番茄Solanum lycopersicum因含有丰富的营养物质而成为我国重要的蔬菜作物，也是研究果实发育、成熟的重要模式植物^[1-2]。番茄种植过程中易受病原菌侵害，造成减产，细菌性斑点病、细菌性溃疡病、细菌性枯萎病等细菌性病害是造成番茄减产的重要原因^[3]。丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst DC3000)是番茄细菌性斑点病的致病变种之一，也是研究植物−病原菌互作的模式菌株^[4]。Pst DC3000吸附到番茄叶片表面，从气孔或伤口侵入，引起局部坏死、周围弥漫性黄化，危害番茄叶片、果实、花、茎秆等，给番茄产业造成严重的损失。

茉莉酸(Jasmonic acid，JA)是一类广泛存在于植物中的内源激素，1971年在一种真菌培养过滤液中获得^[5]。研究发现，外源JA具有促进植物衰老和调控生长的作用，且昆虫啃咬和真菌侵染均可以促进JA和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)的积累^[5-6]。植物在逆境条件下，积累不同形式的JA，最终生成活性的茉莉酸−异亮氨酸(Jasmonic acid-isoleucine，JA-Ile)，JA-Ile诱导JA受体F-box CORONATINE INSENSITIVE1(COI1)与Jasmonate ZIM-domain(JAZ)蛋白形成共受体复合体，促使JAZ蛋白被泛素化降解，激活转录因子下游抗病反应基因的表达^[7-8]。例如SlJAZ25基因在番茄对灰叶斑病的抗性反应中起负调控作用^[9]。通过病毒沉默番茄JAZ3基因发现番茄对叶霉病的抵抗能力降低，同时，植株内源JA含量降低，水杨酸(Salicylic acid，SA)含量升高^[10]。AtJAZ7基因的突变增加了拟南芥对尖孢镰刀菌和Pst DC3000的感病性^[11]。SlJAZ2、SlJAZ6、SlJAZ7瞬时沉默植株对Pst DC3000的敏感性增加^[12]。Pst DC3000的致病因子冠菌素与JA-Ile在结构上存在很大的相似性，冠菌素通过模仿JA-Ile，激活JA信号传导，抑制SA介导的防御信号^[12]。拟南芥ANAC032转录因子与MYC2、NIMIN1和PDF1.2启动子结合，激活SA介导的防御反应但抑制JA反应基因的表达，提高对Pst DC3000的抗性^[13]，说明JA和SA之间拮抗或协同的关系可帮助植物抵御外界不良环境^[14]。

植物TGA转录因子(TGACG-binding transcription factor)是SA抗病途径的重要调节因子，也是JA/乙烯抗病信号途径中的重要组成部分，发挥重要作用^[15-16]。拟南芥TGA转录因子家族共有10个基因，分为5组，每组都具有不同的功能。TGA与病程相关(Pathogenesis related，PR)蛋白基因启动子上TGACG(as-1)元件结合调节下游病程相关基因的转录水平，从而提高植物的抗病性^[17-19]。研究表明TGA转录因子I、II、III组与SA受体NON-EXPRESSOR of PR-1(NPR1)均存在不同强度的互作^[17-19]。在JA/ETH诱导下tga2/5/6 3份突变体中PDF1.2和b-CHI表达被抑制，使得番茄对坏死性番茄灰霉病更易感^[20]。从大豆基因组中鉴定出的GmTGA8和GmTGA19明显抑制大豆花叶病毒的增殖，对大豆花叶病具有明显基础抗性^[21]。在猕猴桃中瞬时过表达AcTGA01、AcTGA06、AcTGA07、AcTGA09有利于增强猕猴桃对细菌性溃疡病的抗病性，其中瞬时过表达AcTGA7的猕猴桃叶片中细菌积累量最少^[22]。JAZ和TGA转录因子分别是JA和SA途径的重要调控因子，JAZ3基因瞬时沉默可以同时影响JA和SA的含量，推测JAZ和TGA间可能有一定关联^[10]。

