Nutrient element contents of root bleeding sap of soybeans at late growth stages
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摘要:目的
研究不同产量水平的大豆Glycine max (L.) Merr.品种生育后期根系伤流液中氮素等养分元素含量的变化规律，以期为大豆育种和高产栽培提供生理依据。
方法以3种不同产量水平(低、中、高产)的大豆品种为试验材料，栽培管理条件相同，测定开花期(R2期)、结荚期(R4期)和鼓粒期(R6期)大豆根系伤流强度及伤流液中氮素(总氮、硝态氮、铵态氮和氨基酸)以及磷、钾、钙和钠等养分含量。
结果整个生育后期高产大豆品种根系伤流强度、总氮、氨基酸含量明显高于中、低产品种，平均值分别高13.4%和24.0%、31.9%和74.2%、46.3%和81.0%。根系伤流液中硝态氮含量高于低产品种，平均值高19.9%；铵态氮含量低于低产品种，平均值低16.5%；根系养分元素磷、钾、钙含量均高于中、低产品种。不同产量水平的大豆品种伤流强度的最高值均出现在R4期，R4期籽粒产量与伤流强度呈极显著正相关(r=0.765**)；根系伤流液中总氮和氨基酸含量在R2期达最高值，磷、钾在R4期含量最高。
结论在开花期以后，高产大豆品种根系代谢旺盛，具有较强的吸收能力和活力，这可能是大豆高产的关键因素。
Abstract:ObjectiveTo explore changes of nitrogen and nutrient element contents of root bleeding saps of soybeans [Glycine max (L.) Merr.] with different yield levels at late growth stages, and provide a physiological basis for soybean breeding and high-yielding cultivation.
MethodSoybean cultivars with three different yield levels (low-, middle- and high-yielding) were planted under the same cultivation condition. Root bleeding intensity, the contents of nitrogen compounds (total nitrogen, nitrate nitrogen, ammonium nitrogen and amino acids) and other nutrient elements (P, K, Ca and Na) in root bleeding saps of soybeans were measured at flowering (R2), podding (R4) and seed-filling (R6) stages respectively.
ResultRoot bleeding intensities, total nitrogen and amino acid contents of high-yielding cultivars were 13.4% and 24.0%, 31.9% and 74.2%, 46.3% and 81.0% higher than those of middle- and low-yielding cultivars at late growth stages. Nitrate nitrogen content of high-yielding cultivar was 19.9% higher than that of low-yielding cultivar, while ammonium nitrogen content of high-yielding cultivar was 16.5% lower than that of low-yielding cultivar. The P, K and Ca contents of high-yielding cultivar were higher than those of low- and middle-yielding cultivars. The bleeding intensities of soybeans with different yield levels reached the maxinum values at R4 stage, and the grain yield was significantly positively correlated with bleeding intensity at R4 stage (r = 0.765**). The contents of total nitrogen and amino acid in root bleeding saps reached the maximum values at R2 stage while the contents of P and K were the highest at R4 stage.
ConclusionRoot metabolism of high-yielding cultivar was vigorous and had stronger absorption capacity and vitality, which might be the key factors to increase soybean yield.
