Study on pelletization characteristics of Flammulina velutipes residues
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摘要:目的
以金针菇Flammulina velutipes菌渣为原料，结合生物质成型技术，开展金针菇菌渣成型特性的研究，探索金针菇菌渣能源化利用的新途径。
方法利用万能力学试验机制得成型颗粒，以松弛密度(RDS)、Meyer强度(HM)和比能耗(SEC)为成型燃料的技术指标，研究水分含量、温度、压力和原料粒径4个参数对菌渣原料成型颗粒品质的影响，并通过扫描电镜观察成型颗粒断面微观形态，进一步验证成型条件对成型效果的影响。
结果在选取的水分含量、温度、压力和原料粒径的变化范围之内，菌渣都能压缩成型，结合3个成型指标，确定金针菇菌渣成型的最优工艺参数为：水分含量(w) 11%~14%，温度100~120 ℃，压力3~5 kN，原料粒径0~5 mm。扫描电镜结果表明，在一定范围内温度和压力升高可以使成型颗粒粒子间结合更紧密。
结论金针菇菌渣成型效果良好，是一种较易成型的生物质原料。
Abstract:ObjectiveTo investigate the pelletization characteristics of Flammulina velutipes residues combined with biomass densification technology and explore a new approach to energy utilization of F. velutipes residues.
MethodThe pellets were densified by universal mechanical test mechanism. The effects of moisture content, temperature, compression force and particle size on the quality of pellets were studied using relaxed density (RDS), Meyer hardness (HM) and specific energy consumption (SEC) as technical indexes of densifying fuel. The cross-section microstructure of the pellets was observed by scanning electron microscope (SEM) to further verify the effects of densification conditions on pelletization results.
ResultThe residues were all compressed and formed in the stated ranges of moisture content, temperature, compression force and particle size. Combining three pelletization indexes, the optimum technological parameters of F. velutipes residue molding were confirmed as: moisture content 11%–14%, temperature 100–120 ℃, compression force 3–5 kN and particle size 0–5 mm. SEM observation indicated that the increases of temperature and compression force in reasonable ranges could make the combination of pellet particles closer.
ConclusionF. velutipes residue has a good pelletization performance and is a kind of relatively easily densified biomass material.
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在利用克隆技术生产转基因动物过程中，遗传霉素(Geneticin，G418)是最常用于细胞筛选的药物之一。G418是一种氨基糖苷类抗生素，具有抑制细胞增殖[1]、诱发细胞凋亡[2]等作用，并对原核和真核细胞等都有毒性。虽然有研究显示，G418筛选对转基因细胞核移植胚胎的发育效率有负面作用[3]，但Liu等[4]统计分析了全世界至今已发表的克隆猪生产数据，比较了转基因和非转基因克隆胚胎的发育效率，发现2组之间胚胎的发育效率不存在显著差异。此外，广东温氏研究院动物克隆实验室在前期研究中还发现，利用G418筛选的转基因细胞作为核供体生产的克隆胚胎，其胚胎的发育效率显著高于未经G418处理的非转基因组。虽然上述研究所用的转基因细胞都是经过G418药物筛选处理，但它们同时还携带整合的外源基因，这导致其结果难以准确证明G418筛选供体细胞对转基因克隆胚胎发育效率的影响。
