水稻Oryza sativa L. 是人类最重要的粮食作物之一，杂交水稻的推广极大地提高了水稻单产，为我国粮食安全提供了强有力的保障。但是杂交稻尤其是两系杂交稻在种子生产过程中，光温敏核雄性不育系在低温条件下育性容易恢复，导致杂交种亲本混淆和杂交种纯度下降。例如‘培矮64S’在1989、2001和2002年夏季的低温条件下，出现了严重的育性恢复，致使其组配的F₁杂交种出现了较大比率的假杂交种^[1]。如何在低温条件下确保不育系和杂交种的纯度一直以来是困惑育种学家们的一个难题。为了解决这一问题，人们尝试使用了不同的方法，例如人工除杂技术和紫叶标记技术。比较而言，人工除杂技术有明显的缺陷，使用该技术进行人工筛选去除假不育系，不仅成本高周期长，而且许多性状受栽培技术及环境因素的影响而不易辨别，影响筛选效果。而紫叶标记技术具有明显的优势，导入了隐性紫叶性状的不育系在苗期表现紫色，如果繁种时该隐性紫叶不育系与其他正常绿叶的水稻串粉结实，其杂交种表现为绿色，那么在苗期的制种田里就能轻易剔除掉混杂的不育系，保证不育系纯度。为此，育种学家们将紫叶标记技术与不育系的选育相结合，先后育出‘中紫S’、‘明紫–2S’、‘明紫–3S’、‘99Hll4紫S’、‘紫IIA’和‘先红A’^[2-7]等一批具有较高应用价值的紫叶不育系，极大减少了杂交稻因种子纯度下降而造成的损失。

水稻的紫色性状与花青素含量的累积相关。花青素是一种黄酮类植物色素，它的合成既受结构基因编码蛋白的调控，也受调节因子，如MYB(v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族的bHLH(Helix-helix-turn-helix)蛋白等的控制^[8]。花青素的转运与积累可能受GST(Glutathione S-transferase)和MATE(Multidrug and toxin efflux)蛋白家族基因等的调控^[9-10]。截至2018年3月，通过图位克隆已克隆出OsC1和Pl^w2个水稻紫叶性状基因，其中，OsC1位于第6号染色体上编码1个MYB类转录因子，Pl^w位于第4号染色体上，由OsB1和OsB2共同组成，编码1个bHLH转录因子^[11-12]，这些基因的克隆促进了对水稻花青素分子调控机制的理解。但是，水稻紫叶性状受合成基因、调节基因和转运基因等多个基因控制。因此，深入挖掘水稻紫叶新基因，对增进对水稻花青素分子调控机制的理解并促进其在水稻遗传改良中的应用具有重要意义。

本研究从紫叶籼稻品种‘Z3474’与绿叶粳稻品种‘日本晴’的杂交后代中选育得到紫叶纯系材料pl41，并对其进行表型分析、遗传分析和基因初步定位研究，以期为pl41的图位克隆、花青素分子调控路径解析和pl41在水稻遗传改良中的应用奠定坚实基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

水稻紫叶材料pl41是从紫叶籼稻品种‘Z3474’与绿叶粳稻品种‘日本晴’的杂交后代中筛选得到的1份紫叶性状稳定遗传的材料。pl41与‘日本晴’杂交后代F₁及分离群体F₂用于紫叶性状的遗传分析和基因初步定位研究。

1.2   田间种植和性状调查

田间试验分别于2015和2016年在广西大学农学院试验田进行，分早晚2季：早季3月1日播种，4月7日移栽；晚季7月21日播种，8月9日移栽。株行距15 cm×25 cm，单株种植，每行10株，常规水肥管理。苗期、抽穗期和灌浆期分别观察pl41、‘日本晴’和F₁植株的叶色，并统计分析F₂群体中紫叶和绿叶单株的分离情况，挑选F₂群体中紫叶单株进行目标基因定位研究。

1.3   叶绿素及花青素含量测定

在苗期、抽穗期和灌浆期分别取pl41和‘日本晴’的倒2叶进行叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素和花青素含量的测定，每个时期每个亲本分别重复3次。

叶绿素含量测定：样品表面用蒸馏水冲洗，并用吸水纸吸干表面水分，将叶片剪成直径为1~3 mm的碎片，混匀后称取碎片0.05 g，放入25 mL棕色试剂瓶中，重复3次。用V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1的混合液定容至25 mL，室温下置于摇床上振荡24 h，使碎片与试剂充分接触。以V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1的混合液为空白对照，使用INESA L5S紫外可见分光光度计测定浸提液在波长470、645和663 nm下的吸光度(D)。

