Epidemiological survey of porcine reproductive and respiratory syndrome in scaled pig farms of Guangdong province
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摘要:目的
研究广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况。
方法2014—2016年共采集广东省各规模化猪场猪组织样品1 137份进行抗原检测，血清样品9 432份进行抗体检测。对不同年份、不同季度、不同区域的PRRSV抗原抗体检测情况进行比较分析，对分离的病毒进行遗传进化分析。
结果2014、2015和2016年的PRRSV抗原阳性率分别为30.86%、34.35%、37.50%；抗体阳性率为82.86%、68.87%、74.56%。从季度分析来看，第1季度抗原阳性率最高，为40.27%；第2季度抗原阳性率最低，为28.66%；各季度抗体水平均在70%以上。不同区域间的PRRSV感染率差异明显，粤东粤西感染率显著低于珠三角和粤北；在抗体水平上，粤东地区较低，抗体阳性率为69.51%，其他3个区域均高于75%。抗原检测阳性的样品中共分离到69株PRRSV毒株，其中有39株位于Subgenotype I亚群。
结论广东地区PRRSV抗原阳性率呈逐年上升趋势，抗体水平较高但并不稳定，从病毒分离结果看，Subgenotype I亚群为省内主要流行亚群。
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关键词:
- 猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS) /
- 流行病学调查 /
- 抗原检测 /
- 抗体检测 /
- 广东地区
Abstract:ObjectiveTo investigate the prevalence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in Guangdong province.
MethodFrom 2014 to 2016, totally 1 137 porcine tissue samples and 9 432 porcine serum samples were collected from scaled pig farms in Guangdong for antigen and antibody detection respectively. The results were compared among different years, seasons and regions. Phylogenetic analysis were performed on isolated viruses.
ResultFrom 2014 to 2016, the yearly positive rates of PRRSV antigens were 30.86%, 34.35% and 37.50% respectively, while the yearly antibody positive rates were 82.86%, 68.87% and 74.56% respectively. In quarterly analysis, the first quarter had the highest antigen positive rate of 40.27% and the second quarter had the lowest antigen positive rate of 28.66%. The antibody level of every quarter was above 70%. There were significant differences in PRRSV infection rates among different regions. The infection rates in eastern Guangdong and western Guangdong were significantly lower than those in the Pearl River Delta and northern Guangdong. The antibody positive rate was the lowest (69.51%) in eastern Guangdong and above 75% in the other three regions. A total of 69 PRRSV strains were isolated from samples with positive antigen, of which 39 strains belonged to Subgenotype I.