为了探索G418单独处理核供体细胞对克隆胚胎发育效率的影响，从而为将来优化体细胞克隆法制备转基因动物技术奠定基础，本研究利用不同质量浓度G418分别处理猪成体成纤维细胞6 d后，观察不同质量浓度G418处理的细胞生长情况，并检测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(Catalase, CAT)等抗氧化酶相关基因、细胞凋亡基因、甲基化转移酶(DNA methyltransferase, Dnmt)相关基因的表达水平及细胞整体甲基化水平。随后，利用筛选得到的细胞进行核移植，对胚胎发育效率进行统计分析，研究G418处理核供体细胞对猪胚胎体外发育效率的影响。
1. 材料与方法
试验于2015年3—12月在华南农业大学动物科学学院/广东温氏研究院动物克隆实验室完成。
1.1 材料
菌株和细胞株：大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，北京全式金生物技术有限公司；杜洛克公猪成体成纤维细胞由广东温氏研究院动物克隆实验室提供。
主要试剂：细胞DNA&RNA抽提试剂盒(QiagenAllPrepTM DMA/RNA Micro Kit)、反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)为TaKaRa公司产品，实时定量PCR试剂盒(SYBR Select Master Mix)为Life公司产品，亚硫酸盐转化试剂盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit)、甲基化特异PCR酶预混液(ZymoTaqTMPreMix)为ZYMO RESEARCH公司产品，TA连接试剂盒(InsTAcloneTM PCR Cloning Kit)、蓝白斑筛选试剂(X-Gal、IPTG)为Fermentas公司产品，PCR产物纯化试剂盒(E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit)为OMEGA公司产品，G418为GIBCO公司产品。
1.2 方法
1.2.1 猪成体成纤维细胞的复苏与培养
将冻存管从液氮罐中取出，立即投入37 ℃水浴中不停搅动(溶解时间尽量控制在1 min内)，待要完全溶解后，将冻存管内冻存液转移到离心管中，加入3倍体积的DMEM培养液，离心(750 r·min-1，5 min)后，去除上清液。加入新鲜培养液(DMEM+体积分数为10%FBS)悬浮细胞，将细胞稀释到所需浓度并吹打为单层细胞，转入新的培养皿中培养，放置于37 ℃、体积分数为5% CO2的培养箱进行培养。当细胞汇合度达到90%左右时，可进行消化、传代培养。本试验所用细胞为第6代杜洛克公猪成体成纤维细胞。
1.2.2 猪成体成纤维对G418的耐受性试验
将传至第6代的猪成体成纤维细胞接种到24孔板内，待细胞生长至汇合度为50%~60%时，同时将终质量浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900和1 000 μg·mL-1的G418加入到培养孔内，每种质量浓度做3个平行对照。37 ℃连续培养14 d，每2 d换液1次，同时补加相同质量浓度的G418。每天在显微镜下观察细胞生长和死亡情况，确定猪成体成纤维细胞对G418的耐受程度。
1.2.3 G418处理供体细胞
将传至第6代的猪成体成纤维细胞接种于6孔板，放入37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。细胞培养至汇合度为50%时，将G418按照0(对照)、100、200 μg·mL-1加入到细胞培养液中，每个质量浓度4个重复，每2 d换液1次，并每天观察细胞状况。细胞培养至第6天时，收集其中1孔细胞进行体细胞核移植，向另外3孔内加入350 μL RLT裂解液(Qiagen)，涡旋振荡15 s，根据细胞DNA&RNA抽提试剂盒说明书进行细胞DNA和RNA的抽提。
1.2.4 细胞基因组DNA甲基化的测定
利用亚硫酸盐转化试剂盒对细胞基因组DNA进行亚硫酸盐转化，然后进行甲基化PCR扩增，重复序列LINE-1和微卫星引物序列来自许卫华等[5]。反应程序为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃复性25 s，72 ℃延伸30 s，40个热循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃条件保存 > 4 min。PCR产物经过0.03 g·mL-1的琼脂糖凝胶电泳进行特异性鉴定，根据扩增特异性直接利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化、浓度测定。利用TA连接试剂盒将纯化产物连接至pTZ57R/T载体，转化，涂板，挑取白斑进行菌液培养。阳性菌液经PCR鉴定后，送公司测序，每个样品至少要获得15个以上有效测序结果。测序结果经BiQ Analyzer软件分析后，在线(http://biqanalyzer.bioinf.mpiinf.mpg.de/tools/MethylationDiagrams/index.php)制作高分辨率的甲基化串珠图。
1.2.5 反转录及定量PCR