番茄13个JAZ家族成员中，SlJAZ1~12基因均受到Pst DC3000的诱导，其中SlJAZ7在Pst DC3000病原菌诱导3 h的表达量显著上调，瞬时沉默SlJAZ7基因后植株感病性增加^[12]，然而其中的分子机制尚未阐明。为进一步探索SlJAZ7在番茄抗病性中的调控机制，本研究首先通过转基因技术获得过表达SlJAZ7基因的转基因番茄，接种Pst DC3000验证其抗病功能，通过RT-qPCR明确SlJAZ7响应Pst DC3000、JA及SA处理，通过Y2H等试验探索SlJAZ7与SlTGA7的关系，这将为进一步研究SlJAZ7基因的作用机理和防治番茄细菌性斑点病提供理论基础。

1.   材料与方法

1.1   材料种植与试剂

野生小果型番茄‘Micro-Tom’(MT)和本氏烟草由海南大学海南省热带生物资源可持续利用重点实验室、热带作物生物育种国家重点实验室(本实验室)保存，种植于26 ℃温室中，培养条件为16 h光照/8 h黑暗。

2× Taq PCR试剂(目录号：KT201-02)、多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(目录号：DP441)购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒(目录号：D2639A)和SYBR Premix Ex Taq Kit(目录号：DRR081A)、Clontech酵母双杂交试剂盒(目录号：630489)及酵母培养基购自宝生物有限公司；PCR产物回收纯化试剂盒(目录号：DR02)、质粒提取试剂盒(目录号：PL03)购自艾德莱生物有限公司；大肠埃希菌感受态DH5α、农杆菌感受态LBA4404和酵母Y2H Gold感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；植物表达载体pGAMBIA1300-eGFP由本实验室改造保存。

1.2   SlJAZ7基因克隆

在Phytozome 13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)数据库中选择番茄数据库S. lycopersicum ITAG4.0，根据基因序列号Solyc11g011030搜索得到SlJAZ7的基因序列，设计全长引物(表1)，利用PCR扩增得到SlJAZ7全长片段。

表  1  本研究所用引物

Table  1.  Primers used in this study

引物名称 Primer name	引物序列1) (5′→3′) Primer sequence	目的 Purpose
SlJAZ7-NC-F	agtggtctctgtccagtcctATGGATTCAAGAATGGAGATAGATT	基因克隆
SlJAZ7-NC-R	ggtctcagcagaccacaagtGTTTTCCCAATGAACGCTTGAC	基因克隆
SlJAZ7-EcoRI-F	ccggaattcATGGATTCAAGAATGGAGATAGATT	互作关系验证
SlJAZ7-BamHI-R	cgggatccGTTTTCCCAATGAACGCTTGAC	互作关系验证
SlTGA7-EcoRI-F	ccggaattcATGAACATGAGTTCTACATCAACTC	互作关系验证
SlTGA7-BamHI-R	cgggatccGGTAGGTTCACGAGGACGAG	互作关系验证
SlJAZ7-SalI-F	acgcgtcgacATGGATTCAAGAATGGAGATAGATT	BiFC试验
SlTGA7-SalI-F	acgcgtcgacATGAACATGAGTTCTACATCAACTC	BiFC试验
SlJAZ7-Q-F	ATTATGCTAAAGGAGCACTTGCTAT	RT-qPCR
SlJAZ7-Q-R	CGCTTGACGACGCCG	RT-qPCR
Sltublin-Q-F	TTGGTTTTGCACCACTGACTTC	RT-qPCR
Sltublin-Q-R	AAGCTCTGGCACTCTCAAAGC	RT-qPCR
1)带下划线的碱基代表酶切位点序列 　1) The underlined bases represent the sequences of enzyme cleavage site

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1.3   SlJAZ7过表达番茄植株创制及鉴定

将MT番茄种子消毒后培养7~10 d长出2片完整子叶，切下子叶，放入D_{600 nm}=0.35~0.40的农杆菌悬浮液中侵染15 min，然后于20~22 ℃下避光共培养2 d。将外植体转移到筛选培养基诱导愈伤，一定时间后转入再生培养基中，待长出4~5 cm不定芽，转入生根培养基中。将再生苗移栽至装有基质的营养钵中培养成苗。

