Prokaryotic expression of S5-2 gene and cloning of S5 segment from Anhui isolate of Southern rice black-streaked dwarf virus
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摘要:目的
探讨南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）安徽分离物（SRBSDV-AnHui-HN2）的遗传特性，并获得原核表达的P5-2蛋白。
方法RT-PCR扩增SRBSDV S5片段，克隆、测序并进行序列分析。将S5-2基因插入原核表达载体，重组载体转化大肠埃希菌并用IPTG诱导，Ni2+-NTA亲和柱纯化融合蛋白，SDS-PAGE分析P5-2蛋白的表达情况。
结果SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段全长3 167 bp，包含S5-2基因全长612 bp，编码204个氨基酸。序列比对结果显示，SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段与其他SRBSDV分离物S5片段的序列相似性极高，达99.0%~99.7%，而与斐济病毒属（Fijivirus）其他成员S5片段的序列相似性较低，仅为38.0%~71.3%；构建的S5片段系统发育树表明SRBSDV和RBSDV聚成1个分支，其中6个SRBSDV分离物聚成1个亚分支。原核表达获得相对分子质量约为47 000的重组蛋白，Western blot分析显示，GST单抗能够与重组融合蛋白发生特异性反应。
结论SRBSDV各分离物之间亲缘关系非常近，而与Fijivirus其他成员亲缘关系较远，原核表达获得的融合蛋白为靶标蛋白。
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关键词:
- 南方水稻黑条矮缩病毒 /
- S5片段 /
- S5-2基因 /
- 原核表达
Abstract:ObjectiveTo study genetic characteristics of the isolates of Southern rice black-streaked dwarf virus(SRBSDV) from Anhui province, and to obtain P5-2 protein by prokaryotic expression.
MethodThe S5 segment of SRBSDV was amplified by RT-PCR, and it was cloned, sequenced and analyzed. Gene S5-2 was inserted into prokaryotic expression vector. The recombinant vector was transformed into Escherichia coli and was induced by IPTG. The fusion protein was purified by Ni2+-NTA affinity column. The expression of P5-2 protein was analyzed by SDS-PAGE.
ResultThe S5 segment from Anhui isolate of SRBSDV(SRBSDV-AnHui-HN2) was 3 167 bp in full length and contained a 612 bp S5-2 gene encoding 204 amino acids. Sequence comparison showed that the S5 segment of SRBSDV-AnHui-HN2 shared high sequence similarity(99.0%-99.7%) with other SRBSDV isolates, while had relatively low sequence similarity(38.0%-71.3%) to other Fijivirus members. The phylogenetic tree based on S5 segment sequences showed that SRBSDV and RBSDV clustered into a branch, and six isolates of SRBSDV clustered into a sub-branch. The recombinant protein with approximately 47 000 relative molecular mass was obtained by prokaryotic expression. Western blot analysis revealed that GST monoclonal antibody could specifically bind to the fusion protein.
ConclusionAll isolates of SRBSDV are closely related, and they have relatively far relationship to other Fijivirus members. The fusion protein obtained by prokaryotic expression is the target protein.
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水稻Oryza sativa L. 是人类最重要的粮食作物之一，杂交水稻的推广极大地提高了水稻单产，为我国粮食安全提供了强有力的保障。但是杂交稻尤其是两系杂交稻在种子生产过程中，光温敏核雄性不育系在低温条件下育性容易恢复，导致杂交种亲本混淆和杂交种纯度下降。例如‘培矮64S’在1989、2001和2002年夏季的低温条件下，出现了严重的育性恢复，致使其组配的F1杂交种出现了较大比率的假杂交种[1]。如何在低温条件下确保不育系和杂交种的纯度一直以来是困惑育种学家们的一个难题。为了解决这一问题，人们尝试使用了不同的方法，例如人工除杂技术和紫叶标记技术。比较而言，人工除杂技术有明显的缺陷，使用该技术进行人工筛选去除假不育系，不仅成本高周期长，而且许多性状受栽培技术及环境因素的影响而不易辨别，影响筛选效果。而紫叶标记技术具有明显的优势，导入了隐性紫叶性状的不育系在苗期表现紫色，如果繁种时该隐性紫叶不育系与其他正常绿叶的水稻串粉结实，其杂交种表现为绿色，那么在苗期的制种田里就能轻易剔除掉混杂的不育系，保证不育系纯度。为此，育种学家们将紫叶标记技术与不育系的选育相结合，先后育出‘中紫S’、‘明紫–2S’、‘明紫–3S’、‘99Hll4紫S’、‘紫IIA’和‘先红A’[2-7]等一批具有较高应用价值的紫叶不育系，极大减少了杂交稻因种子纯度下降而造成的损失。
水稻的紫色性状与花青素含量的累积相关。花青素是一种黄酮类植物色素，它的合成既受结构基因编码蛋白的调控，也受调节因子，如MYB(v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族的bHLH(Helix-helix-turn-helix)蛋白等的控制[8]。花青素的转运与积累可能受GST(Glutathione S-transferase)和MATE(Multidrug and toxin efflux)蛋白家族基因等的调控[9-10]。截至2018年3月，通过图位克隆已克隆出OsC1和Plw2个水稻紫叶性状基因，其中，OsC1位于第6号染色体上编码1个MYB类转录因子，Plw位于第4号染色体上，由OsB1和OsB2共同组成，编码1个bHLH转录因子[11-12]，这些基因的克隆促进了对水稻花青素分子调控机制的理解。但是，水稻紫叶性状受合成基因、调节基因和转运基因等多个基因控制。因此，深入挖掘水稻紫叶新基因，对增进对水稻花青素分子调控机制的理解并促进其在水稻遗传改良中的应用具有重要意义。
本研究从紫叶籼稻品种‘Z3474’与绿叶粳稻品种‘日本晴’的杂交后代中选育得到紫叶纯系材料pl41，并对其进行表型分析、遗传分析和基因初步定位研究，以期为pl41的图位克隆、花青素分子调控路径解析和pl41在水稻遗传改良中的应用奠定坚实基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
水稻紫叶材料pl41是从紫叶籼稻品种‘Z3474’与绿叶粳稻品种‘日本晴’的杂交后代中筛选得到的1份紫叶性状稳定遗传的材料。pl41与‘日本晴’杂交后代F1及分离群体F2用于紫叶性状的遗传分析和基因初步定位研究。
1.2 田间种植和性状调查
田间试验分别于2015和2016年在广西大学农学院试验田进行，分早晚2季：早季3月1日播种，4月7日移栽；晚季7月21日播种，8月9日移栽。株行距15 cm×25 cm，单株种植，每行10株，常规水肥管理。苗期、抽穗期和灌浆期分别观察pl41、‘日本晴’和F1植株的叶色，并统计分析F2群体中紫叶和绿叶单株的分离情况，挑选F2群体中紫叶单株进行目标基因定位研究。
1.3 叶绿素及花青素含量测定
在苗期、抽穗期和灌浆期分别取pl41和‘日本晴’的倒2叶进行叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素和花青素含量的测定，每个时期每个亲本分别重复3次。
叶绿素含量测定：样品表面用蒸馏水冲洗，并用吸水纸吸干表面水分，将叶片剪成直径为1~3 mm的碎片，混匀后称取碎片0.05 g，放入25 mL棕色试剂瓶中，重复3次。用V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1的混合液定容至25 mL，室温下置于摇床上振荡24 h，使碎片与试剂充分接触。以V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1的混合液为空白对照，使用INESA L5S紫外可见分光光度计测定浸提液在波长470、645和663 nm下的吸光度(D)。
按照以下公式分别计算叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量：
w(叶绿素a)=(12.7D663 nm–2.69D645 nm)V/(1 000m)，
w(叶绿素b)=(22.9D645 nm–4.68D663 nm)V/(1 000m)，
w(总叶绿素)=(20.2D645 nm+8.02D663 nm)V/(1 000m)，
w(类胡萝卜素)=4.7D470 nm–0.27w总。
式中，V为提取液总体积(25 mL)；m为样品质量(0.05 g)。
花青素含量测定：样品表面用蒸馏水冲洗，并用吸水纸吸干表面水分，将叶片剪成直径为1~3 mm的碎片，混匀后称取碎片0.1 g，放入10 mL离心管中，重复3次。加入0.1 mol·L–1盐酸溶液，定容至10 mL。室温下置于摇床上振荡4 h，使碎片与试剂充分接触。以0.1 mol·L–1的盐酸溶液为空白对照，使用INESA L5S紫外可见分光光度计在530 nm下测定浸提液的吸光度。假设吸光度D530 nm=0.1时的花青素浓度为1个单位，用以比较花青素的相对含量，计算公式为：
花青素的相对含量=10D530 nm。
1.4 统计分析方法
采用SPSS11.0和Excel软件对试验数据进行统计分析，差异显著性分析采用t检验法。
1.5 DNA提取、PCR体系及电泳
参照Monna等[13]的方法提取叶片基因组DNA。用于基因定位的PCR扩增体系为10 μL： DNA模板1 μL、上下游引物各0.4 μL、PCR Mix 5 μL和ddH2O 3.2 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，33个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物经70 g·L–1的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。用于候选基因测序的PCR扩增体系为40 μL，包括DNA模板4 μL、上下游引物各1.6 μL、2×EasyPfu PCR SuperMix 20 μL、ddH2O 12.8 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 35 s、72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经20 g·L–1的琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带回收后由深圳华大基因公司测序。PCR Mix和EasyPfu PCR SuperMix均购自全式金生物技术公司。
1.6 多态性分子标记的开发
基因连锁分析及定位的分子标记包括STS和SSR标记，其中SSR标记引物序列来自数据库 http://www.gramene.org，STS标记基于粳稻品种‘日本晴’和籼稻品种‘9311’的序列差异，在差异序列两端开发设计引物，SSR和STS标记引物均由深圳华大基因公司合成。
1.7 候选基因的预测分析
利用RAP-DB( http://rapdb.dna.affrc.go.jp)和GRAMENE( http://ensembl.gramene.org)水稻基因组注释信息，对定位区间内的所有基因进行预测，结合候选基因编码区序列的测序比对，分析候选基因。
2. 结果与分析
2.1 pl41植株表型特征
pl41株型与‘日本晴’无明显差异，但植株颜色有明显差别。在苗期，pl41叶鞘、叶尖和叶缘处呈现紫色，颜色较浅(图1A)；从苗期开始，植株紫色逐渐变深，抽穗期地上部分组织呈现较深的紫色(图1B)。‘日本晴’植株在各个时期均表现为绿色(图1A、1B)。pl41叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量在苗期显著高于‘日本晴’，在抽穗期显著低于‘日本晴’，在灌浆期无显著差异；pl41花青素含量在苗期、抽穗期和灌浆期均极显著高于‘日本晴’(表1)。花青素含量与叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的相关系数分别为–0.936、–0.958和–0.941，均达极显著负相关(P<0.01)。在抽穗期，pl41叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均低于苗期，花青素含量高于苗期；在灌浆期，pl41叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量高于抽穗期，花青素含量低于抽穗期(表1)。
表 1 pl41和‘日本晴’在3个不同发育时期叶绿素、类胡萝卜素及花青素含量比较1)Table 1. Comparisons of chlorophyll, carotenoid and anthocyanin contents between pl41 and ‘Nipponbare’ at three different developmental stages生长期 材料 w(mg·g–1) 花青素相对含量 叶绿素a 叶绿素b 总叶绿素 类胡萝卜素 苗期 pl41 5.37±0.52** 1.13±0.10** 6.50±0.62** 2.07±0.19** 2.73±0.07*** 日本晴 4.05±0.06 0.82±0.01 4.87±0.07 1.54±0.02 0.07±0.01 抽穗期 pl41 2.68±0.18** 0.47±0.07** 3.15±0.24** 1.03±0.04** 17.00±0.35*** 日本晴 4.78±0.33 1.30±0.14 6.08±0.47 1.94±0.12 0.08±0.44 灌浆期 pl41 3.20±0.18 0.65±0.04 3.85±0.22 1.65±0.08 10.88±0.43*** 日本晴 3.44±0.19 0.65±0.04 4.09±0.23 1.66±0.08 0.02±0.01 1) “**”和“***”分别表示pl41和‘日本晴’相同时期的相同指标在 0.01 和 0.001 水平差异显著(t 检验法) 2.2 pl41紫叶性状遗传分析
为了明确pl41紫叶性状的遗传基础，本研究对pl41与‘日本晴’杂交后代F1及分离群体F2的紫叶性状进行了遗传分析。结果表明，F1代植株均表现为绿叶，F2代植株叶片颜色呈现明显的紫色和绿色分离，绿叶和紫叶单株数分别为254和79株，符合3∶1的分离比(χ2=0.26，P>0.05)，表明pl41紫叶性状受1对隐性主效核基因控制。
2.3 pl41的初步定位
为了分离控制pl41紫叶性状的目标基因pl41，我们在F2代分离群体中选取了480株紫叶单株用于pl41的初步定位研究。利用127对在pl41和‘日本晴’之间存在多态性的STS和SSR分子标记引物对480株紫叶单株进行连锁分析，结果表明目标基因pl41与第12号染色体上的分子标记引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7(表2)的序列存在不同程度的连锁，并且被初步定位于P3和P4之间289 kb的范围内(图2)。在此定位区间内，存在53个注释的预测基因，这些基因编码的蛋白详见表3。其中，有5个基因可能与花青素的合成与转运相关：1个GST蛋白编码基因(编号25)、1个MYB类转录因子蛋白编码基因(编号44)和3个MATE转运蛋白编码基因(编号49、52、53)。对pl41这5个基因的编码区序列进行测序，并分别与‘日本晴’序列比对，发现这5个基因的编码区序列与‘日本晴’无差异。
表 2 pl41初步定位所用引物Table 2. Primers used in preliminary mapping of pl41名称 分子标记类型 正向序列（5′→3′） 反向序列（5′→3′） P1 SSR GCTTCCCTTGTATACTCTATCT CCTCTTATCAGACGCACAA P2 SSR CTTCTTCCCGTTGTTCCCAA GTTTGGAGGTGAGCTGGACA P3 STS TGGTAACTAGTACTCTCCCTT CTTCTGTAACTCCATTCTGA P4 STS TTTTAACATCTCCATTCTCG GACGAATAGTCAAACAGTGC P5 STS TGTTGAATATGCACAAAGAG TGGTTCATTGGCTTAGGA P6 STS TTATTCCCCGACCAATCAAC CAAATTCCGCTTGGTATTGAC P7 STS TCCCAATCATGGAAATACTT TTGTTTCTTAGAAGCAGAGG ![]()
图 2 水稻紫叶基因pl41在第12号染色体上的初步定位Figure 2. Preliminary mapping of rice purple leaf gene pl41 on chromosome 12表 3 定位区间内的基因注释Table 3. Gene annotation in the preliminary mapped region编号 基因功能注释 基因 ID 编号 基因功能注释 基因 ID 1 DUF567 结构域包含蛋白 LOC_Os12g02720 28 反转座子蛋白 LOC_Os12g03000 2 组氨酸三聚体家族蛋白 LOC_Os12g02730 29 反转座子蛋白 LOC_Os12g03010 3 表达蛋白 LOC_Os12g02750 30 转座子蛋白 LOC_Os12g03020 4 DUF567 结构域包含蛋白 LOC_Os12g02760 31 保守的假定蛋白 LOC_Os12g03030 5 反转座子蛋白 LOC_Os12g02770 32 无顶端分生组织蛋白 LOC_Os12g03040 6 反转座子蛋白 LOC_Os12g02780 33 无顶端分生组织蛋白 LOC_Os12g03050 7 表达蛋白 LOC_Os12g02790 34 表达蛋白 LOC_Os12g03060 8 CRP11–富含半胱氨酸蛋白前体 LOC_Os12g02800 35 FHA 结构域包含蛋白 LOC_Os12g03070 9 蛋白激酶结构域包含蛋白 LOC_Os12g02810 36 rp3 蛋白 LOC_Os12g03080 10 反转座子蛋白 LOC_Os12g02814 37 核糖体蛋白 LOC_Os12g03090 11 胞苷酰基转移酶结构域包含蛋白 LOC_Os12g02820 38 表达蛋白 LOC_Os12g03094 12 SNF7 结构域包含蛋白 LOC_Os12g02830 39 结构域包含蛋白 LOC_Os12g03100 13 ATCHX 蛋白 LOC_Os12g02840 40 ZF–HD 蛋白二聚化结构域包含蛋白 LOC_Os12g03110 14 表达蛋白 LOC_Os12g02850 41 表达蛋白 LOC_Os12g03120 15 反转座子蛋白 LOC_Os12g02860 42 CDC45A–假定的DNA复制起始蛋白 LOC_Os12g03130 16 GRAS 家族转录因子结构域包含蛋白 LOC_Os12g02870 43 表达蛋白 LOC_Os12g03140 17 E2F 相关蛋白 LOC_Os12g02880 44 MYB 类转录因子蛋白 LOC_Os12g03150 18 反转座子蛋白 LOC_Os12g02890 45 转座子蛋白 LOC_Os12g03160 19 反转座子蛋白 LOC_Os12g02900 46 表达蛋白 LOC_Os12g03170 20 糖基转移酶 LOC_Os12g02910 47 Mad3/BUB1 同源蛋白 LOC_Os12g03180 21 表达蛋白 LOC_Os12g02920 48 高丝氨酸脱氢酶 LOC_Os12g03190 22 表达蛋白 LOC_Os12g02930 49 MATE 转运蛋白 LOC_Os12g03200 23 EMB2748 蛋白 LOC_Os12g02950 50 转座子蛋白 LOC_Os12g03210 24 表达蛋白 LOC_Os12g02940 51 表达蛋白 LOC_Os12g03220 25 谷胱甘肽–S–转移酶 LOC_Os12g02960 52 MATE 转运蛋白 LOC_Os12g03230 26 RNA 结合蛋白 LOC_Os12g02970 53 MATE 转运蛋白 LOC_Os12g03240 27 核苷三磷酸酶 LOC_Os12g02980 3. 讨论与结论
水稻紫色性状为明显的标记性状，在不育系和杂交稻种子纯度的鉴定上具有重要的应用价值，其性状表现与花青素的合成、转运和累积相关。花青素分布的多样性使得水稻紫色性状表现多样化，例如有些水稻品种在叶鞘和茎基部表现紫色，而有些水稻品种只在叶缘、柱头和稃尖等部位呈现紫色。本研究鉴定出来的pl41植株大部分组织均表现紫色，带紫色性状的植株与绿色植株区别明显，而且紫色性状稳定，不易受季节和环境因素影响，由此可见，pl41具有较大的应用潜力。
目前，虽然关于水稻紫色性状已有较深入研究，但已报道的紫色性状基因多为显性基因，例如OsC1和PSH1(t)[11, 14]。由于显性基因无法区分纯合子和杂合子，使得无法剔除掉混杂的不育系和假杂种，所以这类基因一般不能应用于生产实践。因此，挖掘隐性紫色性状基因，对于促进其在生产实践上的成功应用具有重要意义。本研究鉴定的pl41为隐性基因，定位于第12号染色体短臂289 kb范围内，在目前报道的水稻紫叶基因中没有1个基因位于该区域，这表明pl41可能是1个新的隐性紫叶基因。在该定位区间内发现有5个基因可能与花青素的合成与转运相关，包括1个MYB类转录因子蛋白编码基因、1个GST蛋白编码基因和3个MATE蛋白编码基因。在植物中，MYB类转录因子蛋白调控花青素结构基因的时空表达和花青素的组织分布[8]，水稻第6号染色体上的1个MYB类转录因子蛋白编码基因OsC1被发现与叶鞘花青素的累积相关[11]；GST和MATE蛋白家族基因被发现可能参与花青素向液泡的转运，例如拟南芥的TT19基因[15]、玉米的Bronze-2基因[9]和拟南芥的TT12基因[16]，就已被证明与花青素的累积相关。通过测序比对分析，发现这5个基因的编码区序列在pl41与‘日本晴’之间无差异，表明它们可能不是pl41紫叶性状的候选基因，但也不能完全排除这种可能，因为导致表型变异的因素除了基因编码区序列差异以外，基因启动子和增强子区序列的差异也能导致表型变异。因此，下一步拟检测这5个基因在启动子和增强子区的序列差异和转录水平上的表达差异，预测可能的候选基因。同时也配制了pl41的大分离群体，以期通过精细定位为pl41最终的图位克隆奠定基础。
研究表明，叶色标记一般全生育期表达，在影响不育系本身农艺性状的同时，对繁种和制种产量也有一定负效应。本研究发现，pl41花青素的累积与叶绿素含量的变化呈显著负相关，这表明pl41可能对农艺性状尤其是水稻产量性状有一定的影响。由于近等基因系的遗传背景基本一致，可以最大限度降低遗传背景对目标基因的影响，因此它是准确分析目标基因对产量性状影响的理想材料。为了更准确地分析pl41对水稻产量性状的影响、更详细地评估pl41的应用潜力，目前正在构建pl41的近等基因系，拟利用pl41的近等基因系来分析pl41对农艺性状的影响。这些工作将为阐明pl41对水稻产量性状的影响和评价pl41的应用潜力奠定坚实的基础。
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图 1 基于S5片段核苷酸序列构建的系统关系树
Figure 1. Relationship dendrogram of SRBSDV-Anhui-HN2 and other isolates of Fijivirus based on S5 segment sequences
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图 2 重组质粒pET-S5-2的酶切电泳图谱
M：DNA marker DL2000；1：BamH I和Sal I双酶切pET-S5-2；2：BamH I单酶切pET-S5-2；3：Sal I单酶切pET-S5-2；4：重组质粒pET-S5-2。
Figure 2. Electrophoresis pattern of recombinant plasmid pET-S5-2 digested with restriction enzyme
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图 3 融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析
M：分子质量蛋白Marker；1：pET-GST空载体未诱导；2：pET-GST空载体诱导；3：pET-S5-2未诱导；4：pET-S5-2诱导；5：纯化的融合蛋白。
Figure 3. SDS-PAGE and Western blot analysis of fusion protein
表 1 SRBSDV-Anhui-HN2 S5片段与16个斐济病毒属其他分离物S5片段核苷酸序列的相似性
Table 1 Nucleotide sequence similarity between S5 segment of SRBSDV-Anhui-HN2 and S5 segments of 16 other isolates of Fijivirus
分离物 GenBank登录号 来源地 相似性/% SRBSDV-Anhui-HN2 HF954999 中国安徽 100.0 SRBSDV-VNM JQ692576 越南 99.7 SRBSDV-HuNyy JQ034352 中国湖南 99.5 SRBSDV-Hubei HM585275 中国湖北 99.4 SRBSDV-YN-MShi JQ773424 中国云南 99.2 SRBSDV-HN FN563993 中国海南 99.0 RBSDV-HB KC134293 中国河北 71.3 RBSDV-JS KM921677 中国江苏 71.1 RBSDV-SDZZ10 JX421768 中国山东 70.2 RBSDV-MX8 HF954989 中国安徽 70.2 RBSDV-Anhui-LJ HF955009 中国安徽 70.2 RBSDV-WZ KC801047 中国浙江 70.1 RBSDV-LH KC801046 中国浙江 70.0 RBSDV-Korean HQ670667 韩国 69.9 FDV-AUS NC_007160 澳大利亚 49.9 MRCV-Arg AY607587 阿根廷 64.1 NLRV-TSU D49697 古巴 38.0 
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