Comparison of different methods to construct core collections of Momordica charantia
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摘要:目的
通过比较不同方法构建的苦瓜Momordica charantia核心种质资源的优劣，选择能代表原群体遗传多样性的核心种质，为苦瓜种质资源的高效利用提供依据。
方法采用混合线性模型对154份苦瓜种质的第1雌花节位、瓜纵径、瓜橫径、瓜肉厚和单瓜质量等5个性状的基因型值进行无偏预测；基于性状的基因型预测值，采用马氏距离计算苦瓜种质间的遗传距离；通过8种聚类方法和3种抽样方法，按照30%的抽样率构建苦瓜核心种质资源，评价不同聚类方法和抽样方法构建苦瓜核心种质的优劣。
结果8种聚类方法构建的核心种质所有5个性状的变异系数均高于原群体；最短距离法构建的苦瓜核心种质5个性状的方差和变异系数均高于原群体，明显优于其他7种聚类方法。优先抽样法和偏离度抽样法构建的核心种质的极差与原群体一致，但偏离度抽样法构建的苦瓜核心种质有3个性状的变异系数高于其他2种抽样法，表明偏离度抽样法略优于随机抽样法和优先抽样法；基于马氏距离、偏离度抽样法及最短距离法获得了46份苦瓜核心种质，其中，Y5、Y87、Y112和Y139为苦瓜骨干材料。
结论基于马氏距离、偏离度抽样法及最短距离法获取的46份苦瓜核心资源能够代表原群体的遗传多样性。本研究进一步证实了来源于印度及东南亚地区的苦瓜种质具有丰富的遗传多样性，为苦瓜种质资源的收集、评价与高效利用提供了重要依据。
Abstract:ObjectiveTo construct core collections of bitter gourd (Momordica charantia) which can represent the genetic diversity of the initial population by comparing different construction methods, and facilitate the efficient utilization of bitter gourd germplasm.
MethodWe sampled 154 bitter gourd germplasm as materials, predicted the genotypic values of five traits (node bearing first female flower, fruit length, fruit width, flesh thickness and mass per fruit) without bias using mixed linear model analysis, calculated the genetic distances among bitter gourd germplasm based on genotypic values of all five traits using Mahalanobis distance, and constructed core collections with 30% sampling proportion by using eight different clustering methods and three different sampling strategies. The quality of core collections constructed using different clustering methods and sampling strategies were evaluated.
ResultThe variation coefficients of all five traits of the core collections constructed with eight clustering methods were larger than those of the initial population. Single linkage was better compared to the other seven clustering methods by significantly increasing the variances and coefficients of variation for all five traits. The ranges of core collections constructed with preferred sampling and deviation sampling were consistent with those of the initial population. The variation coefficients of three traits of the core collection from deviation sampling were larger compared to the other two sampling methods, indicating that deviation sampling was slightly better than random sampling and preferred sampling. Forty six core collections of bitter gourd were obtained based on Mahalanobis distance, deviation sampling and single linkage. Among them, Y5, Y87, Y112 and Y139 were the backbone materials.
ConclusionThe 46 core collections of bitter gourd, which were obtained based on Mahalanobis distance, deviation sampling and single linkage, can well represent the genetic diversity of the initial population. This study further provides evidence for high genetic diversity in the bitter gourd germplasm from India and Southeast Asian. Our results provide an important theoretical basis for the collection, evaluation and efficient utilization of bitter gourd genetic resources.
