Effects of temperature on culture in vitro and pathogenicity of Cyprinid herpesvirus 3
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摘要:目的
证实温度对锦鲤疱疹病毒CyHV-3体外增殖和致病性的影响。
方法选用CyHV-3-EGFP病毒株为研究对象，采用间接免疫荧光染色法测定病毒滴度，使用荧光显微镜观察病毒体外增殖，研究病毒的热稳定性、以及温度对病毒的体外培养和体内致病性的影响。
结果CyHV-3在4~36 ℃条件下具有很好的稳定性，温度超过36 ℃后，病毒活力随着温度升高而降低，50 ℃时病毒活力完全丧失。感染温度对CyHV-3病毒活力影响不大，高温(37 ℃)和低温(4 ℃)时病毒都具有感染能力。但是，孵育温度明显影响病毒活力，温度高于30 ℃时，CyHV-3的增殖能力减退甚至消失。鲤鱼感染CyHV-3病毒后，低温组(15 ℃)的死亡率为26.67%，常温组(25 ℃)的死亡率为73.33%，高温组(30 ℃)和对照组的死亡率均为0。
结论证实了CyHV-3病毒在低温下能够增殖并且具有致病性，解释了近年来锦鲤疱疹病毒(KHVD)的暴发及流行不再受限于春秋季节的现象。
Abstract:ObjectiveTo confirm the effect of temperature on proliferation in vitro and pathogenicity of Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3).
MethodCyHV-3-EGFP strain was used in this study. Viral titer was measured by the indirect immunofluorescence staining assay. The proliferation of virus in vitro was observed using a fluorescence microscope. The thermal stability, and the effect of temperature on proliferation in vitro and pathogenicity in vivo of virus were studied.
ResultCyHV-3 had good thermal stability at 4-36 ℃. The viability of CyHV-3 decreased with the increase of temperature when the temperature exceeded 36 ℃. The virus viability was completely lost at 50 ℃. The infection temperature had little effect on the viability of CyHV-3, and the virus showed infectivity at both high (37 ℃) and low (4 ℃) temperatures. However, incubation temperature significantly affected the virus viability. CyHV-3 proliferation capacity decreased or even disappeared when the temperature exceeded 30 ℃. After CyHV-3 infection, the mortality rates for the carps at low temperature (15 ℃) and room temperature (25 ℃) were 26.67% and 73.33% respectively, and the mortality rates for the carps at high temperature (30 ℃) and in the control group with no virus infection were 0.
ConclusionThe results confirm that CyHV-3 can proliferate and has pathogenicity at low temperature, which explain the phenomenon that the outbreak and rapid spread of KHVD in recent years are no longer restricted in spring and autumn seasons.
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Keywords:
- Cyprinid herpesvirus 3 /
- Cyprinus carpio /
- koi herpesvirus disease /
- temperature /
- pathogenicity /
- proliferation /