为鉴定SlJAZ7的转基因阳性植株，采集野生型植株(WT)及转基因植株(OE)的叶片，利用RT-qPCR，以SlTublin (Solyc10g086760)为内参基因，参考宝生物公司SYBR Premix Ex Taq II Kit说明书操作完成RT-qPCR反应，检测SlJAZ7在转基因植株的表达量。

1.4   Pst DC3000处理对照和转基因番茄

Pst DC3000菌液于KB平板(25 µg/mL利福平)上划线纯化，挑取单菌落，使用10 mmol/L氯化镁溶液稀释，使悬浮液D_{600 nm}为0.2，加入0.025%(φ)的表面活性剂，均匀喷洒至野生型植株(WT)叶片和过表达SlJAZ7植株(SlJAZ7-OE)叶片正反面，23 ℃暗培养1 d后转入26 ℃培养房中正常培养3 d，拍照保存。

1.5   DAB染色

使用纯水溶解DAB粉末，配置终质量浓度为1 mg/mL的DAB染色液，将叶片浸泡至染色液中，于锡箔纸中避光染色4 h。按照无水乙醇、甘油、冰醋酸的体积比为3∶1∶1的比例配制成脱色液。将染色后的叶片放入脱色液中煮沸15 min，至叶片底色变白，弃脱色液，超纯水清洗多次，拍照保存。

1.6   番茄样本处理与采集

为了研究SlJAZ7和SlTGA7基因的组织表达模式，采集种植45 d MT番茄的根、茎、叶、花和不同时期果实的样品，液氮保存，备用。为了研究SlJAZ7和SlTGA7基因对不同胁迫的响应模式，生长期45 d左右、生长势一致的MT幼苗被用于胁迫处理试验，将2 mmol/L SA、100 µmol/L MeJA、D_{600 nm}为0.2的Pst DC3000菌液喷施在叶片背面，于0、0.25、0.5、1、2、4、6、24 h采集植株叶片。提取RNA并反转录获得cDNA作为模板，以SlTublin (Solyc10g086760)为内参基因，参考宝生物公司SYBR Premix Ex Taq II Kit说明书操作完成RT-qPCR反应，仪器为Step-One Plus (ABI，USA)，利用2^−ΔΔCt计算相对表达量，使用GraphPad Prism 8.0.1软件绘图。

1.7   亚细胞定位分析

将去掉终止密码子的SlJAZ7和SlTGA7基因的CDS序列重组至pGAMBIA1300:eGFP载体中，构建35S:SlJAZ7:eGFP:pGAMBIA1300、35S:SlTGA7:eGFP:pGAMBIA1300植物表达载体。以pGAMBIA1300:eGFP为对照，将测序正确的质粒转化农杆菌感受态细胞LBA4404，挑取单菌落活化至D_{600 nm}为0.4，浓缩至D_{600 nm}在0.8左右，加入终浓度200 µmol/L的乙酰丁香酮，混匀后室温避光静置3 h，注射烟草叶片下表皮细胞，48 h后观察绿色荧光蛋白的亚细胞定位。

1.8   Y2H验证SlJAZ7和SlTGA7蛋白互作关系

将SlTGA7-pGBKT7质粒与SlJAZ7-pGADT7质粒共转至酵母感受态Y2H Gold中，涂布酵母培养基DDO(SD/-Trp-Leu)上，挑取单菌落，用pGADT7和pGBKT7的通用引物进行PCR鉴定，得到阳性菌株后，用9 g/L氯化钠溶液重悬并调整菌液D_{600 nm}为0.002，9 g/L氯化钠溶液稀释不同的浓度梯度，点至DDO/X/A(SD/-Trp-Leu/X-α-Gal/AbA)、QDO/X/A(SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal/AbA)平板上培养3~5 d，观察菌斑是否变蓝，以验证两者是否存在互作。

1.9   BiFC验证互作关系

通过Sal I和BamH I内切酶将已去掉终止密码子的SlJAZ7和SlTGA7基因CDS片段分别重组得到SlJAZ7:nYFP、SlTGA7:cYFP载体，转化至农杆菌感受态GV3101(pSoup-p19)，菌液经PCR鉴定正确后，将两者与核定位标记基因的农杆菌按照1∶1∶1的体积比混合均匀注射至烟草叶背面。3 d后在共聚焦显微镜下观察荧光。