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Keywords:
- Momordica charantia /
- core collection /
- genotypic value /
- sampling strategy /
- clustering method
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采矿活动产生了大量的矿山废弃地，其废水的排放导致土壤酸度增加，有机质含量下降，破坏了中国多个地区的生态环境[1-2]。前期研究报道，很多农作物受到采矿活动的影响，导致产量逐年降低[3]，因此，急需修复被矿山严重破坏土地的生态功能[4]。近年来，已有研究指出化学肥料与硅酸钠或蚯蚓的结合施用可以有效地保持土壤生产力和降低不良环境对植物的危害[5-6]。然而，关于这些外源添加物是否对土壤细菌群落结构造成影响的分析却少有报道[2]。
土壤微生物不仅能够通过促进养分吸收和转化(如碳汇集、氮固定)、分泌多种化学物质(如有机酸、氨基酸)等提高植物对胁迫环境的抵抗能力，还能通过降解多种污染物进行土壤修复[3,7-9]。例如，丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)可以显著提高大豆对Gu的吸收，从而减轻因矿区开发造成土壤Gu过量的危害[10-11]。还有研究表明，根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)不仅可以改善植物生理状况，还可以与植物协同修复石油污染的土壤[12]。总的来说，植物是土壤修复的主体部分，当植物不能有效地富集污染物时，可以直接利用土壤微生物对污染物进行分解，改善植物生长环境和土壤营养状况，从而为接下来的植物–微生物协同修复土壤做好准备[9]。因此，土壤修复很大程度上依赖于土壤微生物，并且土壤微生物也已经被认为是评估土壤质量的重要指标之一[13]。
化学肥料、硅酸钠和蚯蚓作为非生物和生物肥料对采矿活动破坏过的土壤具有一定的改良作用[14-16]。一些研究已经表明化学肥料和蚯蚓对土壤微生物群落的影响，然而，关于硅酸钠对土壤中微生物群落结构所产生的影响的研究却很少报道[17-18]。施用化学肥料可以增加土壤中有机质的含量，为微生物的生长提供能源，促进土壤微生物的代谢功能[19]。蚯蚓能够调节土壤pH，从而间接影响土壤微生物群落结构[20-22]。前人研究表明，大豆是改良土壤质量的先锋作物，是矿区土地修复与生态重建的重要物种之一[23-25]。然而，化学肥料与硅酸钠结合施用和化学肥料与蚯蚓结合施用对大豆根际细菌群落产生的影响，尤其是在废弃矿区条件下的影响鲜见报道。
本研究通过16S rRNA高通量测序技术，对施用化学肥料结合硅酸钠或蚯蚓的废弃矿区土壤的根际细菌群落进行比较分析。从细菌多样性、群落结构及其与土壤化学性质的相互关系等方面评估废弃矿区大豆根际土壤微生物对施肥制度的响应特征。以期为矿区土壤修复提供理论依据和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 试验地点和试验设计
试验区位于广东省梅州市平远县仁居镇黄畲村(117°98′N，24°57′E)西北部的稀土矿山。该地区的年平均气温为21.2 ℃，年平均降水量为1 383 mm，属亚热带季风气候区。此矿山至今已废弃20多年，之前的采矿活动造成了矿区及周边农田的土壤重金属镉(Cd)污染严重、土壤有机碳含量低和强烈酸化，矿区生态环境破坏问题严重。
试验区于2016年春季在废弃矿区建立，在此之前除生长稀疏的野草外，无其他植被种植。大豆种植共设置25垄，每垄高0.5 m、长24 m，垄间距0.8 m，厢面宽1.0 m。每个区组的田地尺寸为2 m×5 m，以随机区组设计排列，并由0.5 m缓冲区分开，种植密度为30 m×15 cm(行距×种植距离)。肥料选取由尿素(217 mg·kg−1)、过磷酸钙(219 mg·kg−1 P2O5)和氯化钾(86 mg·kg−1 K2O)组成的氮磷钾(NPK)无机肥，并配施硅酸钠或蚯蚓。大豆品种为‘华春9号’。于2016年5月上旬种植大豆的同时施加肥料，其中无机肥为(4.8±0.05) kg·m−2，硅酸钠为0.2 kg·m−2，蚯蚓为20条·m−2，试验过程中只施加1次肥料。在施肥后3和5个月时对大豆根际土壤进行采样。本研究设置4个施肥处理，每个处理3个重复：NPK肥结合硅酸钠(3NPK+S和5NPK+S)、NPK肥结合蚯蚓20条·m−2(每条蚯蚓鲜质量为0.55~0.75 g，在试验中每个处理分为单独的1个小区，小区间设置50 cm的隔离，试验后期的观察发现只有小部分蚯蚓逃离试验区，对总体试验影响微小)(3NPK+E和5NPK+E)，以不施肥的大豆根际土壤为对照(3CK和5CK)，各处理编号中的3和5分别代表采样时间为施肥后3和5个月。
1.2 根际土壤采样
试验地于2015年11月进行整地，2016年5月上旬种植大豆，分别在2016年8月和2016年10月进行土壤采样。每垄选取3个地点，采样时选择大小一致的大豆植株通过抖根法在大豆根部采集土样，将其收集在已灭菌的2 mL离心管中，随即放入液氮中冷冻，带回实验室后一部分储存在−80 ℃进行DNA提取。另一部分储存在4 ℃用于测定土壤化学性质。
1.3 土壤化学性质测定