- infection
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锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease，KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)感染引起鲤鱼Cyprinus carpio、锦鲤Cryprinus carpiod以及普通变种鳃坏死、间质性肾炎的一种高致病性、高传染性、高死亡率的疾病。该病发病率高、流行范围广，致死率高达80%~100%[1-2]。自1998年以来，KHVD时常在世界范围内的许多鲤鱼和锦鲤养殖场发生[3]，死亡率极高，该病的暴发给鲤鱼和锦鲤养殖业造成了严重的经济损失[4-8]。因此，KHVD是世界动物卫生组织必须申报的疾病，是中国农业部规定的Ⅱ类动物疫病，是全世界进出口必检的病原。
KHVD多发于春秋季节，导致KHVD发病和严重程度的主要环境因素是水体温度[9-10]。水温在23~28 ℃时KHVD易暴发流行[11-12]。先前报道CyHV-3的体外增殖温度范围是15~25 ℃，当温度低于10 ℃或大于30 ℃时，病毒不复制，不能造成疾病暴发[13-14]。2014年4月，吉林省白山地区报道了1例冰下低温条件下暴发的KHVD，造成了鲤鱼的大量死亡，发病时的水温为–2~5 ℃[15]。因此，CyHV-3是否能够在低温条件下复制和具有致病性还需要进一步的研究。本研究选用CyHV-3-EGFP病毒株为研究对象，从病毒在培养基中的热稳定性、温度对病毒的体外培养和体内致病性的影响共3个方面开展研究，旨在为CyHV-3的致病机制研究和防控提供依据。
1. 材料与方法
1.1 细胞、病毒和试验动物
普通鲤鱼脑细胞(Common carp brain cell，CCB)系由深圳出入境检验检疫局刘荭研究员馈赠；CCB细胞用含体积分数为10%FBS的MEM培养基培养，置于25 ℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中；CyHV-3-EGFP病毒株由比利时列日大学Alain Vanderplasschen教授提供；健康鲤鱼(体长10~15 cm)60条，购自四川省成都市某鲤鱼养殖场；细胞培养板，购自上海索宝生物科技有限公司。
1.2 主要试剂
MEM和DMEM培养基、胎牛血清购自Sigma公司；鼠抗CyHV-3单抗2F12 WD1000由比利时列日大学Alain Vanderplasschen教授提供；荧光二抗Alexa 488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自Santa Cruz公司。
1.3 病毒滴度的测定
采用间接免疫荧光染色法测定CyHV-3病毒滴度[16]。以无血清培养基将待测的CyHV-3病毒液从10–2梯度稀释到10–6。取对数生长期CCB细胞，胰酶消化、计数，铺24孔板，每孔250 μL(含4×105个细胞)。每个病毒梯度设3个重复，每孔滴加250 μL待测病毒样品。25 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱培养5 d。培养后的CCB细胞置于丙酮–乙醇(体积比50∶50)固定液中–20 ℃固定10 min，加入一抗(2F12 WD1000，1∶1 000稀释)置于25 ℃孵育45 min后，使用含体积分数为10%FBS的PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min，加入荧光二抗(Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG，1∶1 000稀释) 25 ℃孵育30 min，使用含体积分数为10%FBS的PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min后，加入适量含体积分数为10%FBS的PBS缓冲液，荧光显微镜下直接计数每孔中荧光细胞数。以每孔荧光细胞数30~300个为最佳。测得病毒滴度以每毫升的绿色荧光形成单位(PFU·mL–1)表示，每个荧光细胞对应1个绿色荧光形成单位。依公式计算病毒滴度：病毒滴度=绿色荧光细胞数/(微孔×病毒量×稀释倍数)。
1.4 病毒热稳定性的测定
为研究CyHV-3在培养基中的热稳定性，分别将病毒液置于4、10、15、20、25、30、40和50 ℃条件下1 h。将处理后的病毒样品进行10倍梯度稀释，接种至对数生长期的单层CCB细胞中，使用12孔细胞培养板，每孔加0.2 mL病毒液，25 ℃条件下于无FBS的DMEM培养液中攻毒2 h，去除上清，添加2 mL含体积分数为10%FBS的DMEM培养液中，置于25 ℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中，培养5 d后采用间接免疫荧光蛋白法进行病毒滴度计数。为了进一步研究温度对病毒稳定性的影响，在30~40 ℃之间分别设置了6个温度梯度(30、32、34、36、38、40 ℃)，重复以上试验步骤，计算病毒滴度。
1.5 温度对CyHV-3体外增殖的影响
1.5.1 感染温度对CyHV-3体外增殖的影响