ConclusionThe antigen positive rate of PRRSV in Guangdong shows an increasing trend, while the antibody positive rate is relatively high but unstable. Subgenotype I is the predominant subgroup in Guangdong based on the virus isolation results.
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种威胁全球养猪行业的传染病[1]。自20世纪90年代传入我国以后，PRRSV给我国养猪业造成了严重的经济损失[2]。PRRSV为单股正链的RNA病毒，具有变异速度快、传播能力强、隐性带毒、难以净化等特点[3]。随着养猪业集约化、规模化的发展，PRRSV的防控变得越来越重要。为了解PRRSV在广东省猪场的流行情况，本研究采集2014—2016年广东地区各规模化猪场的组织和血清样品，检测PRRSV的抗原抗体水平，并分析其遗传进化情况，以期为广东省乃至国内的PRRSV防控提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
2014年1月至2016年12月采集广东地区规模化猪场的猪血清样品共9 432份用于抗体检测，组织样品共1 137份用于抗原检测。每个猪场的血清和组织样品采集数量不等。
酶标仪购自北京普朗新技术有限公司；C1000 PCR仪购自美国Bio-Rad公司；反转录、PCR等相关试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司；总RNA的抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司；凝胶电泳相关仪器购买自Bio-Rad公司；ELISA抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司，产品批号为99-41269。
1.2 方法
1.2.1 ELISA血清抗体检测
利用美国IDEXX公司的ELISA抗体检测试剂盒对猪血清样品进行检测，具体操作按照试剂盒说明书进行，在酶标仪上进行读数。
1.2.2 RT-PCR抗原检测
研磨病料，根据总RNA抽提试剂盒说明书提取病料总RNA，将抽提的RNA反转录为cDNA，随后以cDNA为模板进行PCR，并用琼脂糖凝胶电泳试验检测PCR结果。
根据Genbank上登录的多组PRRSV ORF5基因设计检测引物，建立了针对PRRSV的PCR检测方法。引物序列为ORF5-F：5′-TGAGACCAT GAGGTGGGC-3′，ORF5-R：5′-GAAAACGCC AAAAGCACC-3′。检测所用引物由广州华大基因公司合成。
1.2.3 病毒的分离鉴定
将抗原检测为阳性的病料研磨离心，上清过0.22 μm的滤膜除菌后接种至长满单层MARC-145细胞的培养皿中，置于CO2培养箱中培养。每隔72 h传1代，盲传3代后，将细胞置于显微镜下观察，将出现细胞病变的细胞冻融3次后进行RT-PCR检测和测序鉴定。
1.3 数据处理
抗原抗体检测数据处理及分析采用SPSS软件，差异显著性分析采用卡方检验，病毒分离以及遗传进化分析使用DNAstar软件和MEGA 5.0软件。
2. 结果与分析
2.1 广东地区抗原抗体检测情况
2014—2016年从广东省各地区规模猪场共采集了1 137份组织样品和9 432份猪血清样品，检测结果见表1。
表 1 2014—2016年广东省规模猪场PRRSV抗原和抗体检测阳性率Table 1. The PRRSV antigen and antibody positive rates of scaled pig farms in Guangdong from 2014 to 2016年份 样品数 阳性数 阳性率/% 95%置信区间/% 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 2014 269 2 824 83 2 340 30.86 82.86 25.39~36.75 81.42~84.23 2015 460 2 657 158 1 830 34.35 68.87 30.01~38.89 67.08~70.63 2016 408 3 951 153 2 946 37.50 74.56 32.79~42.40 73.17~75.92 总计 1 137 9 432 394 7 116 34.65 75.45 31.89~37.50 74.56~76.31 由表1可以看出，1 137份组织样品中检出PRRSV抗原阳性样品394份，总阳性率为34.65%，95%置信区间为31.89%~37.50%，这表明广东省猪场猪群PRRS带毒排毒情况十分普遍，此外，阳性率从2014年的30.86%到2016年的37.50%，也呈逐年上升的趋势。卡方检验结果表明不同年份间的抗原总阳性率差异不显著(χ2=3.193，P=0.20)。9 432份猪血清样品中检出PRRSV抗体阳性的样品7 116份，总阳性率为75.45%，95%置信区间为74.56%~76.31%，其中2014年的抗体阳性率最高，达到82.86%，2015年的抗体阳性率最低，仅有68.87%。卡方检验结果表明不同年份之间的抗体总阳性率差异极显著(χ2=147.415，P<0.01)。