采用pH计测定土壤悬浮液(水︰土质量比为5︰1)pH[26]。土壤有机质采用重铬酸钾–外加热法测定，土壤全碳和全氮通过德国的元素分析仪测定，全钾通过原子吸收分光光度计测定。碱解氮采用扩散法测定，速效钾采用火焰光度法测定，有效磷采用钼蓝法测定。全磷、铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3−-N)通过荷兰的连续流动分析仪测定。全镉采用湿式消化法测定，速效镉采用原子吸收光谱法测定[25]。供试土壤未种植大豆前的初始化学性质：pH 4.87、有机质、全碳、全氮、全磷和全钾质量分数分别为0.59、3.65、0.05、0.04和50.62 g·kg−1，碱解氮、有效磷、速效钾、全镉、速效镉、铵态氮和硝态氮质量分数分别为18.25、4.87、29.86、0.25、0.02、29.53和1.82 mg·kg−1。
1.4 DNA提取和PCR扩增
利用Fast kit DNA试剂盒提取根际土壤总DNA，提取的DNA在去离子水中稀释，并储存于−20 ℃冰箱中保存备用。使用具有12nt barcode引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增16S rRNA基因的V3-V4高变区[27]。PCR反应体系包括10 μL SYBR Premix Ex TaqTM、1.0 μL正向和1.0 μL反向引物、7.0 μL无菌水、1.0 μL模板DNA。PCR扩增体系：95 ℃变性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，28个循环；72 ℃10 min[28]。
1.5 数据分析
通过MiSeq测序平台测序后，使用QIIME1 Pipeline V1.9.0处理和分析原始序列。剔除低质量序列，然后将高质量序列聚类到操作分类单元(OTU)中。在QIIME1中计算根际细菌Alpha–多样性(Chao1和Shannon指数)。基于Bray-Curtis距离矩阵进行主坐标分析(PCoA)用于表现不同处理之间细菌群落组成的相似性或相异性[29]。采用非参数多元方差分析(Adonis)计算细菌群落结构的差异。Manteltest分析和典型关联分析(Canonical correlation analysis，CCA)用于评估细菌群落结构和土壤化学性质之间的相关性。采用t检验(Student’ s t test)对相对丰度在前50的属进行差异性分析。方差分析(ANOVA)中的Duncan’s法用来确定所有组间的显著性差异。Venn分析用于统计不同处理样本中所共有和独有的细菌属的数量。其中优势菌门和优势菌属分别选取所有土壤样品中相对丰度最高的5个门和5个属。
2. 结果与分析
2.1 根际土壤化学性质
由表1可知，相比于对照3CK，3NPK+S和3NPK+E处理均显著增加大豆根际土壤有机质、全碳、全氮、全磷、铵态氮和有效磷的含量，显著降低全钾和全镉含量；而在3NPK+E处理下的全碳含量显著高于3NPK+S处理，有效磷和速效镉含量显著低于3NPK+S处理。相比于对照5CK，5NPK+S和5NPK+E处理均会显著增加有机质、全碳、全氮、碱解氮和有效磷的含量；在5NPK+E处理下的有机质和全碳含量显著高于5NPK+S处理，有效磷和速效钾含量显著低于5NPK+S处理。总的来说，NPK+S和NPK+E处理显著增加了有机质、全碳、全氮和有效磷的含量。
表 1 根际土壤化学性质1)Table 1. Chemical properties of rhizosphere soil处理
Treatment取样时间/月
Sampling timepH w/(g·kg−1) C︰N质量比
C︰N mass ratioSOM TC TN TP TK 3CK 3 5.60±0.20a 0.67±0.12b 4.44±0.34c 0.05±0.01b 0.04±0.01b 60.43±0.84a 85.22±14.23a 3NPK+S 3 4.75±0.04b 4.00±0.89a 7.45±0.95b 0.16±0.04a 0.08±0.02a 41.11±6.62b 47.11±6.90b 3NPK+E 3 4.74±0.20b 3.75±0.58a 11.56±0.56a 0.20±0.02a 0.07±0.02a 47.77±5.34b 57.41±8.71b 5CK 5 5.40±0.35a 0.70±0.10c 5.77±0.74c 0.05±0.01b 0.07±0.05a 60.43±0.84a 114.25±16.67a 5NPK+S 5 4.71±0.21b 3.52±1.04b 10.62±1.50b 0.69±0.16a 0.07±0.02a 41.11±6.62b 15.87±3.80b 5NPK+E 5 5.67±0.21a 5.78±0.30a 15.98±0.57a 0.48±0.16a 0.12±0.02a 50.08±8.12ab 36.35±14.97b 处理
Treatment取样时间/月
Sampling timew/(mg·kg−1) AN AP AK TCd ACd NH4+-N NO3−-N 3CK 3 16.74±1.33b 4.37±0.21c 32.33±1.00a 0.14±0.02a 0.02±0.00a 31.35±1.43b 1.94±0.26b 3NPK+S 3 19.72±1.89ab 10.2±1.13a 34.38±1.48a 0.08±0.01b 0.02±0.00a 36.06±0.66a 2.91±0.29a 3NPK+E 3 20.77±1.44a 7.77±0.03b 32.55±0.70a 0.06±0.00b 0.01±0.00b 37.76±0.41a 2.59±0.51ab 5CK 5 16.07±0.36b 5.10±0.26c 34.99±1.53b 0.09±0.01a 0.01±0.00a 34.99±4.51b 3.02±0.63a 5NPK+S 5 35.07±1.61a 13.99±2.08a 54.96±9.02a 0.05±0.02a 0.01±0.01a 41.65±2.89a 4.39±1.06a 5NPK+E 5 30.63±5.16a 9.43±0.84b 31.75±9.14b 0.06±0.02a 0.01±0.00a 37.73±1.50ab 2.84±0.87a 1)同列数据后的不同小写字母表示相同取样时间的处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法);SOM：土壤有机质，TC：全碳，TN：全氮，TP：全磷，TK：全钾，AN：碱解氮，AP：有效磷，AK：速效钾，TCd：全镉，ACd：速效镉，NH4+-N：铵态氮，NO3−-N：硝态氮
1) Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments of the same sampling time (P< 0.05, Duncan’s method); SOM: Soil organic matter, TC：Total carbon, TN: Total nitrogen, TP: Total phosphorus, TK: Total potassium, AN: Alkaline nitrogen, AP: Available phosphorus, AK: Available potassium, TCd: Total cadmium, ACd: Available cadmium, NH4+-N: Ammonium nitrogen, NO3−-N: Nitrate nitrogen2.2 根际土壤细菌多样性
由表2可知，在施肥3个月的土壤样品中，Shannon指数为：3NPK+E>3NPK+S>3CK (P< 0.05)；相比于对照3CK，3NPK+E处理的Chao1指数显著更高。5NPK+S处理下根际土壤的Chao1和Shannon指数在所有处理中最大，并且其Shannon指数显著大于5NPK+E处理下的该指数。
表 2 根际土壤样品的细菌群落多样性指数1)Table 2. Indexes of bacterial community diversity in rhizosphere soil samples处理
Treatment取样时间/月
Sampling timeChao1指数
Chao1 richness estimatorShannon指数
Shannon diversity index3CK 3 2 208.78±87.56b 5.63±0.04c 3NPK+S 3 2 429.35±324.20b 6.03±0.14b 3NPK+E 3 3 051.00±343.02a 6.43±0.20a 5CK 5 3 041.49±97.74a 6.45±0.11ab 5NPK+S 5 3 414.47±53.51a 6.68±0.06a 5NPK+E 5 3 099.13±354.25a 6.22±0.14b 1)同列数据后的不同小写字母表示相同取样时间处理间差异显著(P<0.05，Duncan’ s法)
1) Different lowercase letters within the same column indicate significant differences among different treatments of the same sampling time (P< 0.05, Duncan’ s method)2.3 根际土壤细菌群落结构
基于细菌在OTU水平的相对丰度，对细菌群落结构进行PCoA分析。结果显示，所有样品的根际土壤细菌群落被聚为6组，相同处理的根际细菌被聚在一起(图1A)。分别对施肥3和5个月的根际细菌进行PCoA分析发现，不同施肥方式的根际细菌群落组成显著分离(P < 0.01)( 图1B、1C)。3NPK+E与3NPK+S处理的根际细菌群落组成分离程度较小，而5NPK+E与5NPK+S处理的根际细菌群落组成分离程度较大(图1B、1C)。
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图 1 根际土壤细菌群落的主坐标分析Figure 1. Principal coordinate analyses of bacterial communities in rhizosphere soil2.4 根际土壤细菌群落在门水平上的相对丰度
采用16S rRNA测序技术对施肥3和5个月的大豆根际土壤样品分析，前者得到37门84纲190目389科788属1 639种以及4 715个OTU；后者得到36门83纲182目380科781属1 648种以及5 125个OTU。
对细菌门水平的相对丰度进行分析发现，前5个优势类群为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、酸杆菌门Acidobacteria和拟杆菌门Bacteroidetes。此外，螺旋体菌门Saccharibacteria、蓝藻门Cyanobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadetes、厚壁菌门Firmicutes和疣微菌门Verrucomicrobia等也能在所有土壤样品中被检测到(图2)。施肥5个月的土壤中，变形菌门在5CK的相对丰度显著更高，绿弯菌门在5NPK+S和5NPK+E处理下的相对丰度显著更高；而施肥3个月的土壤中只有绿弯菌门的相对丰度出现显著性差异(表3)。
