Optimization of culture condition of Metarhizium anisopliae for destruxin A production by response surface methodology
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摘要:目的
优化绿僵菌Metarhizium anisopliae产绿僵菌素A的培养条件，提高绿僵菌素的产量。
方法应用响应面法设计试验，以Plackett-Burman试验设计和中心组合试验设计筛选得到影响绿僵菌液体发酵的关键因素。
结果试验得到1个拟合程度高、误差小的模型，该模型给出的最佳培养条件为：蔗糖22.7 g·L–1、蛋白胨13.4 g·L–1和发酵时间9.70 d，预测绿僵菌素A最大质量浓度为6.90 μg·mL–1，实际测得质量浓度为6.89 μg·mL–1。
结论结果可为绿僵菌大规模发酵获得粗毒素提供理论依据，使绿僵菌粗毒素的广泛开发与应用成为可能。
Abstract:ObjectiveTo raise the destruxin A production of Metarhizium anisopliae by optimizing culture conditions of liquid fermentation.
MethodExperiments were designed by response surface methodology (RSM). The key factors affecting the liquid fermentation were screened by Plackett-Burman design and central composite design.
ResultA model with high fitting degree and small error was obtained. The optimum culture condition of this model was 22.7 g·L–1 sucrose, 13.4 g·L–1 peptone and 9.70 d for fermentation. The maximum predicted concentration of destruxin A was 6.90 μg·mL–1, while the actual measured concentration was 6.89 μg·mL–1.
ConclusionThe results can provide a theoretical basis for large-scale fermentation of M. anisopliae and production of crude toxin, which can potentially enable the widespread development and application of crude toxin.
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Keywords:
- Metarhizium anisopliae /
- destruxin /
- yield /
- response surface methodology /
- liquid fermentation /
- culture condition
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绿僵菌素又称为腐败素或破坏素，最初是从金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae发酵液中分离得到，是由1个α–羟基酸和5个氨基酸残基组成的环缩肽类化合物，目前共分离到40余种类似物，其中绿僵菌素A、B和E的活性较高[1]。绿僵菌素除具有杀虫活性外，还具有除草、抗病毒等活性[2-4]。在绿僵菌侵染寄主的过程中分泌的绿僵菌素可以加速昆虫的死亡，所以绿僵菌素与绿僵菌的致病力密切相关[5-6]。目前，国内对绿僵菌的研究主要集中于绿僵菌发酵获得大量分生孢子方面，鲜有探索绿僵菌产毒素培养条件的优化。蔡守平[7]优化了绿僵菌固体发酵培养基，以500 g固体培养基加400 mL水后灭菌，绿僵菌产孢量最高，达到8.11×109 g–1。许天委等[8]优化金龟子绿僵菌固液双相发酵条件后，得到较适合的培养基，在液体培养时分生孢子达到4.30×109 L–1，菌丝生长量达到5.99 g·L–1；固体发酵时，浅盘发酵法优于袋装发酵法，培养7 d的产粉量可达16.10 mg·g–1。通常绿僵菌素产量较低，分离提纯较为困难，所以优化绿僵菌产毒素发酵条件，提高毒素产量获得粗毒素显得至关重要[9]。将绿僵菌发酵液经过萃取浓缩即可获得绿僵菌粗毒素，提取工艺简单且粗毒素中同时含有多种绿僵菌素，生产成本相对比获得绿僵菌素纯品要低。
