Effects of surfactants on fermentation of Streptomyces galilaeus AF1
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摘要:目的
研究表面活性剂对加利利链霉菌Streptomyces galilaeus AF1菌株发酵的影响。
方法利用单因素试验优化表面活性剂的添加种类、初步浓度及最佳添加时间，采用Box-Behnken试验和响应面分析对表面活性剂添加质量浓度进行组合优化。流式细胞仪测定细胞荧光强度，确定表面活性剂对AF1菌株细胞膜的影响。
结果表面活性剂的最优添加质量浓度：吐温–80为8.95 g·L–1、曲拉通X–100为2.09 g·L–1、山梨醇为3.89 g·L–1，最优添加时间为接种后5 d；细胞膜透性测定结果表明，试验组的AF1菌株细胞荧光强度极显著高于对照组。
结论试验得到的响应面模型对因变量的解释程度达94.89%，具有实际意义；添加最优表面活性剂组合后，加利利链霉菌AF1的细胞膜通透性极显著增大，间接导致胞内活性物质的外排量增加，提高了抗菌活性物质的生物合成量。
Abstract:ObjectiveTo study the effects of surfactants on fermentation of Streptomyces galilaeus AF1 strain.
MethodThe single factor experiments were performed to optimize the surfactant type and the initial concentration and determine the best adding time. The Box-Behnken test design and response surface analysis were used to determine the most appropriate concentrations of surfactants. Flow cytometer instrument was used to measure the cell fluorescence intensity and investigate the effects of surfactant on cell membranes of AF1.
ResultThe optimum concentrations of added surfactants were 8.95 g·L–1 Tween-80, 2.09 g·L–1 Triton X-100 and 3.89 g·L–1 sorbitol. The best adding time was five days after inoculation. The membrane permeability test results showed that the cell fluorescence intensity of AF1 of the test group was significantly higher than that of the control group.
ConclusionThe response surface model explained 94.89% of the variation in the dependent variables and therefore had practical significance. Membrane permeability of the AF1 strain significantly increased after adding the optimal surfactants complex, which led to increased efflux of intracellular active substance and biosythesis of antibacterial substance.
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Keywords:
- Streptomyces galilaeus /
- AF1 strain /
- surfactant /
- fermentation /
- response surface /
- cell membrane permeability
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普通野生稻Oryza rufipogon Griff.是亚洲栽培稻O. sativa L.的祖先种, 经过长期的自然选择，蕴藏着大量可供育种利用的基因资源[1]。因此，保护和利用普通野生稻是该领域科研工作者关注的重点。许多研究表明，我国普通野生稻遗传多样性丰富且地域特性明显[2]。王美兴等[3]利用36对SSR引物对889份中国普通野生稻进行遗传多样性分析，平均多态性指数为0.782 7，提出广东和广西的普通野生稻具有较高的遗传多样性。韩东飞[4]按照纬度高低对中国境内20个居群的628份野生稻材料进行遗传多样性研究, 发现我国普通野生稻具有较高的遗传多样性并提出两广南部北回归线以南的居群遗传多样性较高。对全国不同省份普通野生稻遗传多样性的估值也表明，广西普通野生稻具有丰富的遗传多样性[5-10]。近年来，一些学者对广西普通野生稻遗传多样性有不同程度的研究[11-17]。余萍等[11]利用34对SSR引物对中国普通野生稻初级核心种质中223份广西普通野生稻进行遗传多样性分析，平均等位变异数为24.91。黄娟等[12]利用36对SSR引物对广西27个居群690份普通野生稻材料进行遗传多样性分析，平均等位基因数为9.86，并把广西区域的普通野生稻划分为3个类群4个特征区域。但由于所研究群体的规模、分布及材料代表性等的不同, 导致不同学者对广西普通野生稻遗传多样性的评价各异。在遗传多样性评价的基础上建立普通野生稻核心种质的研究鲜见报道。2012年Huang等[18]比较了世界各国和我国各省区的普通野生稻资源，认为广西是我国普通野生稻遗传多样性中心和栽培稻的起源中心，但广西的普通野生稻多样性中心具体在哪里没有进行追踪。