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图 2 不同施肥处理下根际土壤细菌在门水平的相对丰度Figure 2. Relative abundance of rhizosphere soil bacteria at phylum level under different fertilization treatments表 3 不同施肥处理下根际土壤优势菌门的相对丰度1)Table 3. Relative abundance of rhizosphere soil dominant bacteria at phylum level under different fertilization treatments处理
Treatment取样时间/月
Sampling time相对丰度/%
Relative abundance变形菌门
Proteobacteria放线菌门
Actinobacteria绿弯菌门
Chloroflexi酸杆菌门
Acidobacteria拟杆菌门
Bacteroidetes3CK 3 52.74±1.40a 12.55±2.02a 4.76±0.87b 5.35±0.65a 7.82±1.28a 3NPK+S 3 42.70±10.53a 9.60±2.16a 17.58±7.72a 7.94±2.07a 5.21±2.27a 3NPK+E 3 43.18±4.49a 11.14±1.95a 13.32±3.71ab 7.28±4.38a 7.59±0.94a 5CK 5 47.06±0.58a 11.93±0.80a 8.08±1.26b 6.89±0.95a 5.71±0.42a 5NPK+S 5 40.64±2.27b 12.93±1.07a 13.67±0.66a 8.17±1.45a 5.11±0.40a 5NPK+E 5 39.70±2.27b 14.47±3.27a 13.01±0.79a 10.45±2.30a 4.46±0.58a 1)同列数据后的不同小写字母表示相同取样时间处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1) Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among different treatments of the same sampling time (P<0.05, Duncan’s method)2.5 根际土壤细菌群落在属水平上的相对丰度
属的差异性分析表明，在不同施肥方式下，施肥3和5个月的根际土壤所检测到的细菌中出现显著性差异的属分别有5个和6个(图3A、3B)。在3CK土壤样品中，戴氏菌属Dyella、Unclassified_f_Xanthomonadaceae、Rhizomicrobium、马西利亚菌属Massilia和鞘脂菌属Sphingobium的相对丰度显著高于3NPK+S和3NPK+E处理(图3A)。在施肥5个月的土壤样品中，5NPK+E处理下的根际土壤中细菌属的相对丰度显著高于其他处理的有Uncultured_f_Anaerolineaceae、Norank_o_Subgroup_6和Norank_f_SJA-28；而玫瑰弯菌属Roseiflexus、Norank_c_Cyanobacteria和Pseudolabrys的相对丰度在5NPK+S处理下显著高于5CK和5NPK+E处理(图3B)。不同施肥处理时间的土壤在NPK+S处理下进行比较，发现根际细菌中有Norank_o_JG30-KF-AS9、Norank_c_KD4-96、Norank_o_C0119、Norank_FFCH7168、链霉菌属Streptomyces和Rhizomicrobium共6个属的相对丰度在5NPK+S处理时显著高于3NPK+S处理(图3C)；而在NPK+E处理下，根际细菌中有鞘脂单胞菌属Sphingomonas、芽单胞菌属Gemmatimonas、Ramlibacter和单胞菌属Arenimonas共4个属的相对丰度在3NPK+E处理时显著高于5NPK+E处理，只有Uncultured_f_Nitrosomonadaceae的相对丰度在5NPK+E处理时显著高于3NPK+E处理(图3D)。
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图 3 不同施肥处理下根际土壤细菌属水平的相对丰度差异性分析Figure 3. Relative abundance of rhizosphere soil bacteria at genus level under different fertilization treatments从属的相对丰度来看，Uncultured_f_Anaerolineaceae是3NPK+S、3NPK+E、5NPK+S、5NPK+E处理土壤中的优势菌属，相对丰度分别为10.49%、7.46%、3.65%和6.22%(表4)。通过Venn分析4个处理组(3NPK+S、3NPK+E、5NPK+S、5NPK+E)根际土壤样本中所共有和独有的细菌属的数量，结果表明，3NPK+S和3NPK+E处理的根际土壤细菌所特有的属分别为26和19个，5NPK+S和5NPK+E处理的根际土壤细菌所特有的属分别为27和17个(图4)。
表 4 不同施肥处理下根际土壤优势菌属的相对丰度1)Table 4. Relative abundance of rhizosphere soil dominant bacteria at genus level under different fertilization treatments处理
Treatment取样时间/月