1.10   pull down试验验证蛋白互作关系

将番茄SlJAZ7基因重组至pet28(a)-sumo-flag、SlTGA7重组至pet28(a)-sumo-strep构建原核表达载体(原核表达载体由本实验室改造保存)，经测序正确后，转入大肠埃希菌感受态Rosetta (DE3)中大量表达蛋白，使用IPTG诱导提取细菌蛋白，BCA法测定蛋白浓度^[23]，经Western blot和考马斯亮蓝染色后检测蛋白质表达量。Input组A、B设置为等比例混合的SlJAZ7: pet28(a)-sumo-flag和SlTGA7: pet28(a)-sumo-strep、SlJAZ7: pet28(a)-sumo-flag和pet28(a)-sumo-strep空载蛋白，IP组设置为使用带有flag抗体的磁珠下拉处理过的上述蛋白，经SDS-PAGE验证后分别使用flag和strep抗体孵育，检测flag和strep标签的存在。

1.11   数据统计方法

定量数据均设计3次技术重复，数据以平均值±标准误表示，使用Excel表格对数据进行整理分析，使用公式2^−ΔΔCt计算相对表达量，以t检验作为差异显著性分析方法，使用GraphPad Prism 8.0.1软件绘图。

2.   结果与分析

2.1   过表达SlJAZ7番茄的鉴定及表型分析

本研究利用农杆菌介导的番茄遗传转化体系，创制稳定遗传的转基因番茄植株，并通过RT-qPCR鉴定获得6株阳性株系。所有过表达株系SlJAZ7-OE中，SlJAZ7的表达量均显著高于野生型(WT)，其中SlJAZ7基因在OE5株系表达量最高(图1)。为研究SlJAZ7基因在防御番茄细菌性斑点病中的功能，对WT和SlJAZ7-OE接种Pst DC3000，结果显示，接种4 d后，WT和SlJAZ7-OE叶片均产生黄色病斑，但是，WT病斑的面积更大(图2A)。

图  1  转基因阳性植株SlJAZ7相对表达量

WT：野生型；OE1、5、6、7、12、14：过表达株系；“*”“**”分别表示过表达株系与野生型在P < 0.05和P < 0.01水平差异显著(t检验)

Figure  1.  Relative expression level of SlJAZ7 in transgenic positive plants

WT: Wild type; OE1, 5, 6, 7, 12, 14: Overexpressed lines; “*” and “**” indicate signidicant differences between overexpressed lines and wild type at P < 0.05 and P < 0.01 levels (t test)

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由于Pst DC3000侵染会引起活性氧的积累，导致植物细胞膜系统损伤。本研究使用DAB染色检测接种4 d后番茄叶片中活性氧的积累。结果发现，DAB染色后WT叶片的黄褐色沉淀比SlJAZ7-OE多而深，说明WT较SlJAZ7-OE积累了更多的活性氧(图2B)。以上结果表明过表达SlJAZ7基因减少了Pst DC3000接种后番茄的活性氧积累，减轻了转基因番茄的病症。

图  2  Pst DC3000病原菌侵染野生型(WT)和过表达株系(OE)后的表型(A)及DAB染色结果(B)

Figure  2.  Phenotype (A) and DAB staining results (B) after Pst DC3000 pathogens infection on wild type (WT) and overexpressed line (OE)

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2.2   番茄SlTGA7和SlJAZ7基因表达模式的比较

为了探究TGA家族与JAZ家族基因间的关系，前期通过RT-qPCR研究了番茄TGA转录因子家族13个成员对Pst DC3000、SA和JA处理的响应模式，结果显示SlTGA7 (Solyc12g056860)对Pst DC3000、SA和MeJA都有响应。在Pst DC3000和MeJA处理下，SlTGA7表达被显著抑制，而在SA处理下，SlTGA7表达显著上调，在6 h时表达量达到最高(图3A~3C)。与SlTGA基因的表达模式不同，在Pst DC3000处理0~24 h内，SlJAZ7基因的表达量显著上调。在MeJA处理过程中SlJAZ7基因表达量除6 h显著下调外，其余时间点均显著上调。在SA处理0.5、4 h时，SlJAZ7基因表达量显著上调，2、6~24 h时，SlJAZ7表达量显著下调(图3D~3F)。