本研究对来自广西的郁江流域、红水河流域、南流江域以及桂北山区的9个居群进行遗传多样性分析，并在此基础上构建了广西普通野生稻的核心种质。以期对广西野生稻遗传多样性进行有效的保护和利用, 为普通野生稻遗传多样性形成机制的研究、以及优异基因资源的发掘和利用提供理论依据和核心材料。
1. 材料与方法
1.1 材料
从郁江流域、红水河流域、南流江域和桂北山区的9个居群收集623份材料(表 1)。
表 1 来自广西4个区域的普通野生稻材料Table 1. Materials of common wild rice from four regions in Guangxi
1.2 方法
1.2.1 DNA提取水稻叶片DNA提取参考Chen等[19]的CTAB法。
1.2.2 多态性标记筛选
从水稻基因组SSR图谱中，挑选出均匀分布在水稻12条染色体上的且能扩增出多态性的24对引物(表 2)进行PCR分析。SSR标记引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表 2 广西普通野生稻遗传多样性参数1)Table 2. Parameters of genetic diversity of common wild rice in Guangxi
1.2.3 PCR扩增
PCR体系20 μL：10×PCR Buffer(含15 mmol·L-1 MgCl2) 2.0 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.4 μL，15 μmol·L-1正反引物各1.0 μL，5 U·μL-1Taq酶0.2 μL, 25 ng ·μL-1 DNA 1.0 μL, ddH2O 14.4 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s，(50~57) ℃退火45 s, 72 ℃延伸30 s, 共40个循环, 72 ℃延伸5 min。扩增产物在60 g·L-1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳, 用银染法染色后拍照。用图形处理软件Photoshop中的标尺工具和参考工具分析图片中的DNA片段，扩增谱带均以“0”或“1”建立数据库，扩增带存在时记为“1”，不存在时记为“0”，最后将条带数据转换为基因型数据。
1.2.4 多样性分析
根据每个个体产生的条带位置确定基因型，采用Popgene统计各居群的平均等位基因数(A), 有效等位基因数(Ae)，Shannon信息指数(I)，平均期望杂合度(He)，实际观察杂合度(Ho)，平均多态信息含量(PIC)。运用Popgen软件进行了遗传距离和遗传一致度分析。采用Upgma方法运行Ntsys2.10软件的Shan程序进行聚类分析。
1.2.5 核心种质构建
核心种质构建参考Hu等[20]提出的逐步聚类法。在利用24对SSR标记对623份材料进行遗传多样性分析的基础上，进行第1次聚类分析，遗传距离相同或极相近的同类材料只选1个代表编号，得到初次聚类核心样本；利用96对SSR标记对初次核心样本进行第2次聚类分析，得到10%核心样本，构建出10%核心聚类图；对第2次的10%核心样本进行第3次聚类分析，得到5%核心样本，构建出5%核心聚类图。进一步分析核心样本的遗传多样性特征、地理分布、来源等。
2. 结果与分析
2.1 广西普通野生稻不同基因位点的遗传多样性
利用筛选出的24对SSR引物对623份材料进行遗传多样性分析，相关结果列于表 2。从表 2可以看出，24个SSR位点共检测到114个等位变异，每个位点的平均等位基因数(A)最高为7(RM586)，最低为3(RM537)，平均为4.75；有效等位基因数(Ae)最高为4.476 3(RM257)，最低为1.161 7(RM330A)，平均为3.000 1；Shannon信息指数(I)最高为1.544 3 (RM257)，最低为0.313 0 (RM330A)，平均为1.180 1；实际观察杂合度(Ho)最高为0.566 6(RM257)，最低为0.041 7(RM528)，平均为0.175 8；平均期望杂合度(He)最高为0.777 2(RM257)，最低为0.139 3(RM330A)，平均为0.638 8。
2.2 广西普通野生稻不同居群间遗传多样性比较
9个居群的遗传多样性和地理分布见图 1和表 3。从图 1可以看出：邕宁、扶绥、贵港和平南属于郁江流域，临桂属于桂北山区，古棚和五里塘属于红水河流域，博白和容县属于南流江域。从表 3可以看出，9个普通野生稻居群的遗传多样性指数大小顺序为：邕宁居群(YN) > 临桂居群(LG) > 扶绥居群(FS) > 容县居群(RX) > 贵港居群(GG) > 平南居群(PN) > 古棚居群(GP) > 五里塘居群(WLT) > 博白居群(BB)。不同流域居群A的变化范围为2.946 7(HSH)~4.010 8(YJ)，Ae的变化范围为0.139 3(HSH)~9.512 1(YJ)，He的变化范围0.001 3(HSH)~2.053 9(YJ)。A最大的为郁江流域(YJ)，最小的为红水河流域(HSH)，表明郁江流域(YJ)是广西普通野生稻的遗传多样性中心(表 2)。