Sampling time相对丰度/% Relative abundance Uncultured_f_Anaerolineaceae Norank_p_Saccharibacteria 慢生根瘤菌属
Bradyrhizobium鞘氨醇单胞菌属
Sphingomonas伯克氏菌属
Burkholderia3CK 3 1.43±0.86b 7.41±1.57a 1.07±0.12a 1.46±0.12a 6.36±2.23a 3NPK+S 3 10.49±4.80a 2.47±0.69b 1.38±1.23a 1.55±0.73a 0.51±0.54b 3NPK+E 3 7.46±2.80ab 5.34±2.38ab 1.26±0.26a 2.45±0.49a 1.41±1.11b 5CK 5 2.75±0.79b 2.56±0.27a 2.87±0.52a 2.28±0.39ab 1.16±0.10a 5NPK+S 5 3.65±0.66b 2.08±0.36a 2.37±0.28a 2.45±0.14a 1.00±0.33a 5NPK+E 5 6.22±2.11a 2.27±0.20a 3.22±2.10a 1.52±0.30b 0.40±0.13b 1)同列数据后的不同小写字母表示相同取样时间处理间差异显著(P<0.05，Duncan’ s法)
1) Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among different treatments of the same sampling time (P< 0.05, Duncan’ s method)![]()
图 4 不同施肥处理下根际土壤细菌在属水平的Venn分析Figure 4. Venn analysis of rhizosphere soil bacteria at genus level under different fertilization treatments2.6 根际细菌群落与土壤化学性质的关联性分析
基于Mantel检验和CCA分析的结果表明，根际细菌群落随着施肥方式和处理时间的不同而沿CCA1轴和CCA2轴分布。在所有被测化学性质中，与CCA1轴呈正相关的主要有有机质(R = 0.432 3， P = 0.002)，呈负相关的有全钾(R = 0.358 8，P = 0.002)；与CCA2轴呈正相关的主要有速效镉(R = 0.366 7， P = 0.003)。有机质、全碳、全钾、有效磷、全镉和速效镉对废弃矿区大豆根际土壤细菌群落结构影响较显著。5NPK+E处理的细菌群落主要集中在第4象限，有机质、有效磷和全碳均对其有显著的正向影响(图5)。
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图 5 基于CCA分析的根际细菌群落与土壤化学性质之间的关系SOM：土壤有机质，TC：全碳，TN：全氮，C︰N：碳氮质量比，TP：全磷，TK：全钾，AN：碱解氮，AP：有效磷，AK：速效钾，TCd：全镉，ACd：速效镉，NH4+-N：铵态氮，NO3--N：硝态氮；“*”和“**”分别表示差异达0.05和0.01显著水平(Mantel检验)Figure 5. Correlation between rhizosphere bacterial community and soil chemical property based on CCA analysisSOM: Soil organic matter, TC: Total carbon, TN: Total nitrogen, C︰N: C︰N mass ratio, TP: Total phosphorus, TK: Total potassium, AN: Alkaline nitrogen, AP: Available phosphorus, AK: Available potassium, TCd: Total cadmium, ACd: Available cadmium, NH4+-N: Ammonium nitrogen, NO3--N: Nitrate nitrogen; “*” and “**” indicated significant differences at 0.05 and 0.01 levels respectively (Mantel test)3. 讨论与结论
3.1 施肥方式和处理时间对根际土壤细菌多样性的影响
随着采矿活动大量增加，较高的土壤微生物多样性对矿区农业生产至关重要[30]。本研究结果表明，施肥方式和处理时间均对废弃矿区大豆根际土壤细菌多样性影响显著。细菌Alpha–多样性Chao1指数在3NPK+E处理中显著大于3CK处理，而Shannon指数在3NPK+E处理中显著大于3NPK+S和3CK处理，说明施肥时间较短的情况下NPK+E施用更加有利于细菌多样性的增加，这可能是由于蚯蚓在土壤中的分泌和排泄等行为能够提高微生物活性和数量[31]的缘故。在5NPK+S处理下，土壤的Chao1和Shannon指数均大于3NPK+S。有文献表明细菌多样性会随着时间而发生变化[32]。其原因可能是随着时间的推移，硅酸根与重金属形成不易被植物吸收的复合物，降低了重金属毒害，改善了土壤环境并间接有效地提高了微生物的多样性[33-35]，并且施加硅酸盐的土壤中有较高的Alpha–多样性[36]。之前的研究表明，微生物群落多样性是反映土壤质量的一个重要生物学指标，对土壤健康具有重要作用[37]。总的来说，NPK+E和NPK+S处理分别有利于在短期内和长期提高细菌多样性，因此不论是NPK+E还是NPK+S施肥处理都能够间接对土壤修复起促进作用。
3.2 施肥方式和处理时间对根际土壤细菌群落结构的影响
