截短侧耳素(Pleuromutilin)是由高等真菌担子菌纲侧耳属Pleurotsmutilus和Pleurotus passeckeranius菌种经深层培养产生的一种二萜类抗生素.截短侧耳素类主要是开发成动物专用抗生素，如泰妙菌素(Tiamulin)和沃尼妙林(Valnemulin)，主要用于畜禽病原菌感染引起的呼吸道疾病的防治，尤其对支原体感染有特效^[1].据Hanna等^[2]报道，泰妙菌素对猪肺炎支原体的MIC50为0.039 μg·mL^-1，对鸡败血支原体的MIC50为0.042 μg·mL^-1，而沃尼妙林对猪肺炎支原体的MIC为0.000 5 μg·mL^-1，对猪滑液支原体的MIC为0.000 1~0.000 25 μg·mL^-1.2007年截短侧耳素类抗生素瑞他妙林(Retapamulin)上市^[3].截短侧耳素类抗生素的共同抗菌作用机制是独特地与细菌50 S核糖体结合，抑制细菌蛋白质的合成，因此与其他抗生素较少发生交叉耐药^[1]，成为近期抗生素研究的一个新热点.随着研究的深入，更多的截短侧耳素类衍生物被发现，而衍生物BC-7013(其分子式为C₂₉H₄₀SO₅，相对分子质量为500.28)是由Nabriva Therapeutics公司开发的截短侧耳素类新衍生物，主要用于细菌感染治疗，尤其是针对耐药菌的感染^[4].衍生物BC-7013的药效研究^[5]表明:衍生物BC-7013对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC₉₀为0.03 μg·mL^-1，对耐青霉素的肺炎链球菌MIC为0.06 μg·mL^-1，对凝固酶阴性葡萄球菌的MIC90范围为0.03~0.25 μg·mL^-1.华南农业大学药理研究室研究发现，衍生物BC-7013对鸡毒支原体有显著的抑制活性(MIC＜0.000 25 μg·mL^-1，另文发表).本文采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS /MS)内标法定量测定血浆中衍生物BC-7013的浓度，对截短侧耳素衍生物BC-7013经单剂量静脉注射(简称静注)和口服在鸡体内的药物动力学(简称药动学)特征及生物利用度进行研究，旨在为新型动物专用截短侧耳素类抗生素的研发提供依据.

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦公司产品; API 400电喷雾-串联四级杆质谱仪，配置Analyst 1.5软件，美国应用生物系统公司产品; AT-261型电子分析天平，瑞士Mettle公司产品; 5804(R) /5801(R)型台式高速离心机，德国Ep pendorf公司产品.截短侧耳素衍生物BC-7013(结构式见图 1)由广东大华农动物保健品股份有限公司技术中心提供(批号: 130511).沃尼妙林酒石酸盐对照品，质量分数为98.7%，批号907-F67029，由百灵威化学有限公司提供.衍生物BC-7013的溶解剂为乙醇、聚乙二醇400和超纯水.甲醇、乙腈为色谱纯，均为美国Fisher公司产品; 水为超纯水; 其余试剂均为分析纯.

图  1  衍生物BC-7013的结构式

Figure  1.  Structure of derivative BC-7013

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1.1.2   试验动物

6周龄20只健康白羽鸡，雌雄各半，体质量(2.0 ± 0.3) kg，自由饮水和采食.试验时随机分成2组，每组10只，并称量记下各自的体质量.给药前禁食12 h，自由饮水，给药后禁饲4 h.

1.2   方法

1.2.1   色谱条件

液相色谱柱: ZORBAX SB-Aq C18 (2.1 mm × 150 mm，3.5 μm，美国Agilent公司).流动相:体积分数为0.1%甲酸水溶液(A)+体积分数为0.1%甲酸乙腈(B)，流速: 0.25 mL·min^-1.梯度洗脱:在0~1.0 min内，用V(A):V(B) = 90:10流动相洗脱; 在1.0~7.0 min内，用V(A):V(B) = 40:60流动相洗脱; 在7.0~7.1 min内，用V(A):V(B) = 20:80流动相洗脱; 在7.1~13.0 min内，用V(A):V(B) = 90:10流动相洗脱; 柱温: 30 ℃; 进样量: 5 μL.

1.2.2   质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测模式(MRM)，电喷雾电压(IS) 4 000 V，雾化气压力(GS1) 241 kPa，辅助气流速(GS2) 276 kPa，气帘气压力(CUR) 138 kPa，离子源温度(TEM) 600 ℃，碰撞室压力(CAD) 27.6 kPa，用于定量分析的离子反应分别为m/z 501.5→303.5 (衍生物BC- 7013)和m/z 566.0→263.0(沃尼妙林，内标).采用内标法进行定量，以衍生物BC-7013与沃尼妙林的色谱峰面积比对相应的药物浓度进行线性回归.

