Analysis of genetic information in HA genes and antigen specificities of three strains of H1N1 swine influenza virus
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摘要:目的
分析3株属于欧亚类禽(SWSS1)、经典(SWL6)与Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原的特异性，为HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基础。
方法以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒为材料，比较分析3株H1N1亚型HA基因片段的遗传信息，制备全病毒灭活疫苗，各免疫3只雌性新西兰大白兔，采用血凝抑制(Hemagglutination inhibition, HI)反应试验检测抗体滴度。
结果3株病毒的HA基因片段的氨基酸序列相似性为69.4%~89.1%，各分支的HA基因的抗原表位存在差异；3株病毒经过2次免疫后平均HI抗体滴度均能达1 280以上，且SWSS1的平均HI抗体滴度高达2 560。同时SWSS1与SWL6、Pdm091057这2株病毒均无血清学交叉反应，而SWL6与Pdm091057有较低的血清学交叉反应。
结论3株猪流感病毒的HA基因片段抗原表位存在着差异，可能是3毒株之间血清学交叉反应较低的原因。3株病毒免疫原性均较好，可作为候选疫苗株。
Abstract:ObjectiveTo study the genetic information in HA genes and antigen specificities of SWSS1, SWL6 and Pdm091057 strains which respectively belongs to Eurasian avaian-like, classical and Pdm09H1N1 branches of H1N1 swine influenza viruses (SIV), and provide a basis for functional study on antigenic epitopes of HA gene as well as prevention and control of influenza virus.
MethodWe compared the genetic information in HA gene fragments of three H1N1 subtypes, SWSS1, SWL6 and Pdm091057. Inactivated SIV vaccines were prepared and each type of vaccine was used to immune three New Zealand white rabbit. The hemagglutination inhibition (HI) reaction was used to detect antibody titers.
ResultThe amino acid sequences of HA gene fragments had 69.4%–89.1% similarities among three SIV strains. There were variations in antigenic epitopes ofHA genes of the three strains. The average HI antibody titers were all above 1 280 for three strains after the second immunization, and the average HI antibody titer for SWSS1 reached 2 560. SWSS1 had no serological cross reaction with SWL6 or Pdm091057 strain, while SWL6 and Pdm091057 strains had low degree of serological cross reaction.
