Over-expression of rabies virus G protein and its inhibitory effect on the virus in neuroblastoma cells
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摘要:目的
探究G蛋白在狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)复制中的作用，以揭示携带双G基因的重组RABV的Hep-dG与亲代毒株rHep-Flury在神经母细胞瘤(NA)细胞中滴度差异的原因，为RABV致病机制的研究奠定基础。
方法通过病毒吸附、入侵、荧光定量PCR、Western-blot以及中和抗体阻断等试验，检测G蛋白过表达对IFN-β以及相关因子转录的影响。
结果Hep-dG感染能显著上调NA细胞中IFN-β mRNA的表达，激活了下游因子STAT1的表达与磷酸化，在较低的感染复数(MOI=0.01)下，Hep-dG感染后24 h即可显著促进IFN-β 基因的表达，36 h达到最高水平(P<0.001)。该病毒进入细胞后，产生了更多的病毒Leader RNA和RIG-I mRNA，且与IFN-β mRNA的表达高度一致。抗体阻断IFN-β后，Hep-dG在NA细胞中的病毒滴度显著上升(P<0.01)，约为阻断前的7.9倍，且与亲代毒株rHep-Flury无显著差异。与阴性对照比较，5 μg的pH-G质粒转染能刺激IFN-β的转录(P<0.05)，表明真核表达RABV G蛋白能在一定程度上刺激IFN-β的转录。
结论本研究初步揭示了G蛋白激活先天性免疫应答的原因和作用。RABV G蛋白的过表达，通过促进病毒Leader RNA的转录，激活了RIG-I介导的IFN-β通路，进而抑制了Hep-dG在NA细胞的繁殖。G蛋白的过表达也对干扰素通路起到一定的作用。
Abstract:ObjectiveTo explore the role of G protein in rabies virus (RABV) replication, reveal the reason for the difference of virus titer in neuroblastoma (NA) cells between the recombinant RABV Hep-dG with dual copy of G gene and the parental strain rHep-Flury, and lay a foundation for the study of RABV pathogenesis.
MethodThe effects of G protein over-expression on transcriptions ofIFN-β and related factors were examined by the virus binding assay, virus entry assay, fluorescence quantitative PCR, Western-blot and neutralizing antibody blocking assay.
ResultHep-dG infection significantly increased the expression of IFN-β mRNA and activated the expression of the downstream factor STAT1 in NA cells. Under the low multiplicity of infection (MOI=0.01), the expression of IFN-β gene significantly increased at 24 h after Hep-dG infection and reached the highest level at 36 h. After the virus entered the cells, there were more viral Leader RNA and RIG-I mRNA, which were highly consistent with the expression of IFN-β mRNA. The block of IFN-β expression by neutralizing antibody in NA cells significantly increased the virus titer of Hep-dG in cell culture supernatant(P<0.01), which was 7.9 times before blocking. Meanwhile the virus titer of Hep-dG had no significant difference with the parental strain rHep-Flury. Compared with the negative control, transfection of 5 μg pH-G plasmid could stimulate the transcription ofIFN-β(P<0.05), which showed that eukaryotic expression of RABV G protein could stimulateIFN-β transcription to a certain extent.
ConclusionThis study preliminarily reveals the cause and role of G protein in activating innate immune response. Over-expression of RABV G protein activates the RIG-I-mediated IFN-β pathway by promoting transcription of the viral Leader RNA, which in turn inhibits Hep-dG replication in NA cells and finally results in the lower virus titer in NA cells.