不同施肥方式和处理时间不仅对根际细菌群落的Alpha–多样性有显著影响，也对根际细菌群落结构(Beta–多样性)有显著影响。基于PCoA结果发现，在2个施肥处理时间下，随着施肥方式的不同，细菌群落分别沿PC1轴呈现出显著分离，说明细菌群落结构对不同施肥方式的响应不同。这些发现与多个研究的结果类似，即添加化学肥料、硅酸钠和蚯蚓均会改变土壤微生物群落结构[36,38-39]。所有土壤样本根据施肥处理时间沿PC2轴被显著分离成2组，说明细菌群落发生了变化。这与以前的研究结果类似，即施肥处理时间的长短对微生物群落结构具有较大的影响[40]。
本研究发现在不同施肥方式下，施肥5个月的根际土壤细菌中相对丰度出现显著性差异的门有变形菌门和绿弯菌门；而施肥3个月时，只有绿弯菌门相对丰度出现显著性差异。推测可能是对比于施肥方式，施肥处理时间对细菌优势门组成的影响较大，并且土壤中不同肥料的施入会随着时间延长而对细菌群落组成影响逐渐增大。在属水平上，Uncultured_f_Anaerolineaceae是3NPK+S、3NPK+E、5NPK+S和5NPK+E处理土壤中的优势菌属，并且在5NPK+E处理下的土壤中富集。前人的研究证实Anaerolineaceae在烷烃的降解过程中起着至关重要的作用，对土壤污染具有很好的微生物修复潜力[41-42]。Anaerolineaceae还被发现可能是促使碳转化为土壤有机碳的主要因素，这不仅会间接影响细菌群落组成，也有利于植物吸收营养[43]。本研究表明，5NPK+E处理下的根际土壤中有机质含量在所有处理中最高，这对于Anaerolineaceae可能促使碳转化提供了更有利的证据。同时，在5NPK+E处理下，蚯蚓存在于土壤中的时间越长，产生的蚯蚓粪越多，这类粪肥是植物养分的有效来源[44]。
3.3 施肥方式和处理时间对根际细菌群落与土壤化学性质相互关系的影响
环境因子对根际土壤细菌群落结构和组成有重要影响[45]。本研究中，分别在不同时间段，施加不同肥料都会显著增加有机质、有效磷和全碳的含量，并且对5NPK+E处理的细菌群落具有正向作用。该结果与一些研究[46-48]部分一致，其原因可解释为硅酸钠的添加提高了土壤有效磷含量，而蚯蚓在土壤中活动时间延长，产生了更多的蚯蚓粪，从而会显著增加有机质含量[46-48]。总之，本研究结果表明，不同施肥方式和处理时间均会改变土壤环境条件，从而间接驱动细菌群落组成和结构的变化。
3.4 结论
本研究表明，施肥方式和处理时间对废弃矿区大豆根际土壤细菌群落的影响较为显著。NPK+S和NPK+E处理均能够有效地提高矿区土壤细菌多样性，从而间接对土壤修复起到促进作用。随着时间的延长，NPK+S处理对提高细菌多样性效果更好；而NPK+E处理在短期内能够有效地提高细菌多样性。综合来说，本研究的这2种施肥方式相结合更能够提高细菌多样性，从而有效修复土壤。相比于施肥后3个月，施肥后5个月的5NPK+E与5NPK+S处理的根际细菌群落分离程度更大，说明随着时间的延长施肥方式对细菌群落的影响越大。Uncultured_f_Anaerolineaceae在施肥处理下的土壤中富集，很可能在促使碳转化的过程中起着重要作用，并且具有修复土壤污染的潜力。NPK+E处理下产生的蚯蚓粪会增加有机质含量，对细菌群落有正向影响，也为植物提供更多的有效养分。综上所述，建议施肥结合硅酸盐的同时加入蚯蚓对土壤的修复效果会更好。
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表 1 苦瓜种质资源的来源
Table 1 The origin of bitter gourd germplasm
种质编号 来源 Y1~Y20 日本 Y21~Y25 中国山东 Y26~Y50 中国广东 Y51~Y58 中国江西 Y59~Y78 中国海南 Y79~Y93 泰国 Y94~Y103 中国云南 Y104~Y111 中国湖南 Y112~Y121 中国广西 Y122~Y139 中国福建 Y140~Y144 斯里兰卡 Y145~Y154 印度 
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表 2 苦瓜资源主要数量性状的变异情况
Table 2 Genetic variations of main quantitative traits in bitter gourd germplasm
性状 第1雌花节位 瓜纵径/cm 瓜横径/cm 瓜肉厚/cm 单瓜质量/kg 最小值 4 10.6 1.4 0.6 0.1 最大值 31 49.6 10.6 2.3 1.1 平均值 14 30.7 7.2 1.2 0.6 极差 27 39.0 9.2 1.7 1.0 标准差 4.1 6.6 1.2 0.2 0.2 变异系数 0.289 0.214 0.167 0.207 0.310
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表 3 不同聚类方法构建的苦瓜核心种质与原群体间遗传差异比较1)
Table 3 Comparisons of genetic variations between core collections constructed using eight clustering methods and the initial population of bitter gourd