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图 1 广西普通野生稻9个主要居群的地理分布Figure 1. Geographic distributions of nine main regional populations of common wild rice in Guangxi表 3 广西普通野生稻9个居群的遗传多样性1)Table 3. Genetic diversities of nine regional populations of common wild rice in Guangxi
2.3 广西普通野生稻核心种质初步构建
采取逐步聚类的方法，构建了10%和5%的核心样本，其遗传多样结果见表 4、聚类分析结果见图 2和图 3。从表 4和图 2可以看出，10%的核心样本材料间遗传距离较近，为0.38，其A能保持原始样本的92%以上，Ae、I、He和平均多态信息含量(PIC)等4个参数比原始样本的分别高3.70%、2.86%、3.22%和2.46%。图 3表明，5%核心样本的材料间遗传距离较远，达到了0.54，其A保持原始样本的89%以上，Ae和I比10%的核心样本有较大的下降，但仍分别比原始样本高2.12%和1.79%, He比原始样本高3.40%，比10%的核心样本也有所提高(表 4)。说明5%的核心样本所取材料间的位点重复性小，但仍能保持原始样本极高的遗传多样性。
表 4 不同核心样本的遗传多样性比较1)Table 4. Comparisons of genetic diversities of different core samples
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图 2 广西普通野生稻10%核心样本的UPGMA聚类图Figure 2. UPGMA dendrograms of 10% core collections of common wild rice in Guangxi![]()
图 3 广西普通野生稻5%核心样本的UPGMA聚类图Figure 3. UPGMA dendrograms of 5% core collections of common wild rice in Guangxi从表 5可以得出：在10%的核心样本中，邕宁居群的核心样本比例是本居群分析样本的10.29%，与全体材料的总平均数一致，表明邕宁居群的核心样本数多的原因是该群供试样本数占总样本数的比例大；扶绥居群的核心样本比例是本居群分析样本的31.25%，远高于总平均数，表明扶绥居群的核心样本数多的原因是该群供试样本的遗传多样性特别丰富。5%的核心样本构成的变化趋势也一样。相比之下，博白居群、容县居群和五里塘居群占核心样本数均极低，表明其遗传多样性差。
表 5 各居群占核心样本的比例1)Table 5. Ratios of core samples from each original populations
3. 讨论与结论
3.1 广西普通野生稻的遗传多样性评价
本研究对郁江流域，红水河流域，南流江流域和桂北山区623份普通野生稻材料的遗传多样性分析结果(A=4.75、Ae=3.000 1、He=0.638 8)高于前人[5-9]对江西、湖南、福建、海南、云南等省区普通野生稻遗传多样性的估值，表明广西普通野生稻具有丰富的遗传多样性。本研究结果与任民等[14]对桂东南地区普通野生稻的研究和盖红梅等[13]对武宣濠江流域普通野生稻的遗传多样性研究的结果基本相符。但低于余萍等[11]和黄娟等[12]的研究结果，主要原因可以归纳为3点；一是由于所研究群体的规模、分布及材料代表性等的不同。余萍等[11]研究的材料是中国普通野生稻初级核心种质中的材料，因此遗传多样性相对较高。黄娟等[12]研究的材料主要来自玉林博白区和福棉区，北海银海区、合浦县和铁山港区，防城区，贺州钟山县，来宾上林、武宣及桂林雁山区等区域。均与本研究的取材地域不同。二是由于检测位点不同。不同检测位点对多样性的影响不同，在供试个体中分配的均匀性和多样性也不一样。余萍等[11]使用34对引物，黄娟等[12]使用36对引物但未平均分配在12条染色体上，因此遗传多样性相对较高。本研究使用平均分配于12条染色体的24对SSR引物，试验结果能更客观地反映广西普通野生稻的遗传多样性。三是取材时间不同。近年来，普通野生稻及其栖息地遭受严重破坏。据调查，广西野生稻分布点有31%已经完全毁灭，覆盖面积也急剧减少[21]，这也可能造成遗传多样性的降低。
3.2 广西普通野生稻遗传多样性中心的确定
广西是我国普通野生稻遗传多样性丰富的省区之一。2012年Huang等[18]比较了世界各国和我国各省的普通野生稻资源，认为广西是我国普通野生稻遗传多样性中心和栽培稻的起源中心。黄娟等[12]将广西普通野生稻分布分为桂北山区、百色区、红水河-浔江流域和南流江流域4大区域。但广西的普通野生稻多样性中心究竟在哪里没有跟踪报道。本研究对郁江流域、桂北山区、南流江流域和红水河流域的9个居群623份材料进行遗传多样性分析，9个居群遗传多样性指数大小为：邕宁居群(YN) > 临桂居群(LG) > 扶绥居群(FS) > 容县居群(RX) > 贵港居群(GG) > 平南居群(PN) > 古棚居群(GP) > 五里塘居群(WLT) > 博白居群(BB)。区域的多样性指数大小为：郁江流域(YJ) > 桂北山区(GB) > 南流江流域(NLJ) > 红水河流域(HSH)。表明普通野生稻遗传多样性异常丰富的郁江流域是广西普通野生稻的多样性中心。