用反转录试剂盒对细胞RNA进行反转录。实时荧光定量PCR用实时荧光定量PCR试剂盒进行，10 μL PCR反应体系，每次3~4个技术重复。实时荧光定量PCR引物序列为β-actin-F：5′-CCACGAGACCACCTTCAACTC-3′，β-actin-R：5′- TGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′； p53-F：5′- GTACATGACCGAGGTGGTGAGG-3′， p53-R：5′- GGC-GTCTTCCAGTGTGATGATG-3′；CAT-F：5′- GAACCCAGCCCTGACAAGATGC-3′，CAT-R：5′- CCAAGGCCGAATGCGTCTGTT-3′；Cu.Zn-SOD-F：5′- CTCTCCCGCTGCTTCTGGTA-3′，Cu.Zn-SOD-R：5′- CGAAGTA-GATGGTGCCCTGC-3′；Mn-SOD-F：5′-GGACAA-ATCTGAGCCCTAACG -3′，Mn-SOD-R：5′- CCTTGTTGAAACCGAGCC -3′；DNMT1、DNMT3a、Bcl-2、Bax引物来自Kumar等[6]，产物长度为100~300 bp。PCR反应参数为：95 ℃预变性、热启动5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃复性15 s，72 ℃延伸20 s，45~50个循环。溶解曲线参数：95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。
1.2.6 克隆胚胎的构建
克隆胚胎的构建按照广东温氏研究院动物克隆实验室方法进行[7]。核移植24 h检测卵裂率，168 h后检测囊胚率，并用Hocchst33342对囊胚进行染色、压片，在荧光显微镜下检测囊胚细胞数。
1.2.7 数据处理及统计分析
基因组相对表达数据分析中，各基因Ct值经过内参基因(β-actin)和对照样品正态化处理后，用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。用软件SPSS17.0进行数据处理，χ2检验进行差异显著性分析。
不同质量浓度G418处理组供体细胞获得的体细胞克隆胚胎的体外发育数据(分裂率、囊胚率和囊胚细胞总数)用χ2检验进行分析。
2. 结果与分析
2.1 猪成体成纤维细胞的G418耐受试验结果
加入不同质量浓度的G418都会导致猪成体成纤维细胞的死亡，细胞死亡后收缩呈点状。G418筛选前后的细胞见图 1。为了摸索出最佳的G418处理质量浓度，分别用100、200、300、400、500、600、700、800、900和1 000 μg·mL-1 G418处理第6代猪成体成纤维细胞，检测细胞对G418的敏感度。常规试验流程中一般以10~14 d内使全部非阳性细胞死亡的G418质量浓度为筛选的最低适宜质量浓度[8]，而本研究结果(表 1)显示，当G418质量浓度为100或200 μg·mL-1时，全部细胞死亡时间为9~11 d。这说明后续试验可用100或200 μg·mL-1作为G418处理细胞的适宜质量浓度。
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图 1 G418筛选前后的猪成体成纤维细胞A、B分别为G418筛选前、后的猪成体成纤维细胞(100×)。Figure 1. Porcine adult fibroblasts after G418 screening表 1 不同质量浓度G418致死所有细胞所需时间Table 1. Cell death time under different concentrations of G418
2.2 G418处理猪成体成纤维细胞对特异基因表达的影响
2.2.1 抗氧化酶相关基因
为了研究G418处理是否导致细胞产生氧化应激，收集0、100和200 μg·mL-1G418处理6 d的猪成体成纤维细胞，分别进行q-PCR，检测抗氧化酶相关基因(Cu.Zn-SOD、Mn-SOD和CAT)在mRNA水平的表达情况。由图 2可见，细胞经G418处理后, 随G418质量浓度的升高Cu.Zn-SOD基因的表达水平显著地升高(P＜0.05)，CAT基因则显著下降(P＜0.05)，200 μg·mL-1 G418处理组的Mn-SOD基因相对表达量也显著下降(P＜0.05)。
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图 2 不同质量浓度G418处理对猪成体成纤维细胞抗氧化酶相关基因表达的影响图中同一基因不同处理间柱上凡是有一个相同小写字母者，表示差异不显著(P > 0.05, χ2检验)。Figure 2. Relative expression of antioxidation-related genes in porcine adult fibroblasts treated with different concentrations of G4182.2.2 细胞凋亡相关基因
为了研究G418处理是否影响细胞凋亡相关基因表达，用荧光定量PCR检测细胞凋亡基因(Bax、 Bcl-2和p53)在0、100和200 μg·mL-1 G418处理6 d的猪成体成纤维细胞内的表达情况。由图 3可见，猪成体纤维细胞经G418处理后, 其促凋亡基因Bax的表达水平随G418质量浓度的升高显著升高(P < 0.05)，抗凋亡基因 Bcl-2 的表达水平也随G418质量浓度显著升高(P < 0.05)，且其升高幅度远大于Bax基因。200 μg·mL-1G418处理组的促凋亡基因 p53 表达量显著降低(P < 0.05)。说明经G418处理后存活的细胞抑制凋亡能力较强。