ConclusionThree SIV strains have differences in antigenic epitopes of HA gene, which may be the reason for the low degree of serological cross reaction among strains. All three strains have good immunogenicity, and can be used as candidate vaccine strains.
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Keywords:
- swine influence virus /
- H1N1 /
- genetic information /
- antigenic epitope /
- hemagglutination inhibition /
- antibody titer /
- HA gene
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母猪是影响猪场经济效益的重要因素之一，且其繁殖性能受多种因素的制约[1]。增加母猪产仔量、减少仔猪死亡率可有效提高母猪的繁殖性能。通过调整饲粮结构或在饲粮中添加功能性物质改善母猪营养状况和健康水平，进而改善仔猪肠道发育和提高断奶体质量，是降低断奶仔猪死亡率的关键[2]。精氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺同属于精氨酸家族氨基酸，在动物机体内可相互转化，上述氨基酸及其代谢产物在机体内可发挥多种生理功能[3]。最近多项研究表明，母猪饲粮添加L–精氨酸可促进妊娠早期胎儿的生长发育[4]，提高母猪的繁殖性能[5]；泌乳期饲粮中添加精氨酸，可通过增加母猪血浆和乳中的营养成分而提高仔猪体增质量[6]；饲粮添加w为0.7%的精氨酸和1.0 %的谷氨酰胺可促进断奶仔猪的生长[7]。精氨酸在泌乳母猪乳腺组织中代谢主要生成脯氨酸，因此脯氨酸是母猪初乳和常乳中较为丰富的氨基酸之一，也是初生哺乳仔猪的必需氨基酸。而初生仔猪小肠由精氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸合成脯氨酸的能力有限，因此母乳中的脯氨酸对仔猪生长和肠道发育尤为重要[3, 8]。脯氨酸在机体内可通过脯氨酸氧化酶(Proline oxidase, POX)、鸟氨酸转氨酶(Ornithine aminotransferase, OAT)和鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase, ODC)转变为多胺，而母乳和初生仔猪肠道上皮细胞中上述酶的活性较高，因此脯氨酸代谢产生的多胺对促进初生仔猪的肠道发育和成熟至关重要[9]。笔者前期研究发现，母猪饲粮添加脯氨酸可促进妊娠环江香猪胎儿的生长发育[10]，但脯氨酸调控哺乳仔猪生长发育方面的研究并不多见。因此，本试验通过在母猪饲粮中添加w为1 %的L–脯氨酸促进机体多胺的生成、添加ODC的特异性不可逆抑制剂二氟甲基鸟氨酸(Difluoromethylornithine, DFMO)抑制机体多胺的生成，研究其对不同日龄哺乳环江香猪血浆生化参数和氨基酸含量的影响，旨在为研发母子一体化营养调控方案提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验动物与饲养管理
试验选取首次配种并确认受孕的健康环江香猪15头，配种前15 d饲喂基础饲粮。于配种后第16天称取空腹体质量，根据体质量随机分成3组：等氮对照组的饲粮添加w为0.77 %的L–丙氨酸，脯氨酸组的饲粮添加w为1.00 %的L–脯氨酸，DFMO组的饲粮添加w为0.77 %的L–丙氨酸+w为0.016 7 %的DFMO，每组5个重复(栏)，每个重复1头猪。饲喂至产后第14 天，L–脯氨酸添加量依据Wu等[11]的报道确定，DFMO的添加量由前期在孕鼠上进行的预试验所得的最适添加剂量换算所得。每天饲喂2次，饲喂量约为体质量的3 %，自由饮水。参照NRC(1998)饲养标准[12]，并结合环江香猪养殖企业的饲料配方制定本试验基础饲粮配方(表1)。试验饲粮中添加的L–脯氨酸和L–丙氨酸(w≥99.8 %)均购自日本协和公司，DFMO(w≥99.8 %)购自武汉大华伟业化工有限公司。