取100 μL CyHV-3-EGFP病毒液，加入200 μL无血清DMEM培养液，混匀，静置15 min后加入1.7 mL无血清的DMEM培养液，所有病毒液感染对数生长期的CCB细胞后，将平板置于4、15、25、30和37 ℃条件下感染2 h，去掉上清液，添加新的DMEM液，于25 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中继续培养5 d，利用荧光显微镜观察，研究感染温度对CyHV-3体外增殖的影响。
1.5.2 孵育温度对CyHV-3体外增殖的影响
将CyHV-3-EGFP病毒在15、25和30 ℃条件下分别感染CCB细胞2 h后，再将这3组不同感染温度的CCB细胞分别置于15、25和30 ℃的恒温培养箱中培养5 d，利用荧光显微镜观察，研究孵育温度对CyHV-3体外增殖的影响。
1.6 温度对CyHV-3致病性的影响
皮肤是CyHV-3感染的主要途径，人工动物感染试验采用浸泡法。健康鲤鱼经过2周环境适应后随机分成4组，每组15尾。处理组共设3个温度梯度，分别为15、25和30 ℃，采用400 PFU·mL–1的病毒悬液浸泡2 h攻毒；对照组温度为25 ℃，没有加入病毒悬液浸泡，而加入等量的DMEM培养液。攻毒后每天观察2次，记录临床症状、死亡时间和数量，连续观察6周。
2. 结果与分析
2.1 CyHV-3热稳定性研究
为研究CyHV-3在培养基中的热稳定性，分别将病毒液置于不同温度下1 h后，通过间接免疫荧光法测定病毒滴度。通过计算绿色荧光形成单位(PFU)可知，在4、10、15、20、25和30 ℃条件下1 h后，病毒的滴度都超过105 PFU·mL–1，说明CyHV-3在30 ℃条件下的热稳定性良好。但是当培养温度为40 ℃时，病毒滴度明显降低，仅为10 PFU·mL–1(图1A)。
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图 1 不同温度下CyHV-3病毒液的病毒滴度Figure 1. Viral titers of CyHV-3 viral fluid under different temperature为了进一步研究温度对CyHV-3稳定性的影响，在30 ℃至40 ℃之间设置了6个温度梯度(30、32、34、36、38和40 ℃)。经过计算PFU可知，温度低于36 ℃时，病毒滴度都超过了105 PFU·mL–1，但是呈现递减趋势。温度高于36 ℃时病毒滴度明显减少，38和40 ℃时的滴度分别为103.37、101.30 PFU·mL–1，病毒滴度大幅度的降低(图1B)。试验结果说明CyHV-3在4~36 ℃时具有很好的热稳定性，温度高于36 ℃时病毒活力降低，温度高于50 ℃时病毒活力完全丧失(图1)。
2.2 感染温度对CyHV-3体外增殖的影响
CyHV-3病毒分别在4、15、25、30和37 ℃条件下感染对数生长期的CCB细胞2 h后，置于25 ℃恒温培养箱中继续培养5 d，荧光显微镜观察结果显示，在这5个不同感染温度中，CyHV-3-EGFP对CCB细胞都具有感染力，能大量增殖。因此，4~37 ℃范围内的感染温度对病毒活力无影响(图2)。
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图 2 不同感染温度下CyHV-3体外增殖的荧光显微镜观察结果A:4 ℃，B:15 ℃，C：25 ℃，D：30 ℃，E：37 ℃；标尺=200 μmFigure 2. Observation of CyHV-3 proliferation in vitro under different temperature using fluorescence microscope2.3 孵育温度对CyHV-3体外增殖的影响
CyHV-3分别在15、25、30 ℃温度下感染2 h后，分别置于15、25、30 ℃恒温培养箱中继续孵育5 d，荧光显微镜观察显示，孵育温度为15和25 ℃时，3个感染温度下的CCB细胞中都出现病毒的大量增殖。其中感染温度为15 ℃，孵育温度为25 ℃时，病毒增殖量最多。当孵育温度为30 ℃时，3个感染温度下的CCB细胞中病毒的增殖量都很少，感染温度为30 ℃时，病毒没有增殖(图3)。
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图 3 不同感染和孵育温度下CyHV-3体外培养的荧光显微镜观察结果A1、A2和A3的感染温度分别为15、25和30 ℃，孵育温度为15 ℃；B1、B2和B3的感染温度分别为15、25和30 ℃，孵育温度为25 ℃；C1、C2和C3的感染温度分别为15、25和30 ℃，孵育温度为30 ℃；标尺=200 μmFigure 3. Observation of CyHV-3 culture in vitro under different infection and incubation temperatures using fluorescence microscope2.4 温度对CyHV-3致病性的影响