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图 3 不同质量浓度G418处理对猪成体成纤维细胞凋亡相关基因表达的影响图中同一基因不同处理间柱上凡是有一个相同小写字母者，表示差异不显著(P > 0.05, χ2检验)。Figure 3. Relative expression of apoptosis-related genes in porcine adult fibroblasts treated with different concentrations of G4182.3 G418处理猪成体成纤维细胞对细胞甲基化水平的影响
2.3.1 G418处理猪成体成纤维细胞对细胞基因组DNA甲基化水平的影响
G418处理猪成体成纤维细胞6 d后，各组中重复序列LINE-1和微卫星的差异性甲基化区域(DMR)亚硫酸氢盐测序结果见图 4。猪成体成纤维细胞经0 (对照)、100和200 μg·mL-1 G418处理后，LINE-1的DMR甲基化率分别为62.73%、69.46%和69.98%；微卫星的DMR甲基化率分别为68.12%、65.15%和64.41%。同一个DMR与对照组之间的甲基化率差异性采用χ2检验。结果表明处理组与对照组中LINE-1和微卫星的DMR甲基化水平差异不显著(P > 0.05)。
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图 4 不同质量浓度G418处理猪成体成纤维细胞基因组重复序列甲基化水平的影响图中1~3为3个处理组个体重复；1条链表示1个克隆测序结果，1个圈表示1个CpG，其中，黑色实心圆圈表示甲基化的CpG，白色空心圆圈表示未甲基化的CpG，串珠图中“ǀ ”表示该位点发生非CG或TG突变。A、B、C分别为LINE-1对照组0 μg·mL-1G418、100 μg·mL-1 G418处理组、200 μg·mL-1 G418处理组; D、E、F分别为微卫星对照组0 μg·mL-1G418、100 μg·mL-1 G418处理组、200 μg·mL-1 G418处理组。Figure 4. DNA methylation levels of genomic repeat sequences in porcine adult fibroblasts treated with different concentrations of G4182.3.2 G418处理猪成体成纤维细胞对细胞DNA甲基化酶相关基因表达水平的影响
采用荧光定量PCR技术对不同质量浓度G418处理的猪成体成纤维细胞Dnmt1 和Dnmt3a 基因的mRNA表达进行相对定量分析，结果见图 5。随着G418质量浓度升高，Dnmt1 基因表达量显著降低(P＜0.05)；G418质量浓度为200 μg·mL-1处理组细胞的 Dnmt3a 基因表达显著低于(P＜0.05)对照组和100 μg·mL-1处理组(图 5)。Dnmt1 和Dnmt3a 基因的表达量均有所降低，但并不影响细胞整体甲基化水平。
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图 5 不同质量浓度G418处理对猪成体成纤维细胞DNA甲基化酶相关基因表达的影响图中同一基因不同处理间柱上凡是有一个相同小写字母者，表示差异不显著(P > 0.05, χ2检验)。Figure 5. Relative expression of DNA methylation related genes in porcine adult fibroblasts treated different concentrations of G4182.4 不同质量浓度G418处理对猪体细胞克隆胚胎体外发育的影响
采用100、200 μg·mL-1G418处理6 d后的猪成体成纤维细胞作为供体细胞进行核移植，并在体外培养克隆胚胎发育至囊胚阶段，检测胚胎的融合率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数，结果见表 2。由表 2可见，随着G418质量浓度的升高，融合率、卵裂率显著降低(P < 0.05)；囊胚率100、200 μg·mL-1 G418处理组显著低于(P＜0.05)对照组，但100、200 μg·mL-1 G418处理组间差异不显著(P > 0.05)；囊胚细胞数并没有显著变化(P > 0.05)。G418单独处理核供体细胞可能会使核移植胚胎体外发育能力下降。
表 2 G418处理猪成体成纤维细胞对猪体细胞克隆胚胎体外发育性能的影响1)Table 2. The effects of G418 on the in vitro development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos
3. 讨论与结论
体细胞核移植技术被广泛应用于生产转基因动物，尤其是基因修饰大动物。供体细胞提供克隆胚胎的主要遗传物质，是体细胞克隆成功与否的关键因素之一。供体细胞的细胞形态、周期、活性以及供体的个体差异、性别年龄等都会对克隆效率有影响[9]。