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Keywords:
- soybean /
- late growth stage /
- bleeding sap /
- nitrogen /
- nutrient element
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邻苯二酸酯类化合物(PAEs)又称钛酸酯，是大约30种化合物的总称，主要用作塑料的增塑剂，以增大塑料的可塑性和强度[1]。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是塑化剂的一种，工业上主要用于硝基漆和聚氯乙烯(PVC)塑料的生产，以增强产品的柔韧性。此外，DBP还用于生产防泡剂、乳胶黏合剂和纺织助剂等[2]。塑化剂的大量生产和频繁应用，导致在人们的日常生活中塑化剂污染严重。据报道，中国南京市区的大气塑化剂污染中，DBP占到了58.7%[3]。DBP是一种具有生殖毒性和遗传毒性的环境雌激素，具有雌激素的作用，致突变，对胎儿有毒性，对肌肉、骨骼、中枢神经系统有影响，能通过消化系统、呼吸系统和皮肤进入人体[4]，对人体产生不同程度的危害作用。有研究发现，DBP的代谢产物MBP对大鼠具有胚胎毒性作用，导致胚胎生长缓慢，同时对胚胎有致畸作用[5]。
早在1975年，DBP就被世界野生动物基金会列为具有内分泌紊乱作用的物质之一[6]。DBP还被欧盟2005/84/EC指令限制使用于儿童玩具和用品中，在塑料中的含量不得超过0.1%。美国、加拿大、日本、韩国等多个国家也相继发布了与欧盟类似的法律和标准[7]，我国也将其列为优先控制污染物黑名单[8]。近年来爆发的”台湾塑化剂事件“和“白酒塑化剂事件”，让人们重新认识了作为包装材料添加剂的“塑化剂”，由此引发了对食品包装材料安全性能的高度关注[9]。目前对塑化剂的检测方法主要为气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)等，但这些方法费时，仪器昂贵，需专业人士操作，样品前处理复杂，不能同时大量分析[10]。本研究采用的免疫分析技术具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点[11]。
小分子物质邻苯二甲酸二丁酯只有反应原性，没有免疫原性，不能刺激动物发生免疫反应。为了获得具有免疫原性的完全抗原，必须将其与大分子载体进行偶联[12]。本研究利用戊二酸酐合成了连接有5个碳臂长的半抗原衍生物4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)，再通过活性酯法将DBCP与载体蛋白——牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联获得人工抗原，最后利用间接酶联免疫法(icELISA)检测抗体。该抗原的合成为免疫分析技术的建立奠定了基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
4-硝基邻苯二甲酸(质量分数≥99%)、钯碳：百灵威化学试剂有限公司；高纯氢气：广州市君多气体有限公司；二环乙基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清蛋白(BSA，质量分数为98.6%)、卵清蛋白(OVA，质量分数为98%)、弗氏完全佐剂与不完全佐剂：美国Sigma公司；SPF级雌性新西兰大白兔：广东省动物中心；羊抗兔IgG-HRP二抗：武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。TU-1901紫外-可见分光光度仪：北京谱析通用仪器有限责任公司；RT-2100C型酶标仪：雷杜生命科学股份有限公司；96孔酶标板：厦门云鹏科技有限公司。
1.2 人工抗原的合成与鉴定
1.2.1 4-硝基邻苯二甲酸二丁酯(DBNP)的合成
按照文献[13]中的方法，称取20 g(0.095 mol)4-硝基邻苯二甲酸，加入26 mL正丁醇，搅拌下加入3.3 mL浓H2SO4催化，120 ℃搅拌回流7 h后，蒸馏除去未反应的丁醇和生成的水。趁热导入冰水中，油状粗品用质量分数为10%Na2CO3洗涤至水层无色(pH7~8)后，分离出油状物，用无水乙醇溶解除去不溶物，加热后除去少量乙醇，趁热置冰箱中冷却，得到黄色油状液体28.5 g，产率93%。
1.2.2 4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)的合成
取2 g(6.19 mmol)4-硝基邻苯二甲酸二丁酯和0.4 g钯碳溶于15 mL甲醇，缓慢通入H2，50 ℃条件下回流搅拌反应5 h，反应结束后过滤，上清液旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯溶解后再过滤，旋转蒸发浓缩后得淡黄色固体1.78 g，产率98%。产物经硅胶柱层析提纯，通过氢核磁共振(1H NMR)和质谱(MS)鉴定。