响应面法是将试验设计与数学建模综合起来的一种试验设计优化方法，通过对关键因素进行优化试验，获得回归拟合模型，并得到各因素的最优值[10]。响应面法具有试验次数少、设计合理，能够同时研究多个因素间的交互作用等优点，已在工程机械、微生物发酵、物质提取等领域得到广泛应用[11-13]。本研究利用响应面法探索绿僵菌产毒素的培养条件，以期提高粗毒素的产量，为绿僵菌素的开发和应用奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
金龟子绿僵菌菌株M25，来自广东省林业科学研究院林业生物杀虫剂研究团队。
高效液相色谱仪1100(安捷伦公司)；SW-CJ-IBU型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；DHZ-D型恒温振荡器(太仓试验设备厂)；HVE-50型高压灭菌器(日本株式会社平山制作所)；1702-MP8型电子天平(德国Startorius公司) 。
1.2 方法
1.2.1 绿僵菌素A标准液配制
准确称取10.00 mg绿僵菌素A标准品，用适量色谱乙腈溶解，转移至100 mL容量瓶，用色谱乙腈定容至刻度，配置成100 μg·mL–1绿僵菌素A标准品储备液，备用。
1.2.2 绿僵菌素A的提取制备
绿僵菌素A的提取制备参照文献[14]的方法，将绿僵菌发酵液进行多次反复抽滤，将滤液pH调节至2~4，与等体积的萃取剂【V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶1】混匀进行萃取，连续萃取3次，每次萃取2 h。将分离到的有机相于50 ℃条件下旋转蒸发浓缩，得到的黄色黏稠物用丙酮溶解，在50 ℃条件下烘干得到粗毒素。
1.2.3 绿僵菌素A的鉴定
将提取制备的粗毒素用色谱乙腈溶解稀释后，过0.45 μm的滤膜，然后在高效液相色谱 （HPLC） 仪上进行鉴定。色谱条件参考Hu等[15]的方法：Agilent ZORBAX SB-C18液相色谱柱(5 μm，4.6×250 mm)，流动相为V(乙腈)∶V(水)=45∶55，流速1 mL·min–1，进样量25 μL，温度25 ℃，检测波长为215 nm。
1.2.4 单因素试验设计
选取蔗糖(C源)、pH、温度、培养时间、转速、蛋白胨(N源)、装液量、氨基酸共8个影响绿僵菌素A产量的因素进行单因素试验设计。
1.2.5 Plackett-Burman试验设计
在单因素试验设计的基础上，应用Plackett-Burman试验设计确定影响绿僵菌产毒素的关键因素。根据试验结果确定Plackett-Burman试验设计中因素的水平(表1)，每个因素2个水平，包括虚拟因素。
表 1 Plackett-Burman试验设计因素水平表Table 1. Factors and levels of Plackett-Burman design水平 因素 ρ(蔗糖)/
(g·L–1)pH θ/℃ 转速/
(r·min–1)t培养/d ρ(蛋白胨)/
(g·L–1)装液量/
(mL·L–1)ρ(β–丙氨酸)/
(g·L–1)–1 5 5 24 140 6 5 200 1 1 25 10 32 220 11 20 500 2 1.2.6 响应面中心组合试验设计
以单因素试验设计结果为依据，对关键因素蔗糖质量浓度、发酵时间和蛋白胨质量浓度，利用响应面中心组合试验设计原理，以绿僵菌素A质量浓度为响应值，设计3因素3水平的响应面试验(表2)。
表 2 中心组合试验设计因素水平表Table 2. Factors and levels of central composite design水平 因素 ρ(蔗糖)/(g·L–1) ρ(蛋白胨)/(g·L–1) t培养/d –1 15 5 7 0 20 10 9 1 25 15 11 1.3 数据处理
以上每组试验均重复3次，试验数据采用Microsoft Excel 2016进行处理，响应面试验设计和数据统计分析采用Design-Expert 8.0软件。
2. 结果与分析
2.1 绿僵菌素A标准曲线
将绿僵菌素A储备液稀释成0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μg·mL–1系列标准液，按照方法中色谱条件测定。绿僵菌A标准品和发酵液HPLC色谱图见图1。以峰面积为纵坐标，绿僵菌素A质量浓度为横坐标，建立标准曲线，得到线性回归方程：y=27.046x–8.328，决定系数为0.993。
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图 1 绿僵菌素A标准品和发酵液HPLC色谱图Figure 1. HPLC chromatogram of destruxin A standard substance and fermentation broth2.2 单因素试验结果与分析
蔗糖为绿僵菌的生长繁殖提供碳源，考察不同蔗糖含量对绿僵菌素A产量的影响，试验结果见图2a。蔗糖质量浓度在0~20 g·L–1时，随蔗糖质量浓度增加，绿僵菌产绿僵菌素A的质量浓度增加。当蔗糖为20 g·L–1时，绿僵菌素A的质量浓度达到最大值(6.48 μg·mL–1)。之后绿僵菌素A的质量浓度随蔗糖质量浓度增加而下降。