1.2.3   溶液的配制

精密称取衍生物BC-7013 10.00 mg，用甲醇溶解并用乙腈稀释配制成质量浓度为1 000 μg·mL^-1标准贮备液.精密称取沃尼妙林酒石酸盐3.00 mg，用超纯水溶解并稀释成质量浓度为30 μg·mL^-1的贮备液，4 ℃条件保存备用，使用时用超纯水稀释成3 μg·mL^-1的内标溶液.

1.2.4   试验方案

鸡侧卧保定，分别单剂量静脉注射(2.5 mg·kg^-1)与口服给药(15 mg·kg^-1)衍生物BC-7013，并分离翼下静脉，安置留置针采血.翼下静脉注射后于5、10、15、30、45 min和1、2、4、6、8、12、24、36、48 h翼下静脉采血; 由胃管直接注入嗉囊给药后于5、10、15、30、45 min和1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h翼下静脉采血.每次采静脉血约1.5 mL，置于肝素化的离心管中，混匀，3 000 r·min^-1离心10 min，分离血浆，置-20 ℃冰箱保存.

1.2.5   鸡血浆样品的处理方法

样品室温解冻后，摇匀.准确吸取500 μL血浆样品于2 mL离心管中，加入3 μg·mL^-1的内标沃尼妙林10 μL，旋涡振荡2 min，然后加入500 μL乙腈，充分涡旋振荡3 min，15 000 r·min^-1离心10 min，取上清液过0.22 μm的滤头进样后，进行HPLC-MS /MS定量分析.

1.2.6   数据处理

将血浆中实测药物质量浓度-时间数据采用WinNonlin 5.2药动学软件进行非房室模型统计矩原理处理，计算鸡血浆的药动学参数.

2.   结果与分析

2.1   色谱行为

HPLC-MS /MS法测定衍生物BC-7013时，样品峰及内标峰的保留时间分别为6.62和5.41 min(图 2~图 5).采用选择性离子检测方式专属性强，灵敏度高，血浆中内源性物质不干扰衍生物BC-7013和内标的测定.

图  2  鸡空白血浆样品质量色谱图

Figure  2.  Mass chromatogram of derivative BC-7013 in blank samples of chicken plasma

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图  3  鸡空白血浆添加200 ng·mL^-1衍生物BC-7013的质量色谱图

Figure  3.  Mass chromatogram of derivative BC-7013 in chicken plasma spiked at 200 ng·mL^-1

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图  4  鸡静脉注射给药后30 min血浆中衍生物BC-7013质量色谱图

Figure  4.  Mass chromatogram of derivative BC-7013 in chicken plasma at 30 min after intravenous administration in chickens

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图  5  鸡口服给药后1 h血浆中衍生物BC-7013质量色谱图

Figure  5.  Mass chromatogram of derivative BC-7013 in chicken plasma at 1 h after oral administration in chickens

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2.2   衍生物BC-7013在鸡血浆中的标准曲线

在鸡空白血浆中精密加入不同浓度的衍生物BC-7013标准贮备液，制备成含衍生物BC-7013质量浓度分别为10、20、50、100、200、400、800、1 000 ng·mL^-1的系列血浆样品，按“1.2.5”操作并测定，分别记录峰面积，以衍生物BC-7013峰面积(A_s)对内标峰面积(A_i)的比值为纵坐标(y)，衍生物BC-7013的质量浓度为横坐标(x)作线性回归，在10~1 000 ng·mL^-1范围内线性良好.衍生物BC- 7013血浆基质匹配标准曲线的线性方程为: y = 1 488.6x+1 575.4，r² = 0.999 7，表明衍生物BC-7013在10~1 000 ng·mL^-1范围内线性良好.衍生物BC- 7013在鸡血浆中定量限为10 ng·mL^-1(S/N＞10).

2.3   回收率和批内及批间变异系数的测定

配制含衍生物BC-7013质量浓度为20、300、800 ng·mL^-1的血样样品，各5份，按“1.2.5”操作并测定.另配制衍生物BC-7013质量浓度为20、300、800 ng·mL^-1的乙腈溶液为对照品，加入内标，同法操作.分别在上述色谱条件下进样测定，血样样品和对照品的峰面积分别记为A_s和A_i，计算提取回收率[r = A_s /A_i ×n× 100% (n= 1.25 /1)]^[6].结果表明，低、中、高质量浓度血浆样品的提取回收率(n= 5)分别为(88.39 ± 2.80) %、(91.52 ± 1.80) %、(89.46 ± 4.76) %; 同样的方法，得到内标沃尼妙林的提取回收率分别为(85.47 ± 3.89) %、(86.31 ± 2.45) %、(85.76 ± 1.94) %.配制含衍生物BC-7013质量浓度为20、300、800 ng·mL^-1的血样质控样品，按“1.2.5”项操作并测定.于1 d内(每个浓度平行操作5次)测定，连续测定5 d，计算得到批内变异系数(n= 5)分别为5.52%、4.87%、4.16%;批间变异系数(n= 5)分别为6.82%、5.78%、5.64%.结果表明衍生物BC-7013的平均提取回收率为(89.79 ± 3.12) %，批内及批间变异系数均小于10%，符合药动学的测定要求.