将2014—2016年间广东省PRRSV的抗原抗体检测阳性率按月份和季度汇总统计(图1)，从图1可以看出，广东省这3年的抗原抗体阳性率不存在月份相关性，2014和2016年的抗体阳性率比较稳定且处于一个比较高的水平，而2015年的抗原阳性率和抗体阳性率波动均较大。从季度统计折线图来看，2015年的整体抗体水平要低于2014和2016年，而抗原阳性率在2015年第1季度上升后回落并趋于平稳。
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图 1 2014—2016年间广东省PRRSV抗原抗体阳性率情况Figure 1. PRRSV antigen and antibody positive rates in Guangdong from 2014 to 20162.2 不同季度PRRSV感染的抗原抗体检测结果
对2014—2016年不同季度的PRRSV抗原和抗体阳性率进行统计，结果(表2)显示，第1季度PRRSV抗原阳性率最高，为40.27%(118/293)；第2季度抗原阳性率最低，为28.66%(96/335)。卡方检验表明，第3、4季度间的阳性率差异不显著(χ2=0.506，P=0.477)，而第1、2季度间的阳性率差异极显著(χ2=9.388，P=0.002)。4个季度间的抗原阳性率差异有显著统计学意义(χ2=10.030，P=0.018)。
表 2 2014—2016年广东省各季度PRRSV抗原和抗体检测阳性率Table 2. The PRRSV antigen and antibody positive rates of different quarters in Guangdong from 2014 to 2016季度 样品数 阳性数 阳性率/% 95%置信区间/% 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 第 1 季度 293 2 225 118 1 690 40.27 75.96 34.61~46.13 74.12~77.72 第 2 季度 335 3 143 96 2 437 28.66 77.54 23.87~33.82 76.04~78.99 第 3 季度 289 2 617 106 1 884 36.68 71.99 31.11~42.52 70.23~73.70 第 4 季度 220 1 447 74 1 105 33.64 76.36 27.42~40.30 74.09~78.53 总计 1 137 9 432 394 7 116 34.65 75.45 31.89~37.50 74.56~76.31 PRRSV抗体阳性率统计结果(表2)显示，第2季度的抗体水平最高，为77.54%(2 437/3 143)，第3季度的抗体水平最低，为71.99%(1 884/2 617)。对各季度的抗体水平间做卡方检验，其中第1、4季度(P=0.776)和第1、2季度间(P=0.176)的抗体水平差异不显著，第2、3季度和第3、4季度的抗体水平差异极显著(P<0.01)，总体4个季度间的抗体水平差异极显著(χ2=129.801，P<0.01)。
2.3 不同区域PRRSV感染的抗原抗体检测结果
对2014—2016年广东省不同区域的PRRSV抗原和抗体阳性率进行统计，结果(表3)显示，粤北地区PRRSV抗原阳性率最高，为47.22%(17/36)；粤东地区抗原阳性率最低，为22.92%(22/96)。由于粤北粤东地区山区多，交通和经济欠发达，采样量较少，因此对不同区域的抗原阳性率不做差异显著性分析。
表 3 2014—2016年广东省各地区PRRSV抗原和抗体检测阳性率Table 3. The PRRSV antigen and antibody positive rates of different regions in Guangdong from 2014 to 2016地区 样品数 阳性数 阳性率/% 95%置信区间/% 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 珠三角 661 5 655 270 4 279 40.85 75.67 37.07~44.70 74.53~76.78 粤东 96 1 620 22 1 126 22.92 69.51 14.95~32.61 67.20~71.74 粤西 344 1 051 85 836 24.71 79.54 20.24~29.62 76.98~81.94 粤北 36 1 106 17 875 47.22 79.11 30.41~64.51 76.60~81.47 总计 1 137 9 432 394 7 116 34.65 75.45 31.89~37.50 74.56~76.31 PRRSV抗体阳性率统计结果(表3)显示，粤西地区的抗体水平最高，抗体阳性率为79.54%(836/1 051)，粤东地区的抗体水平最低，抗体阳性率为69.51%(1 126/1 620)。对各地区的抗体水平做卡方检验，结果表明粤西粤北之间的抗体水平差异不显著(P=0.806)，珠三角和粤北之间的抗体水平差异显著(P=0.014)，其他两两区域之间的抗体水平均差异极显著(P<0.01)，总体4个区域间的抗体水平差异极显著(χ2=48.559，P<0.01)。