3.3 广西普通野生稻核心种质构建与资源分布、保护和利用
邓国富等[21]和徐志健等[22]年对广西野生稻自然资源开展第2次全面调查发现，由于原生地消失、原生地环境恶化和外来物种的入侵，广西野生稻自然资源濒危现状严重，31%的原生态分布点已经完全毁灭，覆盖面积也急剧减少。因此，核心种质构建的工作需要进一步加强。本研究使用逐步聚类法构建了10%和5%的核心样本。其平均等位基因数(A)能保持原始样本的92%和89%以上。邕宁居群和扶绥居群是核心样本的主要组成来源。邕宁居群的核心样本数多的原因主要是由于收集资源量多和遗传多样性较丰富，而扶绥居群的收集资源量相对较少但遗传多样性异常丰富，也表明扶绥居群是普通野生稻遗传多样性的特殊地区。郁江流域作为广西普通野生稻遗传多样的新中心，其分布分散、范围广，这使野生稻的保存及保护困难更大，且目前的野生稻保护区域都未涉及到这些地方，应当引起重视。
本研究构建了较完整和较有代表性的普通野生稻遗传多样性核心种质，普通野生稻(AA基因组)是栽培稻的近缘祖先，在长期的逆境生长中具有优异的育种基因资源，对水稻基础研究和水稻育种有巨大的贡献。Zhang等[23]和章琦等[24]通过抗谱评价、抗性类型比较以及遣传分析，鉴定出一个来自普通野生稻的抗白叶枯病新基因 Xa-23 , 并将其进行了精细定位。Huang等[25]利用广西普通野生稻GX2183挖掘出抗褐飞虱基因 Bph27 。Wang等[26]利用广西普通野生稻转育后代RBPH54精细定位并克隆了抗褐飞虱基因Bph29 。广西的2个优质“三系”杂交水稻恢复系“桂99”和“测253”都是利用野生稻资源培育出来的[27-28]。利用广西普通野生稻培育基于优良栽培稻遗传背景的染色体片段代换系也获得丰富的特异类型[29-30]。由此可以肯定，广西普通野生稻核心种质的构建将进一步加速普通野生稻遗传多样性在水稻育种上的利用。
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图 2 吐温–80与曲拉通X–100的添加质量浓度对加利利链霉菌AF1抗菌活性的交互影响
Figure 2. The interactive effects of adding concentrations of Tween-80 and Triton X-100 on antibacterial bioactivity of Streptomyces galilaeus AF1
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图 3 吐温–80与山梨醇的添加质量浓度对加利利链霉菌AF1发酵液抗菌活性的交互影响
Figure 3. The interactive effects of adding concentrations of Tween-80 and sorbitol on antibacterial bioactivity of Streptomyces galilaeus AF1
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图 4 曲拉通X–100与山梨醇的添加质量浓度对加利利链霉菌AF1发酵液抗菌活性的交互影响
Figure 4. The interactive effects of adding concentrations of Triton X-100 and sorbitol on the antibacterial bioactivity of Streptomyces galilaeus AF1
表 1 表面活性剂的响应面中心组合试验
Table 1 Response surface design for surfactant addtion
ρ/(g·L–1) 水平 因素 吐温–80 曲拉通 X–100 山梨醇 –1 4 8 12 0 1 2 3 1 2 4 6 
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表 2 表面活性剂对加利利链霉菌AF1抗MRSA活性的影响1)
Table 2 Effect of surfactants on the MRSA bioactivity of Streptomyces galilaeus AF1
ρ/(g·L–1) 抑菌圈直径/mm 吐温–80 山梨醇 曲拉通 X–100 CaCl2 十六烷基三甲基溴化铵 十二烷基硫酸钠 二甲基亚砜 0(CK) 14.33±0.33e 14.33±0.33d 14.33±0.33e 14.33±0.33d 14.33±0.33bc 14.33±0.33d 14.33±0.33c 0.5 15.33±0.33e 16.33±0.33c 18.33±0.33c 14.33±0.33d 15.67±0.33a 16.00±0.58c 17.67±0.33b 2.0 19.33±0.33c 20.00±0.58b 23.33±0.33a 15.67±0.33cd 15.33±0.33ab 17.67±0.33b 20.33±0.33a 4.0 22.67±0.33b 22.67±0.33a 21.67±0.33b 17.00±0.33bc 15.67±0.33a 19.00±0.58a 19.33±0.33a 8.0 24.33±0.33a 17.33±0.33c 17.67±0.33c 17.33±0.67b 14.67±0.33ab 15.67±0.33cd 17.67±0.33b 10.0 18.00±0.58d 13.33±0.88d 16.00±0.58d 19.67±0.67a 13.33±0.33c 14.67±0.33cd 16.67±0.67b 1)同列数据后凡具有一个相同字母者，表示 0.05 水平差异不显著(Duncan’s 法)。