按照以下公式分别计算叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量：

w(叶绿素a)=(12.7D_{663 nm}–2.69D_{645 nm})V/(1 000m)，

w(叶绿素b)=(22.9D_{645 nm}–4.68D_{663 nm})V/(1 000m)，

w(总叶绿素)=(20.2D_{645 nm}+8.02D_{663 nm})V/(1 000m)，

w(类胡萝卜素)=4.7D_{470 nm}–0.27w_总。

式中，V为提取液总体积(25 mL)；m为样品质量(0.05 g)。

花青素含量测定：样品表面用蒸馏水冲洗，并用吸水纸吸干表面水分，将叶片剪成直径为1~3 mm的碎片，混匀后称取碎片0.1 g，放入10 mL离心管中，重复3次。加入0.1 mol·L^–1盐酸溶液，定容至10 mL。室温下置于摇床上振荡4 h，使碎片与试剂充分接触。以0.1 mol·L^–1的盐酸溶液为空白对照，使用INESA L5S紫外可见分光光度计在530 nm下测定浸提液的吸光度。假设吸光度D_{530 nm}=0.1时的花青素浓度为1个单位，用以比较花青素的相对含量，计算公式为：

花青素的相对含量=10D_{530 nm}。

1.4   统计分析方法

采用SPSS11.0和Excel软件对试验数据进行统计分析，差异显著性分析采用t检验法。

1.5   DNA提取、PCR体系及电泳

参照Monna等^[13]的方法提取叶片基因组DNA。用于基因定位的PCR扩增体系为10 μL： DNA模板1 μL、上下游引物各0.4 μL、PCR Mix 5 μL和ddH₂O 3.2 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，33个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物经70 g·L^–1的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。用于候选基因测序的PCR扩增体系为40 μL，包括DNA模板4 μL、上下游引物各1.6 μL、2×EasyPfu PCR SuperMix 20 μL、ddH₂O 12.8 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 35 s、72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经20 g·L^–1的琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带回收后由深圳华大基因公司测序。PCR Mix和EasyPfu PCR SuperMix均购自全式金生物技术公司。

1.6   多态性分子标记的开发

基因连锁分析及定位的分子标记包括STS和SSR标记，其中SSR标记引物序列来自数据库 http://www.gramene.org，STS标记基于粳稻品种‘日本晴’和籼稻品种‘9311’的序列差异，在差异序列两端开发设计引物，SSR和STS标记引物均由深圳华大基因公司合成。

1.7   候选基因的预测分析

利用RAP-DB( http://rapdb.dna.affrc.go.jp)和GRAMENE( http://ensembl.gramene.org)水稻基因组注释信息，对定位区间内的所有基因进行预测，结合候选基因编码区序列的测序比对，分析候选基因。

2.   结果与分析

2.1   pl41植株表型特征

pl41株型与‘日本晴’无明显差异，但植株颜色有明显差别。在苗期，pl41叶鞘、叶尖和叶缘处呈现紫色，颜色较浅(图1A)；从苗期开始，植株紫色逐渐变深，抽穗期地上部分组织呈现较深的紫色(图1B)。‘日本晴’植株在各个时期均表现为绿色(图1A、1B)。pl41叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量在苗期显著高于‘日本晴’，在抽穗期显著低于‘日本晴’，在灌浆期无显著差异；pl41花青素含量在苗期、抽穗期和灌浆期均极显著高于‘日本晴’(表1)。花青素含量与叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的相关系数分别为–0.936、–0.958和–0.941，均达极显著负相关(P<0.01)。在抽穗期，pl41叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均低于苗期，花青素含量高于苗期；在灌浆期，pl41叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量高于抽穗期，花青素含量低于抽穗期(表1)。

图  1  ‘日本晴’和pl41植株的表型分析

Figure  1.  Phenotypic analyses of ‘Nipponbare’ and pl41

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表  1  pl41和‘日本晴’在3个不同发育时期叶绿素、类胡萝卜素及花青素含量比较¹⁾

Table  1.  Comparisons of chlorophyll, carotenoid and anthocyanin contents between pl41 and ‘Nipponbare’ at three different developmental stages

生长期	材料	w(mg·g–1)				花青素相对含量
		叶绿素a	叶绿素b	总叶绿素	类胡萝卜素
苗期	pl41	5.37±0.52**	1.13±0.10**	6.50±0.62**	2.07±0.19**	2.73±0.07***
	日本晴	4.05±0.06	0.82±0.01	4.87±0.07	1.54±0.02	0.07±0.01
抽穗期	pl41	2.68±0.18**	0.47±0.07**	3.15±0.24**	1.03±0.04**	17.00±0.35***
	日本晴	4.78±0.33	1.30±0.14	6.08±0.47	1.94±0.12	0.08±0.44
灌浆期	pl41	3.20±0.18	0.65±0.04	3.85±0.22	1.65±0.08	10.88±0.43***
	日本晴	3.44±0.19	0.65±0.04	4.09±0.23	1.66±0.08	0.02±0.01
1) “**”和“***”分别表示pl41和‘日本晴’相同时期的相同指标在 0.01 和 0.001 水平差异显著(t 检验法)