2.4 2014—2016年检测的PRRSV ORF5基因的遗传进化分析
2014—2016年广东省抗原检测阳性的病料中共分离到69株PRRSV毒株，其中2014年分离到17株，2015年分离到23株，2016年分离到29株，呈逐年上升趋势，这一点也和按年份统计的抗原阳性率相符。使用DNAstar和MEGA5.0软件对这69株毒株的ORF5基因进行遗传进化分析，结果如图2所示。3年内分离得到的69株PRRSV毒株中，有39株属于Subgenotype I亚群，该亚群以引起2006年国内PRRS大流行的JXA1株为代表[4]，对猪群致病力强，这说明广东省流行的毒株仍然以高致病毒株为主，这些毒株和早期的JXA1等毒株有较近的亲缘关系，提示它们可能是由高致病性野毒或者疫苗毒重组进化而来；有15株分离病毒处于以GM2株为代表的Subgenotype VI亚群上，GM2毒株是近几年国内新出现的毒株，有研究发现该毒株为MLV疫苗毒和QYYZ毒的重组毒[5]，此类毒株在广东省内分离较多，同样需要引起足够重视。此外，还有13株处于以HB-1(sh)_2002株为代表的Subgenotype II亚群上，该亚群中不同的毒株存在着不同程度的缺失，被认为是HP-PRRSV形成过程中的过渡亚群[6]，这说明广东省内的PRRSV毒株仍然在不断进化。剩下1株处于以VR-2332株为代表的Subgenotype IV亚群上；没有分离毒株处于Subgenotype III亚群和Subgenotype V亚群上。综上所述，在2014—2016年间，以JXA1株为代表的Subgenotype I亚群仍然是广东地区PRRSV流行的优势毒株，这提示我们使用该亚群的毒株作为疫苗可能会产生比较好的保护作用，同时我们还应该关注以GM2为代表的Subgenotype VI亚群和以HB-1(sh)_2002株为代表的Subgenotype II亚群，这2个亚群的毒株分离率也比较高。
3. 讨论与结论
PRRSV主要引起种猪的繁殖障碍和呼吸困难，是威胁我国养猪业的头号疫病。该病毒有欧洲型和美洲型2种基因型，目前在国内流行的主要是美洲型[7]。我国于1996年首次分离到PRRSV毒株[8]，之后该病毒不断传播衍化，2006年出现了以在Nsp2基因区域存在30个不连续氨基酸为特征的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，HP-PRRSV传播速度快、致死率高、现有疫苗交叉保护能力弱，对养猪业造成了严重的经济损失[9]，该种毒株在随后的几年里成为了国内猪场流行的优势毒株，并随着相应疫苗的研发应用逐渐得到控制[10]。2014年国内养殖场出现了一种新型的PRRSV毒株，该种毒株与美国2008年分离的NADC30毒株高度同源，统称为NADC30-like毒株[11]，NADC30-like毒株为美国NADC30毒株与国内高致病毒株重组后产生的新毒株，其出现以后也很快在国内传播开[12]，有逐渐取代高致病毒株成为新的优势毒株的趋势，给我国PRRSV的防控带来了新的挑战。
对2014—2016年间广东省规模猪场PRRSV抗原抗体监测情况进行总结分析，结果表明广东省PRRSV感染面积较大，抗原阳性率普遍较高且呈逐年上升趋势；PRRSV抗体水平并不稳定，和2014年相比，2015年和2016年的整体阳性率均有所下降。在2015年年初，广东省出现了1次PRRS疫情波动，PRRSV抗原阳性率上升到1个顶点，该次疫情波动也导致2015年的PRRSV抗体水平呈现出一个不稳定的状态，抗体阳性率时高时低，直到2016年才逐渐稳定，但依然低于2014年的水平。这也和2014—2016年总的抗原抗体阳性率检测结果相吻合。
从抗原抗体的季度统计上看，冬季的PRRSV抗原阳性率显著高于其他季节，这段时间猪场不仅要做好猪舍的保暖通风，还需要应对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)等病毒病的威胁[13]，因此PRRSV的防控难度较大。春季的PRRSV抗原阳性率最低，秋季的抗体阳性率最低但发病率不高，这可能和春秋季节天气温和，适合猪群生长有关。
从地理区域的统计上看，养殖密度最大的珠三角地区抗原阳性率也处于较高的水平，珠三角的冲积平原地形使得该地区成为整个广东省的经济中心，地势平坦但环境复杂且与外界交流频繁。尽管该地区的抗体阳性率处于一个较高的水平，但抗原的检出率依然很高。而粤东地区虽然抗体水平在4个地区中最低，但抗原的检出率也是最低的，可能原因是粤东地区三面环山形成天然的地理屏障，加上该地区猪肉消费基本自给自足，和外界的生猪交流有限，这些因素有利于粤东地区对PRRSV的防控。
PRRSV ORF5基因编码病毒的囊膜蛋白，是病毒变异程度最大的结构蛋白[14]。因此常把ORF5作为PRRSV分子流行病学调查的靶基因。2014—2016年广东省内分离的毒株全部是美洲型，且主要以Subgenotype I亚群为主，Subgenotype VI亚群和Subgenotype II亚群也占一定比例。欧洲型毒株和近年传入中国的NADC30-like毒株在广东省内暂未检测到，但前期研究在其他省份的送检病料中都检出了这2种类型的PRRSV[15]。因此，广东地区的猪场在防控PRRS时，不仅要着重于省内流行的优势亚群的控制，同时还要加强生物安全措施，防止欧洲型毒株和NADC30-like毒株的传入。