性状 项目 原群体 核心种质 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 第1雌 平均值 13.66 13.78 14.33 14.07 13.80 14.41 14.15 14.22 13.93 花节位 方差 16.436 30.618** 30.402** 28.773** 29.183** 27.314* 28.799** 29.063** 29.129** 变异系数 0.297 0.401 0.385 0.381 0.391 0.363 0.379 0.379 0.387 瓜纵径/cm 平均值 30.69 29.69 29.83 29.70 28.76 30.01 30.00 30.18 30.15 方差 43.074 78.911** 74.871** 61.356 65.589* 68.444* 67.415* 70.856* 68.566* 变异系数 0.214 0.299 0.290 0.264 0.282 0.276 0.274 0.279 0.275 瓜横径/cm 平均值 7.23 7.27 7.19 7.23 7.11 7.29 7.27 7.13 7.17 方差 1.468 2.929** 2.648** 2.699** 2.685** 2.744** 2.544** 2.652** 2.604** 变异系数 0.168 0.235 0.226 0.227 0.230 0.227 0.220 0.228 0.225 瓜肉厚/cm 平均值 1.16 1.19 1.18 1.21 1.17 1.18 1.17 1.18 1.19 方差 0.058 0.109** 0.101** 0.091* 0.091* 0.096* 0.097* 0.100** 0.103** 变异系数 0.207 0.277 0.270 0.250 0.257 0.262 0.265 0.266 0.269 单瓜质量/kg 平均值 0.58 0.59 0.57 0.57 0.55 0.59 0.58 0.57 0.57 方差 0.034 0.068** 0.055* 0.056* 0.052* 0.054* 0.052* 0.058** 0.055* 变异系数 0.315 0.447 0.412 0.413 0.415 0.395 0.390 0.424 0.412 1）H1~H8分别表示基于最短距离法、最长距离法、中间距离法、重心法、类平均法、可变类平均法、可变法以及离差平方和法构建的核心种质；相同性状的核心种质与原群体的均值差异均不显著（P>0.05, t检验）；*或**分别代表相同性状的核心种质与原群体的方差差异达到显著(P < 0.05) 或极显著水平(P<0.01，F测验）。
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表 4 不同抽样方法构建的苦瓜核心种质与原群体间遗传变异比较1)
Table 4 Comparisons of genetic variations between core collections constructed using three sampling methods and the initial population of bitter gourd
性状 项目 原群体 核心种质 F1 F2 F3 第1雌 平均值 13.66 13.61 13.78 12.91 花节位 极差 27.0 27.0 27.0 27.0 方差 16.436 30.688** 30.618** 29.948** 变异系数 0.297 0.407 0.401 0.424 瓜纵径/cm 平均值 30.69 29.41 29.69 30.08 极差 39.0 32.6 39.0 39.0 方差 43.074 67.341* 78.911** 76.956** 变异系数 0.214 0.279 0.299 0.292 瓜横径/cm 平均值 7.23 7.22 7.27 7.36 极差 9.2 9.2 9.2 9.2 方差 1.468 2.990** 2.929** 3.215** 变异系数 0.168 0.240 0.235 0.244 瓜肉厚/cm 平均值 1.16 1.18 1.19 1.22 极差 1.7 1.7 1.7 1.7 方差 0.058 0.110** 0.109** 0.119** 变异系数 0.207 0.281 0.277 0.284 单瓜质量/kg 平均值 0.58 0.57 0.59 0.60 极差 1.0 1.0 1.0 1.0 方差 0.034 0.066** 0.068** 0.070** 变异系数 0.315 0.454 0.447 0.442 1) F1~F3分别表示基于随机抽样、优先抽样和偏离度抽样方法构建的核心种质；相同性状的核心种质与原群体的均值差异均不显著（P>0.05, t检验）；*或**分别代表相同性状的核心种质与原群体的方差差异达到显著(P < 0.05) 或极显著水平(P<0.01, F测验）。
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表 5 不同来源地苦瓜种质入选核心种质所占比例
Table 5 The proportions of selected core germplasms from different origins
来源地 收集种质总数 入选核心种质数量 占比/% 日本 20 3 15.0 中国山东 5 0 0 中国广东 25 5 20.0 中国江西 8 1 12.5 中国海南 20 6 30.0 泰国 15 5 33.3 中国云南 10 4 40.0 中国湖南 8 1 12.5 中国广西 10 6 60.0 中国福建 18 6 33.3 斯里兰卡 5 4 80.0 印度 10 5 50.0 合计 154 46 29.9
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