表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)1)Table 1. Composition and nutrient levels of basal diet (air-dry basis)w/% 饲粮的原料组成 饲粮的营养成分 玉米 豆粕 米糠 预混料2) 粗蛋白质 钙 总磷 赖氨酸 精氨酸 脯氨酸 54.0 12.0 30.0 4.0 12.04 0.78 0.62 0.53 0.65 0.67 1)饲粮总能量为16.02 MJ·kg–1，营养成分均为实测值；2)预混料为每千克饲粮提供：维生素A 301 000 IU，维生素D 52 800 IU，维生素E 742 IU，维生素K3 71 mg，维生素B1 30 mg，维生素B2 177 mg，维生素B6 32 mg，维生素B12 0.8 mg，烟酸 1 073 mg，泛酸 540 mg，叶酸 22 mg，生物素 3.0 mg，胆碱 8.0 g，Fe 2.0 g，Cu 1.0 g，Zn 3.5 g，Mn 1.3 g，I 14 mg，Co 35 mg，Se 8.3 mg，Ca 200 mg，P 20 mg 1.2 血浆样品采集
待母猪自由分娩后2 h内称取仔猪质量，并记录仔猪头数。哺乳期间不给仔猪补充教槽料。分别于产后第7和第14 天，称取空腹体质量后每窝随机选取1头仔猪，前腔静脉采血，肝素抗凝，3 000 r·min–1离心10 min分离血浆，–20 ℃保存。
1.3 血浆生化参数和游离氨基酸的测定
样品于4 ℃解冻，用CX4型全自动生化分析仪(Beckman公司)测定血浆中胆碱酯酶(Choline esterase, CHE)和肌酸激酶(Creatine kinase, CK)的活性以及总蛋白、白蛋白、血氨、尿素氮和葡萄糖的含量。酶活力单位(U)为在1 min内能转化1 μmol底物的酶量。所用生化试剂盒均购自北京利德曼公司。用L-8800型全自动氨基酸分析仪(日立公司)测定血浆中游离氨基酸的含量。
1.4 数据处理
采用SPSS19.0软件对不同处理组的数据进行单因素方差分析，用Duncan’s法进行多重比较，数据结果以平均值±标准误表示。
2. 结果与分析
2.1 不同日龄哺乳环江香猪生长性能的变化
由表2可知，脯氨酸组仔猪初生体质量和7日龄体质量均高于等氮对照组，但差异不显著(P>0.05)，14日龄体质量显著高于等氮对照组和DFMO组(P<0.05)。
表 2 不同日龄哺乳环江香猪的生长性能1)Table 2. The growth performance of suckling Huanjiang mini-pig at different day-age处理 产仔数 初生体质量/g 7 日龄体质量/g 14 日龄体质量/g 等氮对照组 7.0±0.7 458.8±19.1 1 044.0±97.7 1 613.8±185.3b 脯氨酸组 6.4±0.7 514.6±51.0 1 169.3±139.0 2 357.4±86.4a DFMO组 8.2±0.3 410.6±24.5 1 180.0±87.1 1 500.2±64.1b 1)同列数据后凡是有一个相同小写字母或未标记字母者，表示差异不显著(n=5，P>0.05，Duncan’s 法) 2.2 不同日龄哺乳环江香猪血浆生化参数的变化
由表3可知，7日龄时，脯氨酸组和DFMO组血氨浓度显著低于等氮对照组；14日龄时，脯氨酸组血氨浓度和CHE活性显著高于DFMO组，CK活性显著低于DFMO组，葡萄糖浓度显著高于等氮对照组，其他血浆酶活性和代谢物浓度各处理组间均无显著差异。
表 3 不同日龄哺乳环江香猪的血浆生化参数1)Table 3. Plasma biochemical parameters of suckling Huanjiang mini-pig at different day-age日龄 处理 胆碱酯酶/
(U·dL–1)肌酸激酶/
(U·dL–1)总蛋白/
(g·L–1)白蛋白/
(g·L–1)血氨/
(μmol·L–1)尿素氮/
(mmol·L–1)葡萄糖/
(mmol·L–1)7 等氮对照组 6.11±0.53 19.51±5.49 60.90±1.75 27.40±0.91 118.05±20.05a 7.02±1.33 8.24±1.18 脯氨酸组 5.78±0.65 21.06±2.75 64.45±4.58 30.00±1.68 67.85±5.55b 8.02±1.40 6.40±0.65 DFMO组 5.61±0.48 15.08±2.03 54.83±5.13 28.90±1.78 75.45±8.90b 9.75±1.26 9.35±1.52 14 等氮对照组 5.71±0.32ab 17.19±3.53ab 63.63±3.01 32.40±1.05 85.70±21.18ab 7.94±2.07 7.18±0.23b 脯氨酸组 6.29±0.36a 11.29±1.79b 59.36±1.71 32.64±0.57 117.00±16.74a 6.79±0.57 9.02±0.58a DFMO组 5.25±0.25b 22.41±4.07a 60.00±2.21 32.75±1.04 52.88±14.29b 7.08±1.47 8.21±0.15ab 1)同列数据后凡是有一个相同小写字母或未标记字母者，表示差异不显著(n=5，P>0.05，Duncan’s 法) 2.3 不同日龄哺乳环江香猪血浆精氨酸家族氨基酸浓度的变化