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2.2   pl41紫叶性状遗传分析

为了明确pl41紫叶性状的遗传基础，本研究对pl41与‘日本晴’杂交后代F₁及分离群体F₂的紫叶性状进行了遗传分析。结果表明，F₁代植株均表现为绿叶，F₂代植株叶片颜色呈现明显的紫色和绿色分离，绿叶和紫叶单株数分别为254和79株，符合3∶1的分离比(χ²=0.26，P>0.05)，表明pl41紫叶性状受1对隐性主效核基因控制。

2.3   pl41的初步定位

为了分离控制pl41紫叶性状的目标基因pl41，我们在F₂代分离群体中选取了480株紫叶单株用于pl41的初步定位研究。利用127对在pl41和‘日本晴’之间存在多态性的STS和SSR分子标记引物对480株紫叶单株进行连锁分析，结果表明目标基因pl41与第12号染色体上的分子标记引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7(表2)的序列存在不同程度的连锁，并且被初步定位于P3和P4之间289 kb的范围内(图2)。在此定位区间内，存在53个注释的预测基因，这些基因编码的蛋白详见表3。其中，有5个基因可能与花青素的合成与转运相关：1个GST蛋白编码基因(编号25)、1个MYB类转录因子蛋白编码基因(编号44)和3个MATE转运蛋白编码基因(编号49、52、53)。对pl41这5个基因的编码区序列进行测序，并分别与‘日本晴’序列比对，发现这5个基因的编码区序列与‘日本晴’无差异。

表  2  pl41初步定位所用引物

Table  2.  Primers used in preliminary mapping of pl41

名称	分子标记类型	正向序列（5′→3′）	反向序列（5′→3′）
P1	SSR	GCTTCCCTTGTATACTCTATCT	CCTCTTATCAGACGCACAA
P2	SSR	CTTCTTCCCGTTGTTCCCAA	GTTTGGAGGTGAGCTGGACA
P3	STS	TGGTAACTAGTACTCTCCCTT	CTTCTGTAACTCCATTCTGA
P4	STS	TTTTAACATCTCCATTCTCG	GACGAATAGTCAAACAGTGC
P5	STS	TGTTGAATATGCACAAAGAG	TGGTTCATTGGCTTAGGA
P6	STS	TTATTCCCCGACCAATCAAC	CAAATTCCGCTTGGTATTGAC
P7	STS	TCCCAATCATGGAAATACTT	TTGTTTCTTAGAAGCAGAGG

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图  2  水稻紫叶基因pl41在第12号染色体上的初步定位