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Keywords:
- rabies virus /
- glycoprotein /
- IFN-β pathway /
- interferon-β /
- virus titer
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现代城市和农村每天都会产生大量废纸，包括物流包装用纸、废报纸、办公用纸、旧书刊纸和学习用纸等。据纸业联讯统计，2016年我国废纸回收总量约4 964万 t，回收率达到47.6%，但与发达国家仍存在较大差距[1]。回收废纸主要用于再造纸，其成本非常高，而且还可能导致负面的环境影响。另一方面，基于纸张的品质，最多可以重复回用4~6次，回收加工废纸的过程会导致纤维的流失和纸张强度的损失，对造纸工艺和产品转换过程都会带来影响[2]。因此，利用一些没有再造纸价值的低质二次纤维与木质材料混合制造可以使用的木质复合材料，可有效扩展传统废纸的回用技术。开发这类废纸回收利用的新途径，既可减少城市固体废弃物处理量，降低废纸处理的环境污染负载，又能减少木材加工行业对森林资源的消耗，创造可观的生态、经济和社会效益[3- 4]。
目前国内外已有较多利用废纸原料制造刨花板和纤维板的研究，这些研究使用多种尺寸的废纸，全部使用废纸或按照一定比例与木刨花或纤维混合，还利用了多种胶黏剂进行胶结。这些研究的结果表明，利用废纸替代部分木材原料制备板材是可行的，但废纸原材料制备板材的综合性能相比木材差很多，而且在制备过程中会遇到纸片团聚和较难均匀铺装等诸多问题[5-11]。这些研究只探索了废纸与木质材料制备复合板材的可行性和制备工艺方法，基本只停留在实验室试验探索阶段，目前就继续优化复合板材制备工艺，深化解决制备过程中废纸片团聚和复合板材吸水厚度膨胀率大的问题却鲜有研究报道。本研究直接将回收废报纸、办公废纸或包装废纸简单机械地裁切成纸片，替代部分木质刨花制备废纸片–木刨花复合材料，无需对废纸进行预处理，实现废纸的全组分高附加值利用。本文重点研究废旧报纸片及其不同添加量在施胶搅拌过程中的团聚和成板后吸水厚度膨胀的问题，通过进一步工艺优化可实现企业规模化工业生产。
1. 材料与方法
1.1 试验主要原料
芯、表层杂木刨花，取自广东省始兴县华洲木业有限公司，经干燥后含水率为1.9%~2.3%。环保表层脲醛树脂(UF)胶黏剂固体含量(w)为60%，pH7.5，黏度27 s(涂–4杯)。环保芯层UF胶黏剂固体含量(w)为65%，pH7.5，黏度57 s(涂–4杯)。芯、表层用胶黏剂均取自广东省始兴县华洲木业有限公司。自制防水剂为乳化石蜡均质乳液，主剂为60#全精炼石蜡，购于中国石油化工股份有限公司茂名分公司(简称：茂名石化)，外观为乳白色，乳液固体含量(w)为44.25%，pH6.0，黏度13.6 s(涂–4杯)。废旧报纸购于再生资源回收站，利用办公碎纸机加工成10 mm (长)×2 mm (宽)的纸片，用电热鼓风干燥箱在60 ℃条件下干燥4 h，至含水率(w)为1.6%~2.0%。
1.2 试验方法
1.2.1 样品设计
样板目标密度为0.7~0.8 g·cm–3，样板尺寸规格为500 mm (长)×500 mm (宽)×16 mm (厚)。
1.2.2 复合刨花板的制备
定量称取1 200 g表层料所需的刨花置于电动搅拌机中，在搅拌的同时利用高压雾化喷嘴喷入调配好的胶黏剂，表层UF施胶量固定为13%(施胶量为固体树脂胶黏剂的质量与绝干物料质量的比例)，持续搅拌2 min，使其混合均匀。定量称取1 400 g芯层料所需的废报纸片(废报纸片占芯层料总质量比例称为废报纸片添加量)和刨花混合置于电动搅拌机中，在搅拌的同时利用高压雾化喷嘴喷入调配好的UF胶黏剂，持续搅拌2 min，使其混合均匀。手工将拌胶后的表、芯刨花分层铺装于自制模具中并进行预压。将预压好的板坯置于热压机中，最大热压压力4.0 MPa，按照表1设定的每毫米热压时间和热压温度热压成型。将热压完成的板材放入恒温恒湿箱中处理48 h后，裁取测试样板。
本试验共设4个因素：废报纸片添加量、芯层施胶量、热压温度和热压时间(以热压1 mm计)，每个因素4个变量水平(记为1、2、3、4)，试验重复3次，共计制作48个样板。试验方案如表1所示。
表 1 废报纸与木质刨花复合刨花板的制备工艺参数Table 1. Manufacturing parameters of composite particleboard using waste newspaper and wood particles变量
水平废报纸片