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图 2 各因素对绿僵菌素A产量的影响Figure 2. Effects of different factors on the production of destruxin ApH对绿僵菌产毒素A的影响见图2b，在pH=7时，绿僵菌素A的产量最高，质量浓度达到6.32 μg·mL–1；在pH=8时，绿僵菌素A质量浓度为6.19 μg·mL–1，比在pH=7条件下略低。当pH偏酸或偏碱时，绿僵菌素A的产量受抑制。因此，绿僵菌产毒素A的最适pH为7。
温度对绿僵菌产绿僵菌素A的影响见图2c，温度在24~28 ℃条件下，绿僵菌素A的质量浓度随温度升高而增加，温度高于28 ℃，绿僵菌素A质量浓度下降。在28 ℃时绿僵菌素A质量浓度达最大值(6.29 μg·mL–1)；30 ℃时绿僵菌素A质量浓度为6.11 μg·mL–1；其余温度下均低于6.00 μg·mL–1。
转速对绿僵菌产绿僵菌素A的影响见图2d，当转速在140~220 r·min–1时，随发酵液转速的增加，绿僵菌素A的质量浓度增大，当发酵时的转速为220 r·min–1，绿僵菌素A的质量浓度最大，达到6.45 μg·mL–1。
发酵培养时间对绿僵菌产绿僵菌素A的影响见图2e，在发酵时间内，绿僵菌素A的质量浓度呈先增加后略有下降的趋势。发酵6~9 d，绿僵菌素A质量浓度随发酵时间延长而不断增大。在第9天达到最大值(6.51 μg·mL–1)；在第8、10和11天时的质量浓度分别为6.11、6.34和6.29 μg·mL–1。绿僵菌产毒素A最佳发酵培养时间为9 d。
蛋白胨含量对绿僵菌发酵产生绿僵菌素A的影响见图2f，蛋白胨质量浓度在5~10 g·L–1时，随着蛋白胨质量浓度的增加绿僵菌素A的质量浓度增加。在蛋白胨质量浓度为10 g·L–1时，绿僵菌素A的质量浓度达到最大值(6.33 μg·mL–1)，在蛋白胨质量浓度为15和20 g·L–1时，绿僵菌素A的质量浓度分别为6.24和6.18 μg·mL–1。
发酵时培养基装液量对绿僵菌产生绿僵菌素A的影响见图2g，结果显示，当1 L的三角瓶中，装有300 mL发酵液时，绿僵菌素A的质量浓度最大，为6.35 μg·mL–1，在其他装液量条件下，绿僵菌素A质量浓度均小于6.00 μg·mL–1；随着装液量的增加，三角瓶中空间减小，空气量下降，绿僵菌发酵受到影响。
氨基酸对绿僵菌产绿僵菌素A的影响见图2h，3种氨基酸中β–丙氨酸对促进绿僵菌分泌绿僵菌素A的效果最好，绿僵菌素A质量浓度为6.46 μg·mL–1；添加甘氨酸、赖氨酸时，绿僵菌素A的质量浓度分别为6.21和6.04 μg·mL–1。
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图 3 蔗糖与蛋白胨交互影响的响应曲面和等高线图Figure 3. Response surface and contour of interaction between sucrose and peptone contents2.3 Plackett-Burman试验设计结果与分析
Plackett-Burman试验设计采用N=12的设计方法，分析了11个因素对绿僵菌产毒素A的影响。有3个虚拟因素，其余8个因素为蔗糖质量浓度、pH、温度、培养时间、转速、蛋白胨质量浓度、装液量、β–丙氨酸质量浓度。试验结果见表3。利用Design-Expert软件数据进行处理和显著性分析。由表4可以看出，蔗糖质量浓度、培养时间和蛋白胨质量浓度对绿僵菌产毒素A发酵培养影响显著(P<0.05)，其贡献值分别为27.30%、17.27%和29.88%。
表 3 Plackett-Burman试验设计及结果Table 3. Plackett-Burman design and results试验号 因素及水平 ρ(绿僵菌素A)/(μg·mL–1) 蔗糖质量浓度 pH 温度 转速 培养时间 蛋白胨质量浓度 装液量 β–丙氨酸质量浓度 实际值 预测值 1 1 –1 1 1 –1 1 1 1 5.26 4.92 2 –1 1 –1 1 1 –1 1 1 3.54 3.08 3 –1 –1 –1 –1 –1 –1 –1 –1 2.26 1.92 4 1 –1 1 1 1 –1 –1 –1 4.93 4.92 5 1 1 –1 1 1 1 –1 –1 6.55 6.56 6 –1 –1 –1 1 –1 1 1 –1 2.99 3.33 7 1 –1 –1 –1 1 –1 1 1 3.81 4.27 8 –1 –1 1 –1 1 1 –1 1 4.91 4.80 9 –1 1 1 –1 1 1 1 –1 2.94 3.05 10 –1 1 1 1 –1 –1 –1 1 1.88 2.34 11 1 1 –1 –1 –1 1 –1 1 5.17 5.16 12 1 1 1 –1 –1 –1 1 –1 1.89 1.78 表 4 Plackett-Burman试验的方差分析Table 4. Variance analysis of Plackett-Burman design因素 效应 F P1) 贡献值/% 重要性 蔗糖质量浓度 1.52 20.56 0.020 1* 27.30 2 pH –0.37 1.19 0.354 5 1.58 8 温度 –0.42 1.57 0.299 2 2.08 7 转速 0.70 4.33 0.129 0 5.74 5 培养时间 1.21 13.01 0.036 6* 17.27 3 蛋白胨质量浓度 1.59 22.51 0.017 8* 29.88 1 装液量 –0.88 6.91 0.078 4 9.17 4 β–丙氨酸质量浓度 0.50 2.25 0.230 2 2.99 6 1)“*”表示该因素的影响达到显著水平(P＜0.05，t 检验) 2.4 响应面中心组合设计结果与分析