1.2.3 4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)的合成
将0.29 g(1 mmol)DBAP和0.22 g(2 mmol)戊二酸酐溶解在20 mL四氢呋喃(THF)中，60 ℃条件下回流搅拌反应8 h，再转移至室温搅拌反应12 h，蒸馏除去THF。残余物溶于10 mL乙酸乙酯中，并用10 mL双蒸水洗涤，分离出乙酸乙酯层，转旋蒸发除去乙酸乙酯，得到黄色油状液体0.31 g，产率75%。
1.2.4 人工抗原的合成
将40.7 mg(0.1 mmol)DBCP，17 mg(0.15 mmol)NHS完全溶于1 mL的二甲基甲酰胺(DMF)后，加入31 mg(0.15 mmol)DCC，4 ℃条件下反应12 h，离心分离出上清液。取900 μL得到的上清液，滴加到8 mL溶有113 mg BSA的磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)中，4 ℃条件下反应12 h。10 000 g·min-1条件下离心10 min。将上清液装入透析袋，用PBS透析3 d，每12 h换液1次，得到棕黄色的邻苯二甲酸全抗原溶液。
1.2.5 人工抗原的鉴定
为鉴定半抗原与载体蛋白是否偶联成功，分别将半抗原、载体蛋白和偶联物稀释至一定浓度进行SDS-PAGE鉴定，并在200~400 nm波长间进行紫外吸收光谱测定，以紫外分光光度法估算偶联物的结合比[14]。
1.3 免疫动物及抗血清检测
以DBCP-BSA作免疫原，用PBS溶液(pH 7.4)稀释至1 mg·mL-1，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，对2只成年健康雌性新西兰大白兔采用背部多点注射和肌肉注射。3周后再次免疫改用等量的弗氏不完全佐剂进行乳化，以后每隔2周免疫1次，免疫后7~8 d耳缘静脉取血[15]。
以DBCP-OVA作包被原，将抗血清用PBS溶液倍比稀释，采用间接ELISA法检测抗体效价，并用间接竞争ELISA法[16]检测抗体的特异性。以标准品DBP浓度的自然对数值为横坐标，D/D0(D、D0分别为加兔抗血清和阴性血清对应的光密度)为纵坐标，建立竞争抑制曲线。
1.4 抗体特异性分析
采用icELISA法分别检测邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸单苄酯(MBzP)、4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)与抗体的交叉反应，并计算各竞争物的半抑制率(IC50)，比较抗体对它们的亲和性。根据以下公式计算各竞争物与DBP抗体的交叉反应率[17]。
2. 结果与分析
2.1 半抗原衍生物合成结果分析
对半抗原衍生物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)和4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)进行了质谱(MS)与氢核磁共振(1H NMR)扫描，结果(图 1和图 2)表明合成成功。
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图 1 半抗原衍生物DBAP的1H NMR(a)和MS(b)图谱Figure 1. 1H NMR (a)and MS(b) spectrums of hapten derivative DBAP![]()
图 2 半抗原衍生物DBCP的1H NMR(a)和MS(b)图谱Figure 2. 1H NMR(a) and MS(b) spectrums of hapten derivative DBCP由图 1a分析可知，DBAP的1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7.71 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.76~6.65 (m, 2H), 4.27 (dt, J = 17.6, 6.7 Hz, 4H), 1.78 ~1.61 (m, 4H), 1.52~1.37 (m, 4H), 0.96 (t, J = 7.3 Hz, 6H)，其MS图(图 1b)中293.9是M+H+，315.9是M+Na+，331.9是M+K+，348.1是M+Na++CH3OH，609.1是2M+Na+。由此可知，该化合物的相对分子质量为293，与计算结果吻合。
由图 2a分析可知DBCP的1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 9.02 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.69 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.24 (td, J = 6.7, 3.2 Hz, 4H), 2.46 ~2.21 (m, 4H), 2.01 ~ 1.83 (m, 2H), 1.74~ 1.56 (m, 4H), 1.39 (dp, J = 14.4, 7.3 Hz, 4H), 0.92 (q, J = 7.3 Hz, 6H)，其MS图(图 2b)中，406.2是M-H+。由此可知，该化合物的相对分子质量为407.2，与计算结果吻合。