添加量/%芯层施
胶量/%热压温度/
℃热压时间1)/
s1 10 9 170 19 2 20 11 180 26 3 30 13 190 34 4 50 15 200 40 1)以热压1 mm计 1.2.3 性能测试
按照国标GB 17657—2013[12]中的要求测试样板的静曲强度(Modulus of rupture, MOR)、弹性模量(Modulus of elasticity, MOE)、内结合强度(Internal bonding strength, IBS)及吸水厚度膨胀率(Thickness swelling rate, TSR)，每个样板的每个指标测试4个试样。按照GB 18580—2001[13]中的要求，用穿孔萃取法测试样板的游离甲醛释放量，每个样板测试1次，游离甲醛的平均释放量为0.022 4 mg·g–1，远低于国标GB 18580—2001[13]中的E1级0.090 0 mg·g–1的限量阈值。
1.3 数据处理
采用EXCEL进行数据统计并计算整个样本总体的标准偏差。4个试验因素对复合刨花板物理力学性能的影响通过单因素方差分析进行研究，不同变量水平间差异的显著性通过SPSS软件中的Duncan’s法进行分析。
2. 结果与分析
2.1 废报纸片形态分析
由图1A观察可知，使用办公碎纸机制备的废报纸片是一种类似长方形的条状纸片，与图1A中的木质粗刨花相比，碎纸片尺寸单一，平均尺寸为10 mm(长)×2 mm(宽)。
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图 1 废报纸片和木刨花形态Figure 1. Morphological features of waste newspaper pieces and wood particles从图1B观察可知，使用办公碎纸机制备的废报纸片边缘存在大量絮状粗糙的“毛边”，这与办公碎纸机的特殊碎纸方式有关。办公碎纸机内部安装的刀轴组件，经电动马达驱动，刀轴组件上凸起的金属角将纸张撕裂并切成碎片，所以边缘会产生絮状粗糙的“毛边”。
2.2 工艺参数对复合刨花板静曲强度的影响
各工艺参数的改变对复合刨花板MOR的影响如图2A所示。废报纸片添加量的增加对复合刨花板的MOR存在显著的负面影响，当芯层料中的废报纸片添加量由10%增加到50%时，制备板材的MOR由最大值(18.22 MPa)显著下降到最小值(12.22 MPa)。主要原因是废报纸片尺寸较小，薄而狭长，部分纸张纤维被破坏，纸张的抗张强度受损严重，并且废报纸片边缘存在大量絮状的粗糙“毛边”，导致其与木质刨花混料拌胶的过程中会相互叠加、缠绕和团聚在一起，使拌胶和铺装不均匀，严重影响板材的MOR。
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图 2 工艺参数对复合刨花板静曲强度(MOR)、弹性模量(MOE)、内结合强度(IBS)和吸水厚度膨胀率(TSR)的影响各图中，同一工艺参数的不同柱子上方，凡是具有一个相同小写字母者，表示水平间差异不显著（P＞0.05，Duncan︐s法）Figure 2. Effects of manufacturing parameters on modulus of rupture (MOR), modulus of elasticity (MOE), internal bonding strength (IBS) and thickness swelling rate (TSR) of composite particleboards由图2A可知，施胶量、热压温度和热压时间对复合刨花板的MOR影响均不显著。随施胶量的增加，复合刨花板的MOR呈先升后降的趋势，当施胶量为9%时复合刨花板的MOR为最小值(14.35 MPa)，当施胶量为11%时MOR达到最大值(15.79 MPa)。随热压温度的升高，复合刨花板的MOR呈先上升后略微降低的趋势，热压温度在170 ℃时复合刨花板的MOR为最小值(19.71 MPa)，热压温度在190 ℃时MOR达到最大值(20.43 MPa)。随着热压时间的延长，复合刨花板的MOR先上升后下降，在每毫米热压时间为40 s时复合刨花板的MOR达到最小值(17.64 MPa)，在每毫米热压时间为34 s时，MOR达到最大值(19.89 MPa)。可见，热压温度过高，热压时间过长均引起能耗增加和生产效率下降，而且易导致板材表面胶黏剂的热分解和纤维素大分子降解[14]，使得板材表面变色变味，MOR下降。
由此分析得出，在废报纸片添加量不高于50%的范围内，在不同的施胶量和热压工艺下制备的复合刨花板的MOR均能达到GB 4897—2015[15]关于干燥状态下使用的家具型刨花板(P2型)的MOR>11.0 MPa的要求。
