南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S5片段的克隆及<i>S5-2</i>基因的原核表达

江彤; 单文书; 夏伟伟; 张享享; 蒋西子

doi:10.7671/j.issn.1001-411X.2017.01.010

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S5片段的克隆及S5-2基因的原核表达

安徽农业大学植物保护学院, 安徽合肥 230036

基金项目:

国家自然科学基金 31371915

公益性行业（农业）科研专项 201303028

详细信息

作者简介:
江彤（1970—），男，副教授，博士，E-mail: jiangtong4650@sina.com

中图分类号: S435.111.4
计量
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出版历程
- 收稿日期: 2016-04-17
- 网络出版日期: 2023-05-17
- 刊出日期: 2017-01-09

Prokaryotic expression of S5-2 gene and cloning of S5 segment from Anhui isolate of Southern rice black-streaked dwarf virus

School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China

摘要

摘要:
目的
探讨南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）安徽分离物（SRBSDV-AnHui-HN2）的遗传特性，并获得原核表达的P5-2蛋白。
方法
RT-PCR扩增SRBSDV S5片段，克隆、测序并进行序列分析。将S5-2基因插入原核表达载体，重组载体转化大肠埃希菌并用IPTG诱导，Ni²⁺-NTA亲和柱纯化融合蛋白，SDS-PAGE分析P5-2蛋白的表达情况。
结果
SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段全长3 167 bp，包含S5-2基因全长612 bp，编码204个氨基酸。序列比对结果显示，SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段与其他SRBSDV分离物S5片段的序列相似性极高，达99.0%~99.7%，而与斐济病毒属（Fijivirus）其他成员S5片段的序列相似性较低，仅为38.0%~71.3%；构建的S5片段系统发育树表明SRBSDV和RBSDV聚成1个分支，其中6个SRBSDV分离物聚成1个亚分支。原核表达获得相对分子质量约为47 000的重组蛋白，Western blot分析显示，GST单抗能够与重组融合蛋白发生特异性反应。
结论
SRBSDV各分离物之间亲缘关系非常近，而与Fijivirus其他成员亲缘关系较远，原核表达获得的融合蛋白为靶标蛋白。
- 南方水稻黑条矮缩病毒 /
- S5片段 /
- S5-2基因 /
- 原核表达
Abstract:
Objective
To study genetic characteristics of the isolates of Southern rice black-streaked dwarf virus(SRBSDV) from Anhui province, and to obtain P5-2 protein by prokaryotic expression.
Method
The S5 segment of SRBSDV was amplified by RT-PCR, and it was cloned, sequenced and analyzed. Gene S5-2 was inserted into prokaryotic expression vector. The recombinant vector was transformed into Escherichia coli and was induced by IPTG. The fusion protein was purified by Ni²⁺-NTA affinity column. The expression of P5-2 protein was analyzed by SDS-PAGE.
Result
The S5 segment from Anhui isolate of SRBSDV(SRBSDV-AnHui-HN2) was 3 167 bp in full length and contained a 612 bp S5-2 gene encoding 204 amino acids. Sequence comparison showed that the S5 segment of SRBSDV-AnHui-HN2 shared high sequence similarity(99.0%-99.7%) with other SRBSDV isolates, while had relatively low sequence similarity(38.0%-71.3%) to other Fijivirus members. The phylogenetic tree based on S5 segment sequences showed that SRBSDV and RBSDV clustered into a branch, and six isolates of SRBSDV clustered into a sub-branch. The recombinant protein with approximately 47 000 relative molecular mass was obtained by prokaryotic expression. Western blot analysis revealed that GST monoclonal antibody could specifically bind to the fusion protein.
Conclusion
All isolates of SRBSDV are closely related, and they have relatively far relationship to other Fijivirus members. The fusion protein obtained by prokaryotic expression is the target protein.
- outhern rice black-streaked dwarf virus /
- S5 segment /
- S5-2 gene /
- prokaryotic expression

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母猪是影响猪场经济效益的重要因素之一，且其繁殖性能受多种因素的制约^[1]。增加母猪产仔量、减少仔猪死亡率可有效提高母猪的繁殖性能。通过调整饲粮结构或在饲粮中添加功能性物质改善母猪营养状况和健康水平，进而改善仔猪肠道发育和提高断奶体质量，是降低断奶仔猪死亡率的关键^[2]。精氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺同属于精氨酸家族氨基酸，在动物机体内可相互转化，上述氨基酸及其代谢产物在机体内可发挥多种生理功能^[3]。最近多项研究表明，母猪饲粮添加L–精氨酸可促进妊娠早期胎儿的生长发育^[4]，提高母猪的繁殖性能^[5]；泌乳期饲粮中添加精氨酸，可通过增加母猪血浆和乳中的营养成分而提高仔猪体增质量^[6]；饲粮添加w为0.7%的精氨酸和1.0 %的谷氨酰胺可促进断奶仔猪的生长^[7]。精氨酸在泌乳母猪乳腺组织中代谢主要生成脯氨酸，因此脯氨酸是母猪初乳和常乳中较为丰富的氨基酸之一，也是初生哺乳仔猪的必需氨基酸。而初生仔猪小肠由精氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸合成脯氨酸的能力有限，因此母乳中的脯氨酸对仔猪生长和肠道发育尤为重要^{[3, 8]}。脯氨酸在机体内可通过脯氨酸氧化酶(Proline oxidase, POX)、鸟氨酸转氨酶(Ornithine aminotransferase, OAT)和鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase, ODC)转变为多胺，而母乳和初生仔猪肠道上皮细胞中上述酶的活性较高，因此脯氨酸代谢产生的多胺对促进初生仔猪的肠道发育和成熟至关重要^[9]。笔者前期研究发现，母猪饲粮添加脯氨酸可促进妊娠环江香猪胎儿的生长发育^[10]，但脯氨酸调控哺乳仔猪生长发育方面的研究并不多见。因此，本试验通过在母猪饲粮中添加w为1 %的L–脯氨酸促进机体多胺的生成、添加ODC的特异性不可逆抑制剂二氟甲基鸟氨酸(Difluoromethylornithine, DFMO)抑制机体多胺的生成，研究其对不同日龄哺乳环江香猪血浆生化参数和氨基酸含量的影响，旨在为研发母子一体化营养调控方案提供参考。

1. 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

试验选取首次配种并确认受孕的健康环江香猪15头，配种前15 d饲喂基础饲粮。于配种后第16天称取空腹体质量，根据体质量随机分成3组：等氮对照组的饲粮添加w为0.77 %的L–丙氨酸，脯氨酸组的饲粮添加w为1.00 %的L–脯氨酸，DFMO组的饲粮添加w为0.77 %的L–丙氨酸+w为0.016 7 %的DFMO，每组5个重复(栏)，每个重复1头猪。饲喂至产后第14 天，L–脯氨酸添加量依据Wu等^[11]的报道确定，DFMO的添加量由前期在孕鼠上进行的预试验所得的最适添加剂量换算所得。每天饲喂2次，饲喂量约为体质量的3 %，自由饮水。参照NRC(1998)饲养标准^[12]，并结合环江香猪养殖企业的饲料配方制定本试验基础饲粮配方(表1)。试验饲粮中添加的L–脯氨酸和L–丙氨酸(w≥99.8 %)均购自日本协和公司，DFMO(w≥99.8 %)购自武汉大华伟业化工有限公司。

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)¹⁾

Table 1. Composition and nutrient levels of basal diet (air-dry basis) w/%

饲粮的原料组成				饲粮的营养成分
玉米	豆粕	米糠	预混料²⁾	粗蛋白质	钙	总磷	赖氨酸	精氨酸	脯氨酸
54.0	12.0	30.0	4.0	12.04	0.78	0.62	0.53	0.65	0.67
1)饲粮总能量为16.02 MJ·kg^–1，营养成分均为实测值；2)预混料为每千克饲粮提供：维生素A 301 000 IU，维生素D 52 800 IU，维生素E 742 IU，维生素K₃ 71 mg，维生素B₁ 30 mg，维生素B₂ 177 mg，维生素B₆ 32 mg，维生素B₁₂ 0.8 mg，烟酸 1 073 mg，泛酸 540 mg，叶酸 22 mg，生物素 3.0 mg，胆碱 8.0 g，Fe 2.0 g，Cu 1.0 g，Zn 3.5 g，Mn 1.3 g，I 14 mg，Co 35 mg，Se 8.3 mg，Ca 200 mg，P 20 mg

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1.2 血浆样品采集

待母猪自由分娩后2 h内称取仔猪质量，并记录仔猪头数。哺乳期间不给仔猪补充教槽料。分别于产后第7和第14 天，称取空腹体质量后每窝随机选取1头仔猪，前腔静脉采血，肝素抗凝，3 000 r·min^–1离心10 min分离血浆，–20 ℃保存。

1.3 血浆生化参数和游离氨基酸的测定

样品于4 ℃解冻，用CX₄型全自动生化分析仪(Beckman公司)测定血浆中胆碱酯酶(Choline esterase, CHE)和肌酸激酶(Creatine kinase, CK)的活性以及总蛋白、白蛋白、血氨、尿素氮和葡萄糖的含量。酶活力单位(U)为在1 min内能转化1 μmol底物的酶量。所用生化试剂盒均购自北京利德曼公司。用L-8800型全自动氨基酸分析仪(日立公司)测定血浆中游离氨基酸的含量。

1.4 数据处理

采用SPSS19.0软件对不同处理组的数据进行单因素方差分析，用Duncan’s法进行多重比较，数据结果以平均值±标准误表示。

2. 结果与分析

2.1 不同日龄哺乳环江香猪生长性能的变化

由表2可知，脯氨酸组仔猪初生体质量和7日龄体质量均高于等氮对照组，但差异不显著(P>0.05)，14日龄体质量显著高于等氮对照组和DFMO组(P<0.05)。

表 2 不同日龄哺乳环江香猪的生长性能¹⁾

Table 2. The growth performance of suckling Huanjiang mini-pig at different day-age

处理	产仔数	初生体质量/g	7 日龄体质量/g	14 日龄体质量/g
等氮对照组	7.0±0.7	458.8±19.1	1 044.0±97.7	1 613.8±185.3b
脯氨酸组	6.4±0.7	514.6±51.0	1 169.3±139.0	2 357.4±86.4a
DFMO组	8.2±0.3	410.6±24.5	1 180.0±87.1	1 500.2±64.1b
1)同列数据后凡是有一个相同小写字母或未标记字母者，表示差异不显著(n=5，P>0.05，Duncan’s 法)

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2.2 不同日龄哺乳环江香猪血浆生化参数的变化

由表3可知，7日龄时，脯氨酸组和DFMO组血氨浓度显著低于等氮对照组；14日龄时，脯氨酸组血氨浓度和CHE活性显著高于DFMO组，CK活性显著低于DFMO组，葡萄糖浓度显著高于等氮对照组，其他血浆酶活性和代谢物浓度各处理组间均无显著差异。

表 3 不同日龄哺乳环江香猪的血浆生化参数¹⁾

Table 3. Plasma biochemical parameters of suckling Huanjiang mini-pig at different day-age

日龄	处理	胆碱酯酶/ (U·dL^–1)	肌酸激酶/ (U·dL^–1)	总蛋白/ (g·L^–1)	白蛋白/ (g·L^–1)	血氨/ (μmol·L^–1)	尿素氮/ (mmol·L^–1)	葡萄糖/ (mmol·L^–1)
7	等氮对照组	6.11±0.53	19.51±5.49	60.90±1.75	27.40±0.91	118.05±20.05a	7.02±1.33	8.24±1.18
	脯氨酸组	5.78±0.65	21.06±2.75	64.45±4.58	30.00±1.68	67.85±5.55b	8.02±1.40	6.40±0.65
	DFMO组	5.61±0.48	15.08±2.03	54.83±5.13	28.90±1.78	75.45±8.90b	9.75±1.26	9.35±1.52
14	等氮对照组	5.71±0.32ab	17.19±3.53ab	63.63±3.01	32.40±1.05	85.70±21.18ab	7.94±2.07	7.18±0.23b
	脯氨酸组	6.29±0.36a	11.29±1.79b	59.36±1.71	32.64±0.57	117.00±16.74a	6.79±0.57	9.02±0.58a
	DFMO组	5.25±0.25b	22.41±4.07a	60.00±2.21	32.75±1.04	52.88±14.29b	7.08±1.47	8.21±0.15ab
1)同列数据后凡是有一个相同小写字母或未标记字母者，表示差异不显著(n=5，P>0.05，Duncan’s 法)

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2.3 不同日龄哺乳环江香猪血浆精氨酸家族氨基酸浓度的变化

由表4可知，14日龄时，脯氨酸组血浆脯氨酸浓度显著高于等氮对照组；DFMO组血浆鸟氨酸浓度显著高于等氮对照组；脯氨酸组和DFMO组血浆精氨酸浓度显著高于等氮对照组；等氮对照组和脯氨酸组血浆天冬酰胺浓度显著低于DFMO组。其他指标各处理组间差异均不显著。

表 4 不同日龄哺乳环江香猪血浆精氨酸家族氨基酸的浓度¹⁾

Table 4. The concentrations of arginine-family amino acids in plasma of suckling Huanjiang mini-pig at different day-age

c/(μmol·mL^–1)
日龄	处理	天冬氨酸	天冬酰胺	谷氨酸	谷氨酰胺	精氨酸	脯氨酸	鸟氨酸	瓜氨酸
7	等氮对照组	0.027±0.004	0.096±0.028	0.214±0.101	0.887±0.431	0.099±0.032	0.737±0.262	0.083±0.035	0.064±0.024
	脯氨酸组	0.028±0.005	0.060±0.018	0.219±0.041	0.607±0.386	0.101±0.011	0.718±0.167	0.080±0.012	0.076±0.021
	DFMO组	0.020±0.002	0.095±0.017	0.215±0.019	0.626±0.384	0.091±0.026	0.845±0.313	0.084±0.016	0.132±0.030
14	等氮对照组	0.022±0.009	0.037±0.001b	0.196±0.086	0.450±0.217	0.060±0.015b	0.896±0.136b	0.047±0.013b	0.051±0.015
	脯氨酸组	0.021±0.003	0.042±0.006b	0.215±0.028	0.309±0.027	0.110±0.021a	1.285±0.142a	0.083±0.013ab	0.098±0.032
	DFMO组	0.022±0.007	0.062±0.014a	0.254±0.072	0.407±0.077	0.110±0.012a	1.074±0.198ab	0.106±0.024a	0.102±0.027
1)同列数据后凡是有一个相同小写字母或未标记字母者，表示差异不显著(n=5，P>0.05，Duncan’s 法)

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3. 讨论与结论

随着胎猪的生长发育，有限的子宫空间进一步压缩，胎儿在相对紧凑的空间和营养不足的环境中竞争空间和养分，必然会影响其生长发育^[13]。本试验中，脯氨酸组仔猪初生体质量比等氮对照组升高12.16%，但产仔数降低8.57%；DFMO组哺乳仔猪初生体质量比等氮对照组和脯氨酸组分别降低10.48%和20.32%，但产仔数分别提高18.57%和29.68%；脯氨酸组14日龄哺乳仔猪体质量显著高于等氮对照组和DFMO组。这可能是因为脯氨酸的代谢产物多胺促进了胎儿和仔猪的肠道发育^[14]，从而提高了肠道对营养物质的消化吸收，促进了胎儿的生长发育^[15]。有研究表明，脯氨酸可提高母猪繁殖性能、促进胎儿的代谢及生长发育^[9-10]。例如，在妊娠11~30 d添加脯氨酸可增加1~2胎次母猪的繁殖性能；给哺乳仔猪口服脯氨酸可提高其生长性能、促进小肠粘膜发育^[16]。上述结果说明，妊娠期和哺乳期补充脯氨酸均能促进胎儿和/或仔猪的生长发育^[17]。DFMO组胎猪在营养相对不足条件下，胎儿的生长发育相对缓慢，对子宫空间的竞争也相对缓和。也就是说产仔数增加会造成宫内拥挤，从而降低仔猪出生质量^[18]。而较低的初生体质量可能会影响其出生后的生长发育，增加其死亡率和发病率，从而降低其断奶后的存活率^[19]。

CHE是一类糖蛋白酶，可催化酰基胆碱的水解。体质量增加可引起血清CHE水平的增加^[20]。本试验中，脯氨酸组14日龄仔猪血浆CHE活性和体质量均显著高于DFMO组，提示母猪饲粮添加脯氨酸可调节哺乳仔猪的脂代谢从而促进其生长发育。CK主要存在于心肌和骨骼肌中，其主要的生物学功能是可逆地催化肌酸和ATP之间的转磷酰基反应，为肌肉收缩以及转运系统提供能量^[21]。血浆CK活性的升高一般提示存在肌肉损伤或应激反应。本试验中，脯氨酸组仔猪血浆CK活性显著低于DFMO组，说明母猪饲粮添加脯氨酸可减少哺乳仔猪的应激反应，这有利于仔猪的生长发育。

血浆代谢物来源于机体消化吸收的营养物质和组织器官的代谢产物，可用来反映机体的新陈代谢和内脏器官的健康状况。血氨主要是由体内氨基酸的脱氨基作用产生，或消化道细菌代谢产生，对动物机体有一定的毒性。正常情况下，肝脏能将氨转化为尿素，再由肾脏排出体外^[22]。本试验中，7日龄时脯氨酸组和DFMO组仔猪血氨浓度比等氮对照组分别显著降低42.52%和36.09%，14日龄时脯氨酸组比DFMO组显著升高了121.26%，提示饲粮添加脯氨酸可能影响了氨基酸的脱氨基作用或尿素合成作用，但具体机制还不清楚。葡萄糖是机体新陈代谢不可缺少的重要能量来源。乳糖在仔猪消化道内被水解为葡萄糖，而肠道吸收是血液中葡萄糖的主要来源。精氨酸可通过其代谢产物NO调控葡萄糖代谢^[23]。多胺可影响机体的氨基酸和葡萄糖代谢^[24]。本试验中，脯氨酸组14日龄仔猪血浆葡萄糖浓度分别比等氮对照组和DFMO组显著升高25.62%和9.86%，可能是由于精氨酸和脯氨酸的代谢引起的，这可减少机体内蛋白质的分解，有助于提高机体的免疫力和抗逆能力，促进仔猪的生长发育^[2]。

由于母猪乳腺细胞中富含精氨酸酶，乳腺中的精氨酸被大量分解代谢^[25]。内源合成是支持机体和肠道生长发育所需精氨酸的重要途径^[26]。因此，精氨酸缺乏是影响仔猪生长发育的主要因素之一。本试验中，脯氨酸组14日龄哺乳仔猪血浆精氨酸和脯氨酸浓度分别比等氮对照组显著升高83.33%和43.42%，主要是由于饲粮添加的脯氨酸可在初生仔猪小肠内转化为精氨酸，这对改善仔猪的肠道发育和促进生长具有重要作用^[6]。天冬酰胺在机体内可通过一系列脱氨基和转氨基途径生成精氨酸^[27]。本试验发现，DFMO组14日龄哺乳仔猪血浆精氨酸、鸟氨酸和天冬酰胺浓度比等氮对照组分别显著升高83.33%、125.53%和67.57%，天冬酰胺浓度比脯氨酸组显著升高13.51%，这可能是由于DFMO抑制了脯氨酸的多胺合成途径，而增强了脯氨酸转化为精氨酸家族其他氨基酸的途径。哺乳仔猪血浆生化参数和氨基酸浓度发生不同程度的变化，可能是由于母猪饲粮添加脯氨酸或DFMO后影响了母乳成分，进而改变了仔猪的机体代谢^[6]，其具体原因尚需进一步研究。

综上所述，母猪饲粮添加脯氨酸能通过影响哺乳仔猪葡萄糖和氨基酸代谢而促进其生长发育。

图 1 基于S5片段核苷酸序列构建的系统关系树

Figure 1. Relationship dendrogram of SRBSDV-Anhui-HN2 and other isolates of Fijivirus based on S5 segment sequences

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图 2 重组质粒pET-S5-2的酶切电泳图谱

M：DNA marker DL2000；1：BamH I和Sal I双酶切pET-S5-2；2：BamH I单酶切pET-S5-2；3：Sal I单酶切pET-S5-2；4：重组质粒pET-S5-2。

Figure 2. Electrophoresis pattern of recombinant plasmid pET-S5-2 digested with restriction enzyme

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图 3 融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析

M：分子质量蛋白Marker；1：pET-GST空载体未诱导；2：pET-GST空载体诱导；3：pET-S5-2未诱导；4：pET-S5-2诱导；5：纯化的融合蛋白。

Figure 3. SDS-PAGE and Western blot analysis of fusion protein

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表 1 SRBSDV-Anhui-HN2 S5片段与16个斐济病毒属其他分离物S5片段核苷酸序列的相似性

Table 1 Nucleotide sequence similarity between S5 segment of SRBSDV-Anhui-HN2 and S5 segments of 16 other isolates of Fijivirus

分离物	GenBank登录号	来源地	相似性/%
SRBSDV-Anhui-HN2	HF954999	中国安徽	100.0
SRBSDV-VNM	JQ692576	越南	99.7
SRBSDV-HuNyy	JQ034352	中国湖南	99.5
SRBSDV-Hubei	HM585275	中国湖北	99.4
SRBSDV-YN-MShi	JQ773424	中国云南	99.2
SRBSDV-HN	FN563993	中国海南	99.0
RBSDV-HB	KC134293	中国河北	71.3
RBSDV-JS	KM921677	中国江苏	71.1
RBSDV-SDZZ10	JX421768	中国山东	70.2
RBSDV-MX8	HF954989	中国安徽	70.2
RBSDV-Anhui-LJ	HF955009	中国安徽	70.2
RBSDV-WZ	KC801047	中国浙江	70.1
RBSDV-LH	KC801046	中国浙江	70.0
RBSDV-Korean	HQ670667	韩国	69.9
FDV-AUS	NC_007160	澳大利亚	49.9
MRCV-Arg	AY607587	阿根廷	64.1
NLRV-TSU	D49697	古巴	38.0

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参考文献(24)

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