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表 3 表面活性剂初步最适添加浓度的差异显著性分析1)
Table 3 Significance test for differences among surfactants with primary optimal concentrations
表面活性剂 ρ/(g·L–1) 平均抑菌圈直径/mm 吐温–80 8.0 24.33±0.33a 曲拉通 X–100 2.0 23.33±0.33ab 山梨醇 4.0 22.67±0.33b 二甲基亚砜 2.0 20.33±0.33c CaCl2 10.0 19.67±0.67c 十二烷基硫酸钠 4.0 19.00±0.58c 十六烷基三甲基溴化铵 0.5 (4.0) 15.67±0.33d 空白对照 0 14.33±0.33e 1) 同列数据后凡具有一个相同字母者，表示 0.05 水平差异不显著(Duncan’s 法)。
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表 4 表面活性剂的响应面中心组合试验设计及结果
Table 4 The response surface design and results of surfactant addition
试验号 因素及水平 抑菌圈直径/
mm吐温–80 曲拉通 X–100 山梨醇 1 1 –1 0 23 2 0 1 1 23 3 –1 –1 0 23 4 0 –1 1 21 5 0 1 –1 23 6 0 0 0 28 7 0 0 0 28 8 1 0 1 23 9 1 0 –1 24 10 1 1 0 25 11 –1 0 –1 22 12 –1 1 0 20 13 0 –1 –1 22 14 0 0 0 29 15 –1 0 1 21 16 0 0 0 28 17 0 0 0 28
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表 5 响应面中心组合试验的方差分析1)
Table 5 Analysis of variance in the response surface of surfactant addition
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 133.42 9 14.82 34.02 <0.000 1*** X1 10.13 1 10.13 23.24 0.001 9** X2 0.50 1 0.50 1.15 0.319 6 X3 1.13 1 1.13 2.58 0.152 1 X1X2 6.25 1 6.25 14.34 0.006 8** X1X3 0.00 1 0.00 0.00 1.000 0 X2X3 0.25 1 0.25 0.57 0.473 5 X12 28.46 1 28.46 65.33 < 0.000 1*** X22 34.20 1 34.20 78.49 < 0.000 1*** X32 40.46 1 40.46 92.87 < 0.000 1*** 残差 3.05 7 0.44 失拟项 2.25 3 0.75 3.75 0.117 1 纯误差 0.80 4 0.20 总和 136.47 16 1) **和***分别表示差异高度显著、极显著 (P<0.01、P<0.001，t 检验)；R2=0.977 7，R2校正=0.948 9。
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表 6 细胞荧光强度的组统计量
Table 6 Group statistics of cell fluorescence intensity
分组 n 均值 标准差 标准误 空白对照(CK) 3 126.50 2.63 1.52 试验组 3 162.22 3.33 1.92
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表 7 细胞荧光强度的独立样本检验
Table 7 Independent sample test of cell fluorescence intensity
条件 方差方程的 Levene 检验 均值方程的 t 检验 F P t 自由度 P (双侧) 均值差值 标准误差值 差分的 95% 置信区间 假设方差相等 0.25 0.64 –14.59 4.00 0.00 –35.72 2.45 –42.52 ~ –28.92 假设方差不相等 –14.59 3.79 0.00 –35.72 2.45 –42.67 ~ –28.77
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