由表4可知，14日龄时，脯氨酸组血浆脯氨酸浓度显著高于等氮对照组；DFMO组血浆鸟氨酸浓度显著高于等氮对照组；脯氨酸组和DFMO组血浆精氨酸浓度显著高于等氮对照组；等氮对照组和脯氨酸组血浆天冬酰胺浓度显著低于DFMO组。其他指标各处理组间差异均不显著。
表 4 不同日龄哺乳环江香猪血浆精氨酸家族氨基酸的浓度1)Table 4. The concentrations of arginine-family amino acids in plasma of suckling Huanjiang mini-pig at different day-agec/(μmol·mL–1) 日龄 处理 天冬氨酸 天冬酰胺 谷氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 脯氨酸 鸟氨酸 瓜氨酸 7 等氮对照组 0.027±0.004 0.096±0.028 0.214±0.101 0.887±0.431 0.099±0.032 0.737±0.262 0.083±0.035 0.064±0.024 脯氨酸组 0.028±0.005 0.060±0.018 0.219±0.041 0.607±0.386 0.101±0.011 0.718±0.167 0.080±0.012 0.076±0.021 DFMO组 0.020±0.002 0.095±0.017 0.215±0.019 0.626±0.384 0.091±0.026 0.845±0.313 0.084±0.016 0.132±0.030 14 等氮对照组 0.022±0.009 0.037±0.001b 0.196±0.086 0.450±0.217 0.060±0.015b 0.896±0.136b 0.047±0.013b 0.051±0.015 脯氨酸组 0.021±0.003 0.042±0.006b 0.215±0.028 0.309±0.027 0.110±0.021a 1.285±0.142a 0.083±0.013ab 0.098±0.032 DFMO组 0.022±0.007 0.062±0.014a 0.254±0.072 0.407±0.077 0.110±0.012a 1.074±0.198ab 0.106±0.024a 0.102±0.027 1)同列数据后凡是有一个相同小写字母或未标记字母者，表示差异不显著(n=5，P>0.05，Duncan’s 法) 3. 讨论与结论
随着胎猪的生长发育，有限的子宫空间进一步压缩，胎儿在相对紧凑的空间和营养不足的环境中竞争空间和养分，必然会影响其生长发育[13]。本试验中，脯氨酸组仔猪初生体质量比等氮对照组升高12.16%，但产仔数降低8.57%；DFMO组哺乳仔猪初生体质量比等氮对照组和脯氨酸组分别降低10.48%和20.32%，但产仔数分别提高18.57%和29.68%；脯氨酸组14日龄哺乳仔猪体质量显著高于等氮对照组和DFMO组。这可能是因为脯氨酸的代谢产物多胺促进了胎儿和仔猪的肠道发育[14]，从而提高了肠道对营养物质的消化吸收，促进了胎儿的生长发育[15]。有研究表明，脯氨酸可提高母猪繁殖性能、促进胎儿的代谢及生长发育[9-10]。例如，在妊娠11~30 d添加脯氨酸可增加1~2胎次母猪的繁殖性能；给哺乳仔猪口服脯氨酸可提高其生长性能、促进小肠粘膜发育[16]。上述结果说明，妊娠期和哺乳期补充脯氨酸均能促进胎儿和/或仔猪的生长发育[17]。DFMO组胎猪在营养相对不足条件下，胎儿的生长发育相对缓慢，对子宫空间的竞争也相对缓和。也就是说产仔数增加会造成宫内拥挤，从而降低仔猪出生质量[18]。而较低的初生体质量可能会影响其出生后的生长发育，增加其死亡率和发病率，从而降低其断奶后的存活率[19]。
CHE是一类糖蛋白酶，可催化酰基胆碱的水解。体质量增加可引起血清CHE水平的增加[20]。本试验中，脯氨酸组14日龄仔猪血浆CHE活性和体质量均显著高于DFMO组，提示母猪饲粮添加脯氨酸可调节哺乳仔猪的脂代谢从而促进其生长发育。CK主要存在于心肌和骨骼肌中，其主要的生物学功能是可逆地催化肌酸和ATP之间的转磷酰基反应，为肌肉收缩以及转运系统提供能量[21]。血浆CK活性的升高一般提示存在肌肉损伤或应激反应。本试验中，脯氨酸组仔猪血浆CK活性显著低于DFMO组，说明母猪饲粮添加脯氨酸可减少哺乳仔猪的应激反应，这有利于仔猪的生长发育。