总体而言，广东地区PRRSV的感染呈逐年上升趋势，而PRRSV抗体虽然处于一个较高的水平，但并不稳定，结果表明广东省各规模化猪场的免疫水平仍然有需要改善的地方。从季度分析上看，冬季的PRRS发病率要显著高于夏季，因此，各猪场依然需要在冬季严格做好各项防控措施，进一步降低PRRSV的感染。珠三角地区是广东省养猪最为密集的区域，也是广东省的经济核心，高密度的养殖和复杂的环境，使得该区域PRRS发病率处在一个较高的水平。根据ORF5基因进行的遗传进化分析表明，分离毒株所属亚群仍然主要集中在高致病性亚群Subgenotype I，亚群Subgenotype VI和Subgenotype II的分离毒株也占一定比例，这些可以作为猪场选择疫苗的参考信息。
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图 1 2014—2016年间广东省PRRSV抗原抗体阳性率情况
Figure 1. PRRSV antigen and antibody positive rates in Guangdong from 2014 to 2016
表 1 2014—2016年广东省规模猪场PRRSV抗原和抗体检测阳性率
Table 1 The PRRSV antigen and antibody positive rates of scaled pig farms in Guangdong from 2014 to 2016
年份 样品数 阳性数 阳性率/% 95%置信区间/% 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 2014 269 2 824 83 2 340 30.86 82.86 25.39~36.75 81.42~84.23 2015 460 2 657 158 1 830 34.35 68.87 30.01~38.89 67.08~70.63 2016 408 3 951 153 2 946 37.50 74.56 32.79~42.40 73.17~75.92 总计 1 137 9 432 394 7 116 34.65 75.45 31.89~37.50 74.56~76.31 
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表 2 2014—2016年广东省各季度PRRSV抗原和抗体检测阳性率
Table 2 The PRRSV antigen and antibody positive rates of different quarters in Guangdong from 2014 to 2016
季度 样品数 阳性数 阳性率/% 95%置信区间/% 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 第 1 季度 293 2 225 118 1 690 40.27 75.96 34.61~46.13 74.12~77.72 第 2 季度 335 3 143 96 2 437 28.66 77.54 23.87~33.82 76.04~78.99 第 3 季度 289 2 617 106 1 884 36.68 71.99 31.11~42.52 70.23~73.70 第 4 季度 220 1 447 74 1 105 33.64 76.36 27.42~40.30 74.09~78.53 总计 1 137 9 432 394 7 116 34.65 75.45 31.89~37.50 74.56~76.31
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表 3 2014—2016年广东省各地区PRRSV抗原和抗体检测阳性率
Table 3 The PRRSV antigen and antibody positive rates of different regions in Guangdong from 2014 to 2016
地区 样品数 阳性数 阳性率/% 95%置信区间/% 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 抗原 抗体 珠三角 661 5 655 270 4 279 40.85 75.67 37.07~44.70 74.53~76.78 粤东 96 1 620 22 1 126 22.92 69.51 14.95~32.61 67.20~71.74 粤西 344 1 051 85 836 24.71 79.54 20.24~29.62 76.98~81.94 粤北 36 1 106 17 875 47.22 79.11 30.41~64.51 76.60~81.47 总计 1 137 9 432 394 7 116 34.65 75.45 31.89~37.50 74.56~76.31
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