通过浸泡法进行人工感染动物试验，在15、25和30 ℃温度条件下饲养，观察鲤鱼的死亡情况。通过40 d的观察，15 ℃饲养条件下，攻毒9 d后鲤鱼开始表现出临床症状，14 d开始有鲤鱼死亡，累积死亡4尾，死亡率为26.67%；25 ℃饲养条件下，攻毒4 d后出现临床症状，7 d后鲤鱼开始死亡，累积死亡11尾，死亡率为73.33%。30 ℃条件下，在攻毒4 d后部分鱼表现轻微临床症状，几天后症状消失，没有发生死亡；对照组饲养温度为25 ℃，没有临床症状，死亡率为0 (图4)。因此，温度能够影响CyHV-3的致病力，温度为15 ℃时病毒存在致病性，但是致病力比25 ℃时减弱；温度为30 ℃时，CyHV-3的致病力降低至消失(图4)。
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图 4 温度对CyHV-3致病性的影响30 ℃条件下和对照组的死亡率在整个试验期均为0Figure 4. Effect of temperature on CyHV-3 pathogenicity3. 讨论与结论
自然条件下的水体温度是水生动物疾病暴发的一个重要诱因，也是影响病毒在水体存活的重要因素。鱼类是变温动物，免疫反应等生理机能直接受环境温度的影响，所以小范围的温度变化会改变鱼的代谢和生理机能，鱼类免疫反应和病原复制都与水温有关[17-18]。同时，水温的变化还会影响病原与宿主之间的平衡，从而改变疾病的发生率及分布。病毒性疾病具有严格的发病温度，对温度范围要求非常高，发病高峰在水温25 ℃左右，水温突然升到35 ℃，并维持24 h，很多病症就会消失；水温突然降到15 ℃，并维持24 h，很多病毒病症状也会消失，死亡率大幅减少。
锦鲤疱疹病毒CyHV-3自1997年首次被报道至今，虽然只有近20年的时间，却已经在全球多个国家传播及流行，遍布亚洲、欧洲及北美，非洲也偶有报道，几乎每年都有国家暴发该疾病，给鲤鱼及锦鲤养殖业造成巨大的经济损失。CyHV-3对温度有很强的依赖性，多发于春秋季节，适宜的温度为18~28 ℃范围之间，CyHV-3的潜伏期为14 d，在限制存活的温度下，CyHV-3能处于一种潜伏状态在鱼体内持续存活，当鱼转入到适合其生长的温度时CyHV-3会再次恢复活力[19-20]。Ronen等[21]将健康的鱼苗和患病的成鱼在适合病毒复制的温度(22~24 ℃)下共同饲养3~5 d，然后通过提高温度(约30 ℃)的方法抑制病毒复制，饲养25~30 d，保护率可达60%。近年来，CyHV-3有低温下发病的趋势[22]。2014年4月，吉林省白山地区报道了一例冰下低温条件下暴发的KHVD，造成了鲤鱼的大量死亡，发病时的水温为 –2~5 ℃。
为了证实温度对CyHV-3体外培养和致病性的影响，本研究设计试验检测CyHV-3在18 ℃以下或者28 ℃以上的温度条件下的稳定性、体外增殖能力以及致病性。通过试验数据得知CyHV-3在15 ℃条件下也具备很强的增殖能力和感染力，能对鲤鱼造成感染并致死。并且在4~36 ℃范围内都有很好的热稳定性，能保持病毒的毒力，一旦温度达到合适的范围，就会恢复感染力，侵袭宿主，但是高温条件会对CyHV-3产生抑制。本试验研究了温度对CyHV-3体外培养和致病性的影响，证实了CyHV-3能够在低温增殖并且具有致病性，解释了近年来KHVD的流行及暴发不再受限于春秋季节的现象。此外，CyHV-3为了适应低温而感染宿主，自身结构功能是否发生改变还需要验证。通过研究温度对CyHV-3体外增殖和致病力的影响，对控制KHVD的暴发和治疗提供新的思路。
致谢：感谢深圳出入境检验检疫局刘荭研究员提供CCB细胞，感谢比利时列日大学Alain Vanderplasschen教授提供病毒株。
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图 1 不同温度下CyHV-3病毒液的病毒滴度
Figure 1. Viral titers of CyHV-3 viral fluid under different temperature
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图 2 不同感染温度下CyHV-3体外增殖的荧光显微镜观察结果
A:4 ℃，B:15 ℃，C：25 ℃，D：30 ℃，E：37 ℃；标尺=200 μm
Figure 2. Observation of CyHV-3 proliferation in vitro under different temperature using fluorescence microscope
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图 3 不同感染和孵育温度下CyHV-3体外培养的荧光显微镜观察结果
A1、A2和A3的感染温度分别为15、25和30 ℃，孵育温度为15 ℃；B1、B2和B3的感染温度分别为15、25和30 ℃，孵育温度为25 ℃；C1、C2和C3的感染温度分别为15、25和30 ℃，孵育温度为30 ℃；标尺=200 μm
Figure 3. Observation of CyHV-3 culture in vitro under different infection and incubation temperatures using fluorescence microscope
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