图  3  Pst DC3000、MeJA和SA处理下SlTGA7 (A、B、C)和SlJAZ7 (D、E、F)的表达模式

“*”“**”分别表示其他时间点与0 h在P < 0.05和P < 0.01水平差异显著(t检验)

Figure  3.  Expression patterns of SlTGA7 (A, B, C) and SlJAZ7 (D, E, F) under Pst DC3000, MeJA and SA treatments

“*” and “**” indicate significant differences between other time points and 0 h at P < 0.05 and P < 0.01 respectively (t test)

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两者的组织特异性表达分析结果显示，SlTGA7基因在成熟红果中的表达量最高，在根、茎和老叶等营养器官中也高表达(图4A)；说明SlTGA7可能参与番茄生殖和营养生长。SlJAZ7在茎中的表达量最高，在老叶、幼叶、根中次之，在果和花中表达量最低，在营养器官中总体表达水平要高于生殖器官(图4B)，这表明SlJAZ7可能主要在营养器官中发挥功能。利用RT-qPCR检测SlTGA7基因在SlJAZ7过表达株系中的表达量，结果发现SlJAZ7过表达后，SlTGA7基因的表达量均显著高于野生型(图5)；说明SlJAZ7在转录水平的变化可以影响SlTGA7的转录水平。

图  4  SlTGA7和SlJAZ7在不同器官中的表达模式

1：青熟期果实，2：绿熟期果实，3：破色期果实，4：成熟红果，5：根，6：茎，7：幼叶，8：成熟叶，9：老叶，10：未完全展开的花；“*”“**”分别表示其他器官与青熟期果实在P < 0.05、P < 0.01水平差异显著(t检验)

Figure  4.  Tissue specific expression profile of SlTGA7 and SlJAZ7

1: Fruit at cyan ripening stage, 2: Fruit at green ripening stage, 3: Fruit at green colour breaking stage, 4: Mature red fruit, 5: Root, 6: Stem, 7: Young leaf, 8: Mature leaf, 9: Old leaf, 10: Not fully unfolded flower; “*” and “**” indicate significant differences between other organs and fruits at cyan ripening stage at P < 0.05 and P < 0.01 levels respectively (t test)

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图  5  SlJAZ7过表达株系叶片中SlTGA7的表达模式

WT：野生型，OE1、5、6、7、12、14：过表达株系；“*”“**”分别表示过表达株系与野生型在P < 0.05和P < 0.01水平差异显著(t检验)

Figure  5.  Expression pattern of SlTGA7 in the leaves of SlJAZ7 overexpressed strains

WT: Wild type, OE1, 5, 6, 7, 12, 14: Overexpressed lines; “*” and “**” indicate signidicant differences between overexpressed lines and wild type at P < 0.05 and P < 0.01 levels (t test)

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2.3   SlJAZ7和SlTGA7蛋白亚细胞定位

通过注射烟草下表皮细胞，使用共聚焦显微镜观察。35S:eGFP:pGAMBIA1300蛋白是质膜共定位，而SlJAZ7和SlTGA7蛋白均在细胞核中呈现绿色荧光信号(图6)，与核定位Marker的红色荧光信号重叠后呈现黄色荧光，表明SlJAZ7和SlTGA7蛋白定位于细胞核中，主要在细胞核中行使功能。

图  6  番茄SlJAZ7和SlTGA7的亚细胞定位

Figure  6.  Subcellular localization of SlJAZ7 and SlTGA7 in tomato

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2.4   Y2H验证SlJAZ7与SlTGA7的互作关系

通过Y2H点对点试验验证SlJAZ7蛋白与SlTGA7蛋白的互作关系。如图7所示，pGADT7-SlJAZ7与pGBKT7-SlTGA7在DDO/X/A和QDO/X/A平板上和阳性对照一样，正常生长且变蓝，而阴性对照没有生长、变蓝，表明SlJAZ7和SlTGA7蛋白可能存在互作。