2.3 工艺参数对复合刨花板弹性模量的影响
各工艺参数的改变对复合刨花板MOE的影响如图2B所示。废报纸片添加量的增加对复合刨花板的MOE存在显著的负面影响，当芯层料中的废报纸片添加量由10%增加到50%时，制备板材的MOE由最大值(3 352 MPa)显著下降到最小值(3 023 MPa)。以大于30%的较高废报纸片添加量制备复合刨花板的过程中，同上文“2.2”分析所述，拌胶和铺装的不均匀导致制备的整张板材板面横纵向各位置的刚度差异较大，MOE变化较大。
由图2B可知，热压温度对复合刨花板MOE存在显著影响。随热压温度升高，复合刨花板MOE呈逐渐上升的趋势，当热压温度为170 ℃时，复合刨花板MOE为最小值(3 297 MPa)，当热压温度为200 ℃时，MOE达到最大值(3 735 MPa)。随热压温度升高，板坯表、芯层的温度梯度加大，热传导加快，板坯芯层的温度快速上升，胶黏剂的流动性和分散性提高，废报纸片与木质刨花纤维的活性增加，有利于纤维之间的胶合，MOE增加[16]。
施胶量和热压时间对复合刨花板MOE无显著影响。随施胶量增加，复合刨花板MOE无显著变化，施胶量为9%时，所制备的复合刨花板MOE为最小值(3 208 MPa)，当施胶量为11%时，所制备的复合刨花板MOE达最大值(3 317 MPa)。随着热压时间的延长，复合刨花板MOE呈先升后降的趋势，在每毫米热压时间为40 s时为最小值(3 514 MPa)，在每毫米热压时间为34 s时达到最大值(3 847 MPa)。
由此分析得出，在废报纸片添加量不高于50%的范围内，在不同的施胶量和热压工艺下制备的复合刨花板的MOE均能达到GB 4897—2015[15]关于干燥状态下使用的家具型刨花板(P2型)的MOE>1 600 MPa的要求。
2.4 工艺参数对复合刨花板内结合强度的影响
各工艺参数的改变对复合刨花板IBS的影响如图2C所示。废报纸片添加量的增加对复合刨花板的IBS存在显著的负面影响，当芯层料中的废报纸片添加量由10%增加到50%时，制备的板材IBS由最大值(0.44 MPa)显著下降到最小值(0.24 MPa)。由于废报纸片尺寸较小，当纸片表面被胶液润湿后容易缠绕在木质刨花表面，在混料拌胶的过程中易产生部分纸片和木质刨花的团聚物，导致拌胶和铺装不均匀，团聚物无法形成良好的胶合，导致内结合强度随纸片添加量增加而明显下降。
由图2C可知，施胶量对复合刨花板IBS也存在显著影响，随施胶量增加，复合刨花板IBS呈先升后降的趋势，当施胶量为15%时，所制备的复合刨花板IBS为最小值(0.44 MPa)，当施胶量为13%时，所制备的复合刨花板IBS达到最大值(0.55 MPa)。试验结果表明，施胶量大可以增加胶黏剂与刨花的胶接点，形成更多有效的胶钉结构，承受更大的内应力，使物理力学强度得到提高。但施胶量太高会导致板坯含水率增加，热压时板坯内部产生过多高温高压蒸汽，在热压机泄压时，气体压力过大易造成板材鼓泡和分层[17], 而且多余的胶黏剂无法参与木材的有效胶结，导致成本增加，降低经济效益。
热压温度和热压时间对复合刨花板IBS无显著影响。复合刨花板IBS随热压温度的升高而增加，当热压温度为170 ℃时，复合刨花板IBS为最小值(0.55 MPa)，当热压温度为200 ℃时，IBS达到最大值(0.61 MPa)。随着热压时间的延长，复合刨花板IBS先升后降，在每毫米热压时间为40 s时，复合刨花板IBS为最小值(0.49 MPa)，在每毫米热压时间为34 s时，IBS达到最大值(0.61 MPa)。提高热压温度能够提高热量传递的速度，使板坯芯层温度迅速上升，胶黏剂在预定时间内迅速固化。此外，加热还会提高胶黏剂的流动性，有利于其在刨花表面的流动延展，改善胶液的分布与缩聚反应的发生，提高刨花之间的胶合力，从而提高板材的IBS。但是热压时间过长，易导致胶黏剂热分解，从而降低复合刨花板的IBS[14, 16]。
由此分析得出，在废报纸片添加量不高于20%时，在不同施胶量和热压工艺下制备的复合刨花板IBS均能达到GB 4897—2015[15]关于干燥状态下使用的家具型刨花板(P2型)IBS>0.35 MPa的要求。
不同废报纸片添加量制备的复合刨花板内结合测试试件的胶合界面如图3所示。随着芯层木刨花中加入的废报纸片量的增加，纸片团聚增多，纸片在木质刨花中的分散性逐渐变差(图3A，3B)，在铺装过程中很难将其分开，较难铺出均匀的板坯[11]。减少废报纸片的添加量(图3C)，则明显改善了纸片的团聚问题和板坯铺装的均匀性。当废报纸片的添加量为10%时，废报纸片与木质刨花能够均匀地混合(图3D)。因此，在优化的试验配方中废报纸片的添加量为10%比较合适。