正常机体的自由基氧化作用与抗氧化防御作用处于动态平衡状态。外界环境刺激和机体内氧化反应代谢过程中产生大量活性氧(Reactive oxygen species, ROS)，对酶及转录因子的活化、mRNA表达等有较大的影响[10]。本研究结果显示SOD及CAT基因的mRNA表达水平出现改变，这可能与细胞抵抗外来刺激有关，但细胞的抗氧化能力是否发生改变，更准确的应该在翻译水平上对SOD及CAT基因的活性进行检测。ROS对细胞膜[11]或者DNA[12]产生伤害，促使凋亡相关基因表达的改变而引发细胞凋亡[13]。Bcl-2蛋白家族与 p53基因是重要的细胞凋亡调节因子，两者相互作用，调控细胞凋亡[14]。当Bcl-2和Bax 基因形成异源二聚体比例增加时，抑制细胞凋亡。本研究结果显示，G418处理后细胞 Bcl-2/Bax 基因的比例有所提高，促凋亡基因p53的表达量下调，这可能是细胞自身应对G418所带来的外来刺激而产生的一种自我保护，通过调节自身基因的表达，抑制细胞发生凋亡。
在体细胞核移植中，DNA甲基化是调控供体核内重编程的一种方式，对恢复细胞的全能性、提高体细胞核转移的效率具有重要意义[15]。哺乳动物基因组中，转座元件占到了50%左右，LINE是转座元件中所占比例最大的一种类型。LINE-1是LINE中的主要类型，在染色体中散在分布，约占小鼠和人类基因组的17%~20%[16]。微卫星是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分，随机、广泛地分布于基因组中，大约占到猪全基因组的0.85%[17]。因此LINE-1和微卫星的甲基化水平基本可代表整个基因组的甲基化水平。Dnmt1和Dnmt3a分别是维持DNA甲基化和从头甲基化的关键酶。研究表明，敲除小鼠的Dnmt1 基因，会导致严重的基因组去甲基化或胚胎死亡；敲除Dnmt3a 基因，小鼠在出生后4周内死亡[18]。本研究中，经G418处理后，核供体细胞的Dnmt1 和Dnmt3a 基因的mRNA表达量均显著下调，表明G418会影响细胞内重要DNA甲基转移酶的mRNA表达，但不影响细胞整体甲基化水平。本研究经高质量浓度G418处理后的供体细胞进行核移植所获得的重构胚的融合率、卵裂率和囊胚率均显著低于对照组，而囊胚细胞总数没有显著差异。这说明供体基因组的整体甲基化水平与克隆胚胎的发育能力可能没有必然联系。这可能是核移植之后G418的毒性作用仍然存在于细胞内，从而影响了细胞生长及克隆胚胎的发育性能。顾晓龙等[19]利用RG108处理供体细胞并进行甲基化水平的检测，发现供体细胞整体甲基化水平的改变可能对提高核移植效率没有直接影响。Bonk等[20]使用低密度甲基化芯片技术检测克隆供体细胞、精子、克隆囊胚、体内囊胚等的甲基化水平，同样发现供体细胞整体甲基化水平的差异并非体外生产的囊胚发育率低下的主要原因，而某些区域特定的DNA甲基化修饰才是促进重构胚胎发育的关键。
转基因与非转基因细胞作为供体细胞进行体细胞核移植，两者之间克隆胚胎体外发育效率是否存在差异，当今的报道说法不一，这可能是由于不同类型的供体细胞、培养体系、筛选药物、培养时间、转基因片段大小以及转染方法等差异所造成。本研究经高质量浓度G418处理后的核供体细胞进行核移植所获得的重构胚的融合率、卵裂率和囊胚率均显著低于对照组，而囊胚细胞数没有显著差异，这可能是细胞刚经历外界的刺激后马上进行核移植，G418对细胞仍然存在毒性而影响细胞生长及克隆胚胎的发育性能。后续应在细胞进行G418处理后，撤走药物继续培养传代，使药物的毒性作用降至最低，再进行核移植，可能结果更加客观。
本研究发现经G418处理后的核供体细胞进行核移植，克隆胚胎体外发育效率显著下降。在制备转基因动物时，利用电转或脂质体方法进行转染会影响供体细胞膜，再加入G418进行筛选，会对细胞造成更大的损伤，从而影响转基因克隆胚胎体外发育效率。因此，进行转基因细胞系阳性克隆筛选时可考虑降低G418的质量浓度，或者利用套环法或刮除法结合有限稀释法，减少对供体细胞的伤害，这可能有利于转基因克隆胚胎的发育。
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图 1 成型装置模具图
1：上法兰板；2：下法兰板；3：法兰螺栓；4：螺母；5：压缩杆套筒；6：压杆；7：加热带；8：热电偶；9：电源线；10：模具；11：圆筒底座；12：底座
Figure 1. Assembly drawing of compression molding equipment
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图 6 不同温度下成型颗粒的扫描电镜照片
Figure 6. SEM pictures of pellets at different densifying temperature
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图 7 不同压力下成型颗粒的扫描电镜照片
Figure 7. SEM pictures of pellets under different densifying compression force
表 1 试验参数取值
Table 1 Parameters for pelleting experiments
指标 w(水)/% θ/℃ 压力/kN 原料粒径/mm 取值范围 5~26 40~180 1~8 >0 试验取值 5，8，11，14，
17，20，23，2640，60，80，100，
120，140，160，1801，2，3，4，
5，6，7，80~1，1~2，2~3，
3~4，4~5，>5
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