2.4   药动学参数及绝对生物利用度

鸡单剂量静脉给药衍生物BC-7013 (2.5 mg·kg^-1)后，测定不同时间的血药质量浓度，其药－时曲线见图 6; 鸡单剂量口服给药衍生物BC-7013 (15 mg·kg^-1)后，测定不同时间的血药质量浓度，其药－时曲线见图 7; 将数据采用WinNonlin 5.2药动学软件进行非房室模型统计矩原理处理，计算出衍生物BC-7013在鸡体内静脉和口服给药后的药动学参数，见表 1.

图  6  鸡静脉注射给药(2.5 mg·kg^-1)后衍生物BC-7013血药质量浓度-时间曲线

Figure  6.  Plasma concentration vs.time curve of derivative BC-7013 in chickens after i.v.administration (2.5 mg·kg^-1)

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图  7  鸡口服给药(15 mg·kg^-1)后衍生物BC-7013血药质量浓度-时间曲线

Figure  7.  Plasma concentration vs.time curve of derivative BC-7013 in chickens after oral administration (15 mg·kg^-1)

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表  1  鸡静注(2.5 mg·kg^-1)、口服(15 mg·kg^-1)衍生物BC-7013后衍生物BC-7013的药动学参数

Table  1.  Pharmacokinetical parameters of derivative BC-7013 in chickens after a single intravenous at 2.5 mg·kg^-1 and a single oral administration 15 mg·kg^-1

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将药物动力学软件处理所得的静注和口服AUC_(0→∞)值代入下式计算衍生物BC-7013在鸡体内的绝对生物利用度(F)，F = (AUC_口服 /AUC_静注)× (D_静注 /D_口服) × 100%.结果表明，口服衍生物BC- 7013的平均绝对生物利用度为(10.37 ± 1.48) % (n= 10).

3.   讨论

3.1   静注衍生物BC-7013的药动学特征

静脉给药结果表明，按2.5 mg·kg^-1剂量给鸡静注衍生物BC-7013后，t_1/2β为(1.37 ± 0.14) h，而王蕊^[7]报道沃尼妙林在鸡体内的t_1/2β为(2.21 ± 0.30) h，表明衍生物BC-7013在鸡体内消除比沃尼妙林更快，Vd为(1.87 ± 0.25)L·kg^-1，由于Vd大于1 L·kg^-1，表明衍生物BC-7013在鸡体内分布广泛，可在深部组织蓄积^[8]，可能广泛分布至组织间液.

3.2   口服给药衍生物BC-7013的药动学特征

口服给药结果表明，按15 mg·kg^-1剂量口服衍生物BC-7013后，t_max为(1.94 ± 0.26) h，与颜虎^[9]报道的鸡口服沃尼妙林后的t_max为(1.80 ± 0.68) h、Laber等^[10]报道的鸡口服泰妙菌素后的t_max为(2.14 ± 0.27) h相似，比Wicha等^[11]报道的人口服衍生物BC-3781后的t_max为(1.65 ±0.67) h稍大; 表明衍生物BC-7013在鸡体内的吸收速度与沃尼妙林、泰妙菌素在鸡体内的吸收速度相类似，但是比衍生物BC-3781在人体内的吸收速度要慢，可能是种属差异所致.C_max为(126.18 ±6.54) ng·mL^-1，比曾东平等^[12]报道的猪口服沃尼妙林后C_max为(1.35 ± 0.06) μg·mL^-1、Wicha等^[11]报道的C_max为(1.46 ± 0.44) μg·mL^-1小，与Laber等^[10]报道的C_max为(3.5 ± 0.24) μg·mL^-1相差较大; 表明沃尼妙林在猪体内的吸收程度、泰妙菌素在鸡体内的吸收程度和衍生物BC-3781在人体内的吸收程度都比衍生物BC-7013在鸡体内的要高.C_max为(126.18 ± 6.54) ng·mL^-1，表明血药浓度较低，可能由于该衍生物存在明显的首过效应(First-pass effect)，药物经口服给药进入胃肠道第1次在肠黏膜内或经门静脉在肝脏代谢灭活后，进入血液循环的有效药量减少，从而导致AUC和绝对生物利用度显著减小，肝肠循环使药物的吸收程度加大，而消除减慢，MRT增大，这意味着有效血药浓度维持时间延长.

口服给药时，衍生物BC-7013被吸收的很少，提示大部分药物都是以原型药由肠道排出，因此可以用作肠道用药.如果改变剂型，制成乳剂膏药可用于皮肤外用药.据文献报道，约40%以上的新活性物质由于水溶性差而导致生物利用度不佳^[13]，生物利用度低是药理活性物质不能成为治疗药物的主要原因.所以提高药物的溶解性是开发新药的关键步骤，可以采用纳米混悬剂、微囊包被技术和固体分散技术等方法改善衍生物BC-7013的口服给药吸收少和生物利用度低的问题.本文对衍生物BC-7013在鸡体内的药代动力学特性进行了研究，为该药的进一步研究提供了参考.