血浆代谢物来源于机体消化吸收的营养物质和组织器官的代谢产物，可用来反映机体的新陈代谢和内脏器官的健康状况。血氨主要是由体内氨基酸的脱氨基作用产生，或消化道细菌代谢产生，对动物机体有一定的毒性。正常情况下，肝脏能将氨转化为尿素，再由肾脏排出体外[22]。本试验中，7日龄时脯氨酸组和DFMO组仔猪血氨浓度比等氮对照组分别显著降低42.52%和36.09%，14日龄时脯氨酸组比DFMO组显著升高了121.26%，提示饲粮添加脯氨酸可能影响了氨基酸的脱氨基作用或尿素合成作用，但具体机制还不清楚。葡萄糖是机体新陈代谢不可缺少的重要能量来源。乳糖在仔猪消化道内被水解为葡萄糖，而肠道吸收是血液中葡萄糖的主要来源。精氨酸可通过其代谢产物NO调控葡萄糖代谢[23]。多胺可影响机体的氨基酸和葡萄糖代谢[24]。本试验中，脯氨酸组14日龄仔猪血浆葡萄糖浓度分别比等氮对照组和DFMO组显著升高25.62%和9.86%，可能是由于精氨酸和脯氨酸的代谢引起的，这可减少机体内蛋白质的分解，有助于提高机体的免疫力和抗逆能力，促进仔猪的生长发育[2]。
由于母猪乳腺细胞中富含精氨酸酶，乳腺中的精氨酸被大量分解代谢[25]。内源合成是支持机体和肠道生长发育所需精氨酸的重要途径[26]。因此，精氨酸缺乏是影响仔猪生长发育的主要因素之一。本试验中，脯氨酸组14日龄哺乳仔猪血浆精氨酸和脯氨酸浓度分别比等氮对照组显著升高83.33%和43.42%，主要是由于饲粮添加的脯氨酸可在初生仔猪小肠内转化为精氨酸，这对改善仔猪的肠道发育和促进生长具有重要作用[6]。天冬酰胺在机体内可通过一系列脱氨基和转氨基途径生成精氨酸[27]。本试验发现，DFMO组14日龄哺乳仔猪血浆精氨酸、鸟氨酸和天冬酰胺浓度比等氮对照组分别显著升高83.33%、125.53%和67.57%，天冬酰胺浓度比脯氨酸组显著升高13.51%，这可能是由于DFMO抑制了脯氨酸的多胺合成途径，而增强了脯氨酸转化为精氨酸家族其他氨基酸的途径。哺乳仔猪血浆生化参数和氨基酸浓度发生不同程度的变化，可能是由于母猪饲粮添加脯氨酸或DFMO后影响了母乳成分，进而改变了仔猪的机体代谢[6]，其具体原因尚需进一步研究。
综上所述，母猪饲粮添加脯氨酸能通过影响哺乳仔猪葡萄糖和氨基酸代谢而促进其生长发育。
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图 1 SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株的HA基因遗传进化关系
Figure 1. Phylogenetic tree of HA genes of SWSS1, SWL6 and Pdm091057 strains
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图 2 SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株HA基因片段抗原表位分析
绿色、黄色、红色、蓝色和紫色方框内分别为Sa、Sb、Cb、Ca1和Ca2位点。
Figure 2. Analysis of antigenic epitopes in HA gene fragments of SWSS1, SWL6 and Pdm091057 strains
表 1 不同亚型抗原对标准血清抗体滴度检测结果
Table 1 The titers of different subtypes of the influenza virus against the standard serums
毒株(四单位抗原) HI抗体滴度 抗SWSS1血清 抗SWL6血清 抗Pdm091057血清 A/swine/Guangdong/SS1/2012(H1N1)1) 2 560 <20 <20 A/swine/Guangdong/L6/2012(H1N1)2) <20 1 280 40 A/Guangdong/1057/2010(H1N1)3) <20 40 1 280 A/swine/Guangdong/l22/2010(H3N2) 40 <20 <20 A/Duck/Anhui/1/2006/(H5N1) <20 <20 <20 A/Chicken/Shanghai/10/2001(H9N2) <20 <20 <20 A/Pigeon/Shanghai/S1421/2013(H7N9) <20 <20 <20 1) 为SWSS1; 2) 为SWL6；3) 为Pdm091057。 
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