Figure  2.  Preliminary mapping of rice purple leaf gene pl41 on chromosome 12

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表  3  定位区间内的基因注释

Table  3.  Gene annotation in the preliminary mapped region

编号	基因功能注释	基因 ID		编号	基因功能注释	基因 ID
1	DUF567 结构域包含蛋白	LOC_Os12g02720		28	反转座子蛋白	LOC_Os12g03000
2	组氨酸三聚体家族蛋白	LOC_Os12g02730		29	反转座子蛋白	LOC_Os12g03010
3	表达蛋白	LOC_Os12g02750		30	转座子蛋白	LOC_Os12g03020
4	DUF567 结构域包含蛋白	LOC_Os12g02760		31	保守的假定蛋白	LOC_Os12g03030
5	反转座子蛋白	LOC_Os12g02770		32	无顶端分生组织蛋白	LOC_Os12g03040
6	反转座子蛋白	LOC_Os12g02780		33	无顶端分生组织蛋白	LOC_Os12g03050
7	表达蛋白	LOC_Os12g02790		34	表达蛋白	LOC_Os12g03060
8	CRP11–富含半胱氨酸蛋白前体	LOC_Os12g02800		35	FHA 结构域包含蛋白	LOC_Os12g03070
9	蛋白激酶结构域包含蛋白	LOC_Os12g02810		36	rp3 蛋白	LOC_Os12g03080
10	反转座子蛋白	LOC_Os12g02814		37	核糖体蛋白	LOC_Os12g03090
11	胞苷酰基转移酶结构域包含蛋白	LOC_Os12g02820		38	表达蛋白	LOC_Os12g03094
12	SNF7 结构域包含蛋白	LOC_Os12g02830		39	结构域包含蛋白	LOC_Os12g03100
13	ATCHX 蛋白	LOC_Os12g02840		40	ZF–HD 蛋白二聚化结构域包含蛋白	LOC_Os12g03110
14	表达蛋白	LOC_Os12g02850		41	表达蛋白	LOC_Os12g03120
15	反转座子蛋白	LOC_Os12g02860		42	CDC45A–假定的DNA复制起始蛋白	LOC_Os12g03130
16	GRAS 家族转录因子结构域包含蛋白	LOC_Os12g02870		43	表达蛋白	LOC_Os12g03140
17	E2F 相关蛋白	LOC_Os12g02880		44	MYB 类转录因子蛋白	LOC_Os12g03150
18	反转座子蛋白	LOC_Os12g02890		45	转座子蛋白	LOC_Os12g03160
19	反转座子蛋白	LOC_Os12g02900		46	表达蛋白	LOC_Os12g03170
20	糖基转移酶	LOC_Os12g02910		47	Mad3/BUB1 同源蛋白	LOC_Os12g03180
21	表达蛋白	LOC_Os12g02920		48	高丝氨酸脱氢酶	LOC_Os12g03190
22	表达蛋白	LOC_Os12g02930		49	MATE 转运蛋白	LOC_Os12g03200
23	EMB2748 蛋白	LOC_Os12g02950		50	转座子蛋白	LOC_Os12g03210
24	表达蛋白	LOC_Os12g02940		51	表达蛋白	LOC_Os12g03220
25	谷胱甘肽–S–转移酶	LOC_Os12g02960		52	MATE 转运蛋白	LOC_Os12g03230
26	RNA 结合蛋白	LOC_Os12g02970		53	MATE 转运蛋白	LOC_Os12g03240
27	核苷三磷酸酶	LOC_Os12g02980

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3.   讨论与结论

水稻紫色性状为明显的标记性状，在不育系和杂交稻种子纯度的鉴定上具有重要的应用价值，其性状表现与花青素的合成、转运和累积相关。花青素分布的多样性使得水稻紫色性状表现多样化，例如有些水稻品种在叶鞘和茎基部表现紫色，而有些水稻品种只在叶缘、柱头和稃尖等部位呈现紫色。本研究鉴定出来的pl41植株大部分组织均表现紫色，带紫色性状的植株与绿色植株区别明显，而且紫色性状稳定，不易受季节和环境因素影响，由此可见，pl41具有较大的应用潜力。

目前，虽然关于水稻紫色性状已有较深入研究，但已报道的紫色性状基因多为显性基因，例如OsC1和PSH1(t)^{[11, 14]}。由于显性基因无法区分纯合子和杂合子，使得无法剔除掉混杂的不育系和假杂种，所以这类基因一般不能应用于生产实践。因此，挖掘隐性紫色性状基因，对于促进其在生产实践上的成功应用具有重要意义。本研究鉴定的pl41为隐性基因，定位于第12号染色体短臂289 kb范围内，在目前报道的水稻紫叶基因中没有1个基因位于该区域，这表明pl41可能是1个新的隐性紫叶基因。在该定位区间内发现有5个基因可能与花青素的合成与转运相关，包括1个MYB类转录因子蛋白编码基因、1个GST蛋白编码基因和3个MATE蛋白编码基因。在植物中，MYB类转录因子蛋白调控花青素结构基因的时空表达和花青素的组织分布^[8]，水稻第6号染色体上的1个MYB类转录因子蛋白编码基因OsC1被发现与叶鞘花青素的累积相关^[11]；GST和MATE蛋白家族基因被发现可能参与花青素向液泡的转运，例如拟南芥的TT19基因^[15]、玉米的Bronze-2基因^[9]和拟南芥的TT12基因^[16]，就已被证明与花青素的累积相关。通过测序比对分析，发现这5个基因的编码区序列在pl41与‘日本晴’之间无差异，表明它们可能不是pl41紫叶性状的候选基因，但也不能完全排除这种可能，因为导致表型变异的因素除了基因编码区序列差异以外，基因启动子和增强子区序列的差异也能导致表型变异。因此，下一步拟检测这5个基因在启动子和增强子区的序列差异和转录水平上的表达差异，预测可能的候选基因。同时也配制了pl41的大分离群体，以期通过精细定位为pl41最终的图位克隆奠定基础。

研究表明，叶色标记一般全生育期表达，在影响不育系本身农艺性状的同时，对繁种和制种产量也有一定负效应。本研究发现，pl41花青素的累积与叶绿素含量的变化呈显著负相关，这表明pl41可能对农艺性状尤其是水稻产量性状有一定的影响。由于近等基因系的遗传背景基本一致，可以最大限