图  7  Y2H试验验证番茄SlJAZ7和SlTGA7蛋白的互作关系

pGADT7-T/pGBKT7-Lam为阴性对照；pGADT7-T/pGBKT7-53为阳性对照；0、10⁻¹、10⁻²、10⁻³表示菌液的稀释梯度

Figure  7.  Interaction between SlJAZ7 and SlTGA7 proteins verified by Y2H

pGADT7-T/pGBKT7-Lam is negative control; pGADT7-T/pGBKT7-53 is positive control; 0, 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³ represent the dilution gradients of bacterial solution

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2.5   BiFC验证SlJAZ7与SlTGA7的互作关系

分别将SlJAZ7:nYFP、SlTGA7:cYFP菌液与核定位Marker等比例混合后共注射至烟草中，于共聚焦显微镜的叠加场下观察到细胞核中存在黄色荧光信号，与阳性对照nYFP、cYFP载体一致。但是，SlJAZ7:nYFP/cYFP、SlTGA7:cYF/nYFP无绿色荧光，这进一步证明SlJAZ7和SlTGA7蛋白可能在细胞核中共同发挥功能(图8)。

图  8  BiFC验证SlJAZ7和SlTGA7蛋白的互作关系(标尺：20 μm)

Figure  8.  Interaction between SlJAZ7 and SlTGA7 verified by BiFC (scale: 20 μm)

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2.6   pull down验证SlJAZ7与SlTGA7互作关系

将构建的原核表达载体SlJAZ7-pet28(a)-sumo-flag和SlTGA7-pet28(a)-sumo-strep通过细菌表达蛋白后，经SDS-PAGE电泳检测蛋白相对分子质量均正确，分别为41 280、51 590(图9)。使用Flag磁珠处理IP组，一抗分别使用flag和strep抗体进行孵育，结果发现，在试验组和阴性对照组的Input组和IP组中均检测到flag标签蛋白，同时试验组的Input和IP组也检测到strep标签，但在阴性对照IP组中不存在strep标签蛋白，进一步证明SlJAZ7和SlTGA7蛋白存在互作关系(图10)。

图  9  考马斯亮蓝染色检测SlJAZ7与SlTGA7蛋白的分子量

Figure  9.  Relative molecular masses of SlJAZ7 and SlTGA7 determined by Kaumas bright blue staining

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图  10  Pull down试验验证SlJAZ7与SlTGA7的互作关系

Figure  10.  Interaction between SlJAZ7与SlTGA7 verified by pull down experiment

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3.   讨论与结论

3.1   讨论

本研究通过转基因番茄的抗病表型试验，发现Pst DC3000处理后SlJAZ7-OE番茄叶片积累的H₂O₂更少，说明过表达SlJAZ7后番茄的抗病性增强。这与前期瞬时沉默SlJAZ7基因后植株感病性增强的研究结果一致^[12]，再次验证了SlJAZ7基因正调控番茄对细菌性斑点病抗性的结论。本研究发现SlTGA7基因在番茄SlJAZ7过表达株系中均上调表达，证实了SlJAZ7和SlTGA7基因可能存在协同作用的推测。番茄TGA转录因子通过与SA受体及参与植物免疫的主要调节因子NPR1相互作用，调节防御相关基因的表达来发挥作用^[24]。拟南芥AtTGA1和AtTGA4与乙烯响应因子ERF互作调控植物抗逆性^[25]。拟南芥AtTGA7负调控下游AtBG1基因的表达影响植物体内ABA含量，从而响应干旱胁迫^[26-27]。番茄SlTGA7与拟南芥中广泛参与SA调控的抗病反应基因AtTGA4、AtTGA7聚在同一分支^{[24, 28-29]}，猜测SlTGA7可能也具有相似的功能。根据上述结果推测SlJAZ7基因可能通过提高Pst DC3000病原菌侵染时SlTGA7基因的表达量，启动SlTGA7下游抗病基因的表达，从而提高SlJAZ7转基因番茄的抗病性。