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图 3 不同废报纸片添加量制备的复合刨花板内结合测试对比A、B、C和D：分别添加50%、30%、20%和10%废报纸片；图中蓝色方框是指废报纸片在复合刨花扮板芯层中的团聚物Figure 3. Comparison of internal bonding tests for composite particleboards made with different addition amounts of waste newspaper2.5 工艺参数对复合刨花板吸水厚度膨胀率的影响
各工艺参数的改变对复合刨花板TSR的影响如图2D所示。废报纸片添加量的增加对复合刨花板的TSR存在显著影响，当芯层料中的废报纸片添加量由10%增加到50%时，制备板材的TSR由最小值(2.1%)显著增加到最大值(4.2%)。由前文“2.2”和“2.4”分析可知，废报纸片的添加量不高于20%时，拌胶和铺装均匀性较好，同时，废报纸片尺寸较小，在复合板坯中可以填补部分刨花空隙，板坯经热压成型后能形成较密实的结构，当废报纸片的添加量不高于30%时，环境中的水分进入板材内部较为困难，板材吸水厚度膨胀率随纸片添加量增加变化较小。但以大于30%的较高废报纸片添加量制备复合刨花板的过程中，拌胶和铺装严重不均匀，导致制备的整张板材各位置的密度差异较大，板材内部孔隙率差异也较大，TSR显著增加。
由图2D可知，热压温度和热压时间对复合刨花板TSR存在显著影响。随着热压温度升高，复合刨花板TSR呈逐渐下降趋势，热压温度为170 ℃时，复合刨花板TSR达到最大值(2.1%)，热压温度为200 ℃时TSR为最小值(1.2%)。这是因为随着热压温度升高，胶黏剂的固化反应进展顺利，胶黏剂对木刨花和废报纸片的胶合作用增强，改善了板坯的胶合强度，使板坯吸收水分的能力下降，板材的TSR降低。随着热压时间的延长，复合刨花板的TSR呈先降低后略微升高的趋势，在每毫米热压时间为26 s时，复合刨花板TSR为最小值(1.0%)，在每毫米热压时间为40 s时TSR达到最大值(1.4%)。这是因为热压时间增加使胶黏剂的固化更充分，木刨花与废报纸片之间结合紧密，内部空隙变小，水分较难进入板材内部，并且水分在板材内部的扩散速度变慢。施胶量对复合刨花板的TSR有显著影响。随施胶量增加，复合刨花板TSR呈先降低后增加的趋势。当施胶量为13%时，所制备的复合刨花板TSR为最小值(1.3%)，当施胶量为9%时，所制备的复合刨花板TSR达到最大值(1.6%)。
由此分析得出，在废报纸片添加量不高于50%的范围内，在不同的施胶量和热压工艺下制备的复合刨花板的TSR均能达到GB 4897—2015[15]关于干燥状态下使用的家具型刨花板(P2型)的TSR<8.0%的要求。
3. 结论
机械裁切废报纸片与木质刨花混合制备复合刨花板是实现废报纸材料化应用的有效技术途径。废报纸片的加入对复合刨花板的静曲强度、吸水厚度膨胀率以及内结合强度影响较大，对弹性模量影响较小。由于报纸片的吸水量和吸水率远大于木质刨花，在使用报纸片制备复合刨花板工艺中需要添加防水剂，在纸片与木质刨花混料拌胶过程中添加1.0%的石蜡乳液可有效控制板材的吸水厚度膨胀率。
当废报纸片在芯层料中的添加量从10%增加到50%时，制备的复合刨花板静曲强度和内结合强度呈显著下降趋势，吸水厚度膨胀率显著增加，但弹性模量的变化不大。综合分析可得，使用废报纸片制备复合刨花板最佳工艺为：废报纸片用量10%、脲醛树脂胶黏剂施胶量11%，热压温度190℃，每毫米热压时间34 s，此优化工艺条件具备在当前刨花板工厂生产线进行中试的可行性。在优化工艺条件下制备的复合刨花板游离甲醛释放量为0.022 4 mg﹒g–1(穿孔萃取法)，优于国标GB 18580—2001[13]中E1级标准，物理力学性能也均超过GB 4897—2015[15]中室内家具用刨花板技术指标的要求。
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图 1 Hep-dG感染NA细胞激活IFN-β信号通路
a: Hep-dG感染增强IFN-β基因的表达水平，图中“*”、“**”和“***”分别表示直线两端所对应的样本差异达0.05、0.01和0.001的显著水平(t检验)；b:Hep-dG感染刺激STAT1的表达和激活，1：空白对照，2：rHep-Flury，3：Hep-dG