由表4可知，蔗糖、蛋白胨质量浓度和培养时间为对绿僵菌产毒素A发酵培养的显著影响因子，对其进行中心组合试验设计，设计结果见表5。获得二次拟合回归方程：y=6.40+0.36x1+0.93x2+0.35x3+0.13x1x2+0.02x1x3–2.50×10–3x2x3–0.49x12–0.60x22–0.62x32，式中，y为绿僵菌素A的质量浓度，x1、x2和x3分别代表蔗糖、蛋白胨质量浓度和培养时间。对该回归模型进行方差分析(表6)可知，模型的失拟项P=0.056 1>0.05，不显著；模型P<0.000 1，表明所得模型达到极显著水平。模型校正决定系数(R2adj)为0.970 4，说明该模型能解释97.04%的响应值；模型的决定系数(R2)为0.984 4，表明该模型拟合程度高、试验误差小，可以对试验结果进行准确预测和分析。在模型中因素A、B、C、A2、B2及C2 6项的P<0.000 1，具有极高的显著性。
表 5 响应面中心组合设计及结果Table 5. Central composite design and results试验号 因素及水平 ρ(毒素A)/
( μg·mL–1)蔗糖质量
浓度(A)蛋白胨质量
浓度(B)培养时
间(C)实际值 预测值 1 1 –1 –1 3.52 3.60 2 1 –1 1 4.43 4.34 3 –1 1 –1 4.57 4.80 4 –1.682 0 0 4.59 4.40 5 –1 1 1 5.39 5.45 6 0 0 0 6.55 6.40 7 –1 –1 –1 3.30 3.18 8 0 –1.682 0 3.13 3.12 9 0 0 0 6.54 6.40 10 0 0 0 6.35 6.40 11 1 1 1 6.20 6.46 12 0 0 1.682 5.45 5.23 13 0 0 0 6.31 6.40 14 1.682 0 0 5.62 5.60 15 1 1 –1 5.84 5.73 16 0 1.682 0 6.46 6.26 17 0 0 0 6.26 6.40 18 0 0 0 6.34 6.40 19 0 0 –1.682 4.04 3.85 20 –1 –1 1 3.59 4.06 表 6 响应面模型方差分析1)Table 6. Variance analysis of response surface model来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 27.44 9 3.05 70.20 <0.000 1** A 1.74 1 1.74 40.02 <0.000 1** B 11.92 1 11.92 274.51 <0.000 1** C 1.65 1 1.65 38.06 0.000 1** AB 0.13 1 0.13 2.99 0.114 2 AC 3.20×10–3 1 3.20×10–3 0.07 0.791 6 BC 5.00×10–5 1 5.00×10–5 1.15×10–3 0.973 6 A2 3.52 1 3.52 80.96 <0.000 1** B2 5.25 1 5.25 120.87 <0.000 1** C2 5.56 1 5.56 128.06 <0.000 1** 残差 0.43 10 0.04 失拟项 0.36 5 0.07 4.75 0.056 1 纯误差 0.08 5 0.02 总和 27.87 19 1)A、B、C分别为蔗糖质量浓度、蛋白胨质量浓度和培养时间；“**”表示达极显著水平(P<0.001，t检验)；R2=0.984，R2adj=0.970 4 利用Design-Expert8.0软件绘出模型中AB、AC和BC交互项的等高线图和响应曲面图(图3、图4和图5)。响应曲面的陡峭程度，反映了因素对试验的影响程度，如果曲面陡峭程度高，说明该因素对试验结果影响大，反之，则对试验结果影响小。从曲面图(图3a、4a、5a)可知，蔗糖质量浓度、蛋白胨质量浓度和培养时间之间，当其中1个因素固定时，绿僵菌素A的质量浓度随另2个因素的增加先增加后下降，这说明3个因素与绿僵菌素A的浓度间存在交互作用。
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图 4 蔗糖与培养时间交互影响的响应曲面和等高线图Figure 4. Response surface and contour of interaction between sucrose content and fermentation time![]()
图 5 蛋白胨与培养时间交互影响的响应曲面和等高线图Figure 5. Response surface and contour of interaction between peptone content and fermentation time2.5 最佳培养条件的确立与验证