2.2 抗原的鉴定
2.2.1 紫外可见光吸收光谱鉴定
经紫外可见光分光光度计测定，得到载体蛋白、半抗原衍生物以及人工抗原的紫外扫描图(图 3)。从图 3中可以看出，DBCP在波长204、223和269 nm处出现特征吸收峰，载体蛋白BSA在波长202和280 nm处出现特征吸收峰，OVA在205和280 nm处出现特征吸收峰，而DBCP-BSA则在205和272 nm处有显著吸收峰，DBCP-OVA在203和269 nm处有显著吸收峰。由于DBCP的羧基与载体蛋白的氨基发生偶联，所以紫外光谱中特征峰发生改变，但同时具备半抗原和载体蛋白的吸收特征，间接说明半抗原和载体蛋白偶联成功[18]。根据紫外分光光度法估算DBCP-BSA和DBCP-OVA的结合比分别为11:1和17:1。
2.2.2 SDS-PAGE鉴定
人工抗原及蛋白的SDS-PAGE结果见图 4。由图 4可知，人工抗原的迁移速率均比载体蛋白的迁移速率小，表明偶联产物的相对分子质量均比载体蛋白的相对分子质量大。其中，DBCP-OVA和OVA在电泳图中的区分效果较好，可能是OVA的相对分子质量较小、结合上的DBCP较多的缘故(结合比17:1)。电泳图表明半抗原衍生物与载体蛋白偶联成功。
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图 4 BSA和DBCP-BSA以及OVA和DBCP-OVA的SDS-PAGE电泳图M1:重组蛋白Marker 1; 1：BSA；2:DBCP-BSA; M2:重组蛋白Marker 2; 3：OVA; 4:DBCP-OVA。Figure 4. SDS-PAGE gel of BSA, DBCP-BSA, OVA and DBCP-OVA2.3 抗血清检测
对兔子进行5次免疫后耳部静脉采血，经离心得到抗血清，利用间接ELISA法检测抗体效价，结果见表 1。从表 1可知，兔1和兔2抗血清效价均达到1:128 000。包被抗原DBCP-OVA经方阵滴定法确定最佳包被质量浓度为2 000 ng·mL-1。以抗血清最高效价稀释倍数，利用icELISA法测定其半抑制率(IC50)，竞争抑制曲线如图 5，可知兔1和兔2的IC50分别为301和308 ng·mL-1。
表 1 抗血清效价测定结果Table 1. Detection result of serum titer
2.4 抗体特异性分析
采用icELISA法对邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸单苄酯等邻苯二甲酸结构类似物进行特异性检测，结果如表 2所示。从表 2中可以看出，除DBP和DBAP外，其他结构类似物的交叉反应率均小于4.3%。因此，表明DBCP-BSA免疫新西兰大白兔所获抗体建立的icELISA方法特异性良好。
表 2 多克隆抗体与DBCP结构类似物的交叉反应Table 2. Cross-reactivity of the polyclonal antibody against DBCP related compounds
3. 讨论与结论
半抗原的设计、半抗原的修饰和人工抗原的合成是制备抗小分子化合物抗体、建立相应的免疫分析方法的重要过程。之前的研究中，邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的研究多以4-氨基邻苯二甲酸二丁酯为半抗原通过重氮化法与载体蛋白偶联制备[3, 11, 13], 这种方法在半抗原制备过程中通常使用苯等有毒有机溶剂，不利于试验操作人员的健康。其次，重氮化法的操作有一定的危险性，且步骤比较繁琐。Wei等[2]在其研究中曾经制备带4个碳链的邻苯二甲酸二丁酯人工抗原，但在其研究中主要将这种抗原作为包被原来使用，并未深入探究这种抗原的免疫活性。
本研究在DBAP的4位氨基上利用戊二酸酐在半抗原与载体之间连接了1条含5个碳的手臂链，充分暴露出了半抗原分子的特征结构，而且连接了5个碳手臂链，更有利于人工抗原表面突显半抗原的结构特征，以利于产生具有高特异性的抗体[19]。利用H2还原、钯碳作催化剂，大大缩短了反应时间，避免了使用有毒试剂苯，试验操作更安全更简便，也提高了反应产率。使用戊二酸酐反应与戊二醛法反应相比较，产物更稳定，副产物少，专一性更强，产率更高。因此，该抗原的合成为下一步建立免疫分析技术奠定了基础。
本试验使用戊二酸酐反应合成了半抗原衍生物，经质谱、氢核磁共振谱图鉴定，衍生物合成成功。采用活性酯法将半抗原衍生物与载体蛋白进行偶联，合成人工抗原，经紫外光谱、SDS-PAGE鉴定，偶联成功。所得抗体经icELISA法检测知其具有较高灵敏度和较好特异性，可用于邻苯二甲酸二丁酯含量的测定。
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图 1 不同产量水平大豆品种根伤流强度的比较
相同生育期、不同柱子上凡是有一个相同小、大写字母者，分别表示在0.05、0.01水平差异不显著(Duncan’s法)。
Figure 1. Comparison of root bleeding intensities of soybeans with different yield levels
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图 2 不同产量水平大豆品种根系伤流液中总氮含量的比较
相同生育期、不同柱子上凡是有一个相同小、大写字母者，分别表示在0.05、0.01水平差异不显著(Duncan’s法)。
Figure 2. Comparison of total nitrogen contents in root bleeding sap of soybeans with different yield levels
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图 3 不同产量水平大豆品种根系伤流液中NO3––N含量的比较
相同生育期、不同柱子上凡是有一个相同小写字母者，表示在0.05水平差异不显著(Duncan’s法)。
Figure 3. Comparison of nitrate nitrogen content in root bleeding sap of soybeans with different yield levels
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图 4 不同产量水平大豆品种根系伤流液中NH4+–N含量的比较
相同生育期、不同柱子上凡是有一个相同小、大写字母者，分别表示在0.05、0.01水平差异不显著(Duncan’s法)。
Figure 4. Comparison of ammonium nitrogen contents in root bleeding sap of soybeans with different yield levels
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图 5 不同产量水平大豆品种根系伤流液中AA含量的比较
相同生育期、不同柱子上凡是有一个相同小、大写字母者，分别表示在0.05、0.01水平差异不显著(Duncan’s法)。
Figure 5. Comparison of amino acid contents in root bleeding sap of soybeans with different yield levels
表 1 不同产量水平的大豆品种
Table 1 The soybean cultivars with different yield levels
产量水平 品种 产量/(kg·hm–2) 高产 长农16号 3 370 吉农19号 3 251 吉育95号 3 013 中产 吉林35号 2 445 吉林36号 2 409 吉林38号 2 535 低产 吉林5号 1 714 吉林8号 1 840 吉林16号 2 008 
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表 2 不同产量水平大豆品种根系伤流液中养分元素含量的比较1)
Table 2 Comparison of nutrient element contents in root bleeding sap of soybeans with different yield levels
养分元素 生育期 w/ (mg·g–1) 高产品种 中产品种 低产品种 P R2 66.7±3.98a 54.5±2.46a 49.5±4.73a R4 121.1±10.90a 108.6±7.61b 101.5±8.61b R6 94.7±6.84a 83.6±7.97b 79.3±4.12c K R2 170.1±11.91a 163.2±5.19a 157.8±11.16a R4 363.1±19.98a 325.8±16.29b 322.4±22.6b R6 292.9±11.72a 265.8±21.3b 247.2±17.5c Ca R2 59.1±6.51a 58.5±5.27a 54.6±4.94b R4 72.3±7.95a 70.5±5.53b 63.3±5.26c R6 56.3±3.38a 49.5±3.96b 52.6±5.13c Na R2 15.4±1.39a 17.1±0.65b 19.9±8.45c R4 29.1±1.74a 38.4±4.11b 31.7±1.15c R6 66.7±3.98a 33.1±1.51b 32.2±2.42b 1) 同行数据后凡是有一个相同小写字母者，表示差异不显著 (P>0.05，Duncan’s 法)。
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