Figure 1. Hep-dG infection activated the IFN-β signaling pathway in NA cells
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图 2 狂犬病病毒吸附和入侵NA细胞的分析
a：细胞表面吸附狂犬病病毒的分析；b：狂犬病病毒入侵NA细胞的分析，各图中“*”和“**”分别表示直线两端所对应的样本差异达0.05和0.01的显著水平(t检验)
Figure 2. Analyses of RABVs adsorbing and invading NA cells under different infection multiplicities
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图 3 狂犬病病毒感染对Leader RNA、vRNA和RIG-I基因表达的影响
a：Leader RNA的表达，b：vRNA的表达，c：RIG-I基因的表达；各图中“**”和“***”分别表示直线两端所对应的样本差异达0.01和0.001的显著水平(t检验)
Figure 3. Effects of rabies virus infections on expressions of Leader RNA，vRNA and RIG-Igene
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图 4 基于最小自由能的狂犬病病毒rHep-Flury和Hep-dG Leader RNA的二级结构
Figure 4. The secondary structure of rabies viruses rHep-Flury and Hep-dG Leader RNA based on the minimum free energy
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图 5 G蛋白的真核表达对NA细胞中IFN-β转录的影响
a：pH-G、pH-M和pH-GFP的荧光表达；b：IFN-β基因的表达，CK：阴性对照，1：5.0 μg的pH-G，2：2.5 μg的pH-G，3：5.0 μg的pH-M，4：2.5 μg的pH-M，5：阳性对照，图中“*”表示直线两端所对应的样本达0.05的显著水平(t检验)
Figure 5. Effect of G protein eukaryotic expression on IFN-β transcription in NA cell
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图 6 阻断IFN-β通路对狂犬病病毒复制的影响
a.抗体阻断IFN-β的表达，CK：空白对照，1：rHep-Flury，2：Hep-dG，3：rHep-Flury+IgG，4：Hep-dG+IgG，5：rHep-Flury+Anti，6：Hep-dG+Anti，图中“*”和“**”分别表示直线两端所对应的样本达0.05和0.01的显著水平(t检验)；b.病毒滴度的检测，1：rHep-Flury，2：Hep-dG，3：rHep-Flury+IgG，4：Hep-dG+IgG，5：rHep-Flury+Anti，6：Hep-dG+Anti
Figure 6. Effect of blocking IFN-β pathway on rabies virus replication
表 1 荧光定量PCR检测引物
Table 1 Primers used for fluorescence quantitative PCR detection
被检基因 引物序列 引物名称 产物长度/bp Leader RNA Leader-F 5'-CCAGATGCTTGGCGTCCT-3' 67 Leader-R 5'-ACGCTTAACAACAAAACC-3' vRNA vRNA-F 5'-GGAAAAGGGACATTTGAAAGAA-3' 130 vRNA-R 5'-AGTCCTCGTCATCGGAGTTGAC-3' RIG-I RIGI-F 5'-GCAAGTGCTTCCTCCTGACC-3' 142 RIGI-R 5'-ATGCGGTGAACCGTCTTTCC-3' GAPDH GAPDH-F 5'-AGAGTGTTTCCTCGTCCCGT-3' 199 GAPDH-R 5'-CTGTGCCGTTGAATTTGCCG-3' 
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