用软件对模型回归方程进行解析，得出最佳培养条件：蔗糖(C源)为22.7 g·L–1、蛋白胨(N源)为13.4 g·L–1和培养时间9.70 d，绿僵菌素A最大质量浓度为6.90 μg·mL–1。考虑到实际操作条件，将最佳方案调整为蔗糖(C源)23.0 g·L–1、蛋白胨(N源)13.0 g·L–1和培养时间9.50 d，试验重复3次。应用调整后的方案培养绿僵菌，根据绿僵菌素A标准曲线计算得到绿僵菌素A质量浓度平均值为6.89 μg·mL–1，与模型预测值无显著差异。
3. 讨论与结论
绿僵菌分泌的绿僵菌素具有杀虫、除草、抗病毒活性；还具有一定的药理活性，其对引起阿尔茨海默病的β–淀粉样蛋白的产生有抑制作用[16]；还可作为与肿瘤、糖尿病和肾小管酸中毒等疾病形成有关的V-ATPases的抑制剂[17-19]。
响应面法作为一种试验设计优化方法，与正交试验相比，可以减少试验次数且试验设计较为合理，能够同时研究多个因素间的交互作用，已广泛应用于微生物发酵培养条件的优化等领域。张婧迪等[20]应用响应面法优化了金龟子绿僵菌固体发酵培养条件，最佳培养基条件下实际产孢量达6.94×109g–1。张棋等[21]应用响应面法优化了金龟子绿僵菌液体发酵培养基，优化后绿僵菌生物量达16.52 g·L–1，比优化前提高37.24%。本研究应用响应面法，筛选出了与绿僵菌产毒素有关的3个关键因素：蔗糖质量浓度、发酵时间和蛋白胨质量浓度。试验得到可靠和预测能力高的模型，优化后的最佳培养条件为：蔗糖23 g·L–1、蛋白胨13 g·L–1、β–丙氨酸2 g·L–1、培养时间9.50 d、pH为7~8、温度28 ℃、转速220 r·min–1以及1 L的三角瓶中装300 mL培养基。模型预测绿僵菌素A质量浓度为6.90 μg·mL–1，验证后实际质量浓度达6.89 μg·mL–1，比优化前绿僵菌素A产量提高8%以上。通常情况下，绿僵菌对毒素的产量较低，同时绿僵菌素的分离纯化工艺过程复杂、成本较高，使得绿僵菌素的推广应用受到制约。本研究结果为绿僵菌大规模发酵获得绿僵菌粗毒素提供了理论依据，同时也使得绿僵菌粗毒素的广泛开发与应用成为可能。
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图 1 绿僵菌素A标准品和发酵液HPLC色谱图
Figure 1. HPLC chromatogram of destruxin A standard substance and fermentation broth
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图 2 各因素对绿僵菌素A产量的影响
Figure 2. Effects of different factors on the production of destruxin A
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图 3 蔗糖与蛋白胨交互影响的响应曲面和等高线图
Figure 3. Response surface and contour of interaction between sucrose and peptone contents
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图 4 蔗糖与培养时间交互影响的响应曲面和等高线图
Figure 4. Response surface and contour of interaction between sucrose content and fermentation time
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图 5 蛋白胨与培养时间交互影响的响应曲面和等高线图
Figure 5. Response surface and contour of interaction between peptone content and fermentation time
表 1 Plackett-Burman试验设计因素水平表
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design
水平 因素 ρ(蔗糖)/
(g·L–1)pH θ/℃ 转速/
(r·min–1)t培养/d ρ(蛋白胨)/
(g·L–1)装液量/
(mL·L–1)ρ(β–丙氨酸)/
(g·L–1)–1 5 5 24 140 6 5 200 1 1 25 10 32 220 11 20 500 2 
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表 2 中心组合试验设计因素水平表
Table 2 Factors and levels of central composite design
水平 因素 ρ(蔗糖)/(g·L–1) ρ(蛋白胨)/(g·L–1) t培养/d –1 15 5 7 0 20 10 9 1 25 15 11
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表 3 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 3 Plackett-Burman design and results