MeJA比JA更稳定，但与JA作用相同，常被用来代替JA^[30]。在对番茄JAZ基因的表达分析中，发现几乎所有SlJAZs的表达都受到JA和SA的调节，因此，Sun等^[9]推测SlJAZs参与抗病的途径可能与JA和SA激素密切相关。本研究发现MeJA处理0.5 h时，SlJAZ7基因表达量显著上调，在1 h时达到最大值，说明SlJAZ7在JA诱导的抗病反应过程中属于早期基因，与番茄SlJAZ11基因的研究结果^[30]一致。在SA处理过程中，SlJAZ7表达响应SA的模式与JA并不相同，大多处于相反状态，SlTGA7基因对2种激素的响应模式与SlJAZ7基因相反，这与JA与SA信号之间存在拮抗的报道^[31-32]一致。JA与SA之间的协同作用表现在植物受到胁迫时，先激活JA介导的防御基因，随后激活SA信号介导的防御基因的表达^[33]。已知JAZ基因家族在JA信号通路起作用，TGA基因家族在SA信号通路起作用，正是因为JA与SA信号之间存在串扰，因此，我们猜测SlJAZ7基因和TGA基因家族成员之间可能存在互作，共同调控番茄对Pst DC3000的抗病性。

本研究通过组织特异性表达分析发现SlJAZ7和SlTGA7在营养器官中都高表达，猜测两者都在营养生长中发挥功能，SlTGA7可能也参与果实发育。亚细胞定位显示SlJAZ7和SlTGA7蛋白均定位于细胞核，两者主要在细胞核中行使功能，这与SlJAZ7和SlTGA7基因家族的众多同源基因的研究结果类似，如SlJAZ11^[30]、SlJAZ25^[9]、GmJAZ3^[34]、SlTGA2^[28]、AtTGA7^[27]均定位于细胞核中。JAZ蛋白作为JA反应的抑制子，已报道可通过与蛋白结合形成特异性的JAZ/TF复合物调控许多生理过程^[35]，通常涉及到丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、氧化还原调节谷胱甘肽(GRX)、MYC2、PDF1.2、WRKY70等^[36]。植物体内JA含量高时，JAZ抑制因子被泛素化降解，释放转录因子，启动JA应答基因的表达。植物体内缺少JA时，JAZ蛋白抑制转录因子MYC2、MYC3、MYC4，从而抑制JA应答基因的表达^[11]。本研究证明SlJAZ7蛋白可以与SlTGA7蛋白结合，猜测在SlJAZ7过表达的番茄株系中，SlJAZ7可能通过与SlTGA7蛋白结合，影响SlJAZ7与MYC2等转录因子形成复合物的功能，继而影响JA应答基因的表达。后期将细化转基因番茄的抗病试验，如通过在番茄中瞬时过表达及瞬时沉默SlTGA7后接种Pst DC3000，检测抗病相关基因如PR基因的表达量，验证SlTGA7的抗病功能，以及对SlJAZ7转基因植株接种Pst DC3000，利用定量PCR检测SlTGA7下游抗病相关基因的表达，检测SlJAZ7是否抑制SlTGA7的转录调控。

3.2   结论

为研究SlJAZ7的抗病机理，从番茄叶片中克隆得到SlJAZ7基因。利用农杆菌介导的遗传转化体系创制番茄过表达SlJAZ7转基因株系，接种Pst DC3000后，发现过表达SlJAZ7转基因株系积累了更少的活性氧，表明过表达SlJAZ7基因增强番茄对细菌性斑点病的抗性。表达模式分析发现SlJAZ7和SlTGA7都响应Pst DC3000、JA和SA处理，SlTGA7在SlJAZ7过表达的番茄株系中也高表达，说明SlJAZ7在转录水平正调控SlTGA7的表达。SlJAZ7和SlTGA7均定位于细胞核中，说明其主要在细胞核中行使功能。Y2H、BiFC和pull down试验证明SlJAZ7和SlTGA7蛋白存在互作，猜测SlJAZ7可能通过与SlTGA7互作，在蛋白水平参与番茄对细菌性斑点病的调控。