目标开沟深度深50 mm时，响应时间0.19 s，控制误差2 mm；浅50 mm时，响应时间0.31 s，控制误差3 mm。表明开沟深度控制系统响应迅速，控制误差能够满足设置要求。
2.2 田间试验
田间试验于2017年8月在南京市高淳区桠溪镇禾田坊家庭农场进行，试验地块长74.3 m、宽52.6 m，土壤类型为水稻土[16-17]，试验前测定0~400 mm土壤容重、含水量和坚实度，结果如表1所示。根据秸秆集中沟埋还田对开沟深度的要求[18-19]，选定开沟深度分别为200、300和400 mm；根据链式开沟机常用作业速度范围[20-21]和当地实际作业情况，选择在机具前进速度为3 km·h–1的条件下进行试验。链式开沟机沿田块长边进行开沟作业，每个开沟深度重复作业10个行程，前5个行程不启用控制系统，后5个行程在机具启动后，行进前启用控制系统。根据《田间开沟机械作业质量》标准[22]，每个行程的作业距离均大于50 m。同一开沟深度条件下，系统启用前后各随机选取2个作业行程，每个行程内等距(10 m)取5点，共10点，用卷尺测量实际开沟深度，每个点重复测量3次，取平均值进行数据分析，测量结果见表2。
表 1 田间试验的土壤参数Table 1. Parameters of soil in the field experiment深度/mm 容重/(g·cm–3) 含水量(w)/％ 坚实度/MPa 0~100 1.31 21.63 0.91 100~200 1.48 18.45 1.89 200~300 1.55 16.83 2.34 300~400 1.58 15.97 2.87 表 2 不同的选定开沟深度下系统启用前后的实际测量结果Table 2. The measurement results of different selected trenching depths before and after enabling the system mm试验点 200 mm 300 mm 400 mm 关闭 启动 关闭 启动 关闭 启动 1 156 213 351 296 422 366 2 181 172 269 319 353 421 3 233 166 344 271 371 396 4 165 187 278 288 353 373 5 178 191 353 323 465 425 6 189 209 286 262 356 376 7 233 196 336 271 449 428 8 239 179 245 322 386 386 9 196 189 329 289 331 389 10 206 216 347 311 418 438 平均值 184.6 191.8 313.8 295.2 390.4 399.8 根据实际开沟深度测量结果，计算开沟深度稳定性系数，结果如图8所示。
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图 8 开沟深度稳定性系数Figure 8. The stability coefficient of trenching depth of chain trencher设定开沟深度为200、300和400 mm时，关闭开沟深度控制系统，实际测量的开沟深度平均值分别为184.6、313.8和390.4 mm，开沟深度稳定性系数为86.8%、87.2%和88.3%；启动系统后，平均值分别为191.8、295.2和399.8 mm，稳定性系数分别为91.1%、92.3%和93.5%。表明启动开沟深度控制系统后，链式开沟机开沟深度的控制精度和稳定性得到提高，控制精度提高2.3%，稳定性系数提高4.3%。
3. 结论
基于激光三角反射式测距原理，设计了针对链式开沟机的开沟深度控制系统，通过双激光检测模块实时采集开沟深度，实现开沟深度自适应实时调节。静态响应试验表明，当开沟深度与目标值相差±50 mm时，系统响应时间分别为0.19和0.31 s，最大控制误差3 mm，系统响应迅速，控制误差在设定范围内。田间试验表明，启动系统后，控制精度提高了2.3%，稳定性系数提高了4.3%。本研究结果为链式开沟机开沟深度控制问题提供了一种解决方法。
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图 1 Hep-dG感染NA细胞激活IFN-β信号通路
a: Hep-dG感染增强IFN-β基因的表达水平，图中“*”、“**”和“***”分别表示直线两端所对应的样本差异达0.05、0.01和0.001的显著水平(t检验)；b:Hep-dG感染刺激STAT1的表达和激活，1：空白对照，2：rHep-Flury，3：Hep-dG
Figure 1. Hep-dG infection activated the IFN-β signaling pathway in NA cells
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图 2 狂犬病病毒吸附和入侵NA细胞的分析
a：细胞表面吸附狂犬病病毒的分析；b：狂犬病病毒入侵NA细胞的分析，各图中“*”和“**”分别表示直线两端所对应的样本差异达0.05和0.01的显著水平(t检验)
Figure 2. Analyses of RABVs adsorbing and invading NA cells under different infection multiplicities
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图 3 狂犬病病毒感染对Leader RNA、vRNA和RIG-I基因表达的影响
a：Leader RNA的表达，b：vRNA的表达，c：RIG-I基因的表达；各图中“**”和“***”分别表示直线两端所对应的样本差异达0.01和0.001的显著水平(t检验)
Figure 3. Effects of rabies virus infections on expressions of Leader RNA，vRNA and RIG-Igene
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图 4 基于最小自由能的狂犬病病毒rHep-Flury和Hep-dG Leader RNA的二级结构
Figure 4. The secondary structure of rabies viruses rHep-Flury and Hep-dG Leader RNA based on the minimum free energy
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图 5 G蛋白的真核表达对NA细胞中IFN-β转录的影响
a：pH-G、pH-M和pH-GFP的荧光表达；b：IFN-β基因的表达，CK：阴性对照，1：5.0 μg的pH-G，2：2.5 μg的pH-G，3：5.0 μg的pH-M，4：2.5 μg的pH-M，5：阳性对照，图中“*”表示直线两端所对应的样本达0.05的显著水平(t检验)
Figure 5. Effect of G protein eukaryotic expression on IFN-β transcription in NA cell
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图 6 阻断IFN-β通路对狂犬病病毒复制的影响
a.抗体阻断IFN-β的表达，CK：空白对照，1：rHep-Flury，2：Hep-dG，3：rHep-Flury+IgG，4：Hep-dG+IgG，5：rHep-Flury+Anti，6：Hep-dG+Anti，图中“*”和“**”分别表示直线两端所对应的样本达0.05和0.01的显著水平(t检验)；b.病毒滴度的检测，1：rHep-Flury，2：Hep-dG，3：rHep-Flury+IgG，4：Hep-dG+IgG，5：rHep-Flury+Anti，6：Hep-dG+Anti
Figure 6. Effect of blocking IFN-β pathway on rabies virus replication
表 1 荧光定量PCR检测引物
Table 1 Primers used for fluorescence quantitative PCR detection
被检基因 引物序列 引物名称 产物长度/bp Leader RNA Leader-F 5'-CCAGATGCTTGGCGTCCT-3' 67 Leader-R 5'-ACGCTTAACAACAAAACC-3' vRNA vRNA-F 5'-GGAAAAGGGACATTTGAAAGAA-3' 130 vRNA-R 5'-AGTCCTCGTCATCGGAGTTGAC-3' RIG-I RIGI-F 5'-GCAAGTGCTTCCTCCTGACC-3' 142 RIGI-R 5'-ATGCGGTGAACCGTCTTTCC-3' GAPDH GAPDH-F 5'-AGAGTGTTTCCTCGTCCCGT-3' 199 GAPDH-R 5'-CTGTGCCGTTGAATTTGCCG-3' 
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