试验号 因素及水平 ρ(绿僵菌素A)/(μg·mL–1) 蔗糖质量浓度 pH 温度 转速 培养时间 蛋白胨质量浓度 装液量 β–丙氨酸质量浓度 实际值 预测值 1 1 –1 1 1 –1 1 1 1 5.26 4.92 2 –1 1 –1 1 1 –1 1 1 3.54 3.08 3 –1 –1 –1 –1 –1 –1 –1 –1 2.26 1.92 4 1 –1 1 1 1 –1 –1 –1 4.93 4.92 5 1 1 –1 1 1 1 –1 –1 6.55 6.56 6 –1 –1 –1 1 –1 1 1 –1 2.99 3.33 7 1 –1 –1 –1 1 –1 1 1 3.81 4.27 8 –1 –1 1 –1 1 1 –1 1 4.91 4.80 9 –1 1 1 –1 1 1 1 –1 2.94 3.05 10 –1 1 1 1 –1 –1 –1 1 1.88 2.34 11 1 1 –1 –1 –1 1 –1 1 5.17 5.16 12 1 1 1 –1 –1 –1 1 –1 1.89 1.78
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表 4 Plackett-Burman试验的方差分析
Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman design
因素 效应 F P1) 贡献值/% 重要性 蔗糖质量浓度 1.52 20.56 0.020 1* 27.30 2 pH –0.37 1.19 0.354 5 1.58 8 温度 –0.42 1.57 0.299 2 2.08 7 转速 0.70 4.33 0.129 0 5.74 5 培养时间 1.21 13.01 0.036 6* 17.27 3 蛋白胨质量浓度 1.59 22.51 0.017 8* 29.88 1 装液量 –0.88 6.91 0.078 4 9.17 4 β–丙氨酸质量浓度 0.50 2.25 0.230 2 2.99 6 1)“*”表示该因素的影响达到显著水平(P＜0.05，t 检验)
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表 5 响应面中心组合设计及结果
Table 5 Central composite design and results
试验号 因素及水平 ρ(毒素A)/
( μg·mL–1)蔗糖质量
浓度(A)蛋白胨质量
浓度(B)培养时
间(C)实际值 预测值 1 1 –1 –1 3.52 3.60 2 1 –1 1 4.43 4.34 3 –1 1 –1 4.57 4.80 4 –1.682 0 0 4.59 4.40 5 –1 1 1 5.39 5.45 6 0 0 0 6.55 6.40 7 –1 –1 –1 3.30 3.18 8 0 –1.682 0 3.13 3.12 9 0 0 0 6.54 6.40 10 0 0 0 6.35 6.40 11 1 1 1 6.20 6.46 12 0 0 1.682 5.45 5.23 13 0 0 0 6.31 6.40 14 1.682 0 0 5.62 5.60 15 1 1 –1 5.84 5.73 16 0 1.682 0 6.46 6.26 17 0 0 0 6.26 6.40 18 0 0 0 6.34 6.40 19 0 0 –1.682 4.04 3.85 20 –1 –1 1 3.59 4.06
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表 6 响应面模型方差分析1)
Table 6 Variance analysis of response surface model
来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 27.44 9 3.05 70.20 <0.000 1** A 1.74 1 1.74 40.02 <0.000 1** B 11.92 1 11.92 274.51 <0.000 1** C 1.65 1 1.65 38.06 0.000 1** AB 0.13 1 0.13 2.99 0.114 2 AC 3.20×10–3 1 3.20×10–3 0.07 0.791 6 BC 5.00×10–5 1 5.00×10–5 1.15×10–3 0.973 6 A2 3.52 1 3.52 80.96 <0.000 1** B2 5.25 1 5.25 120.87 <0.000 1** C2 5.56 1 5.56 128.06 <0.000 1** 残差 0.43 10 0.04 失拟项 0.36 5 0.07 4.75 0.056 1 纯误差 0.08 5 0.02 总和 27.87 19 1)A、B、C分别为蔗糖质量浓度、蛋白胨质量浓度和培养时间；“**”表示达极显著水平(P<0.001，t检验)；R2=0.984，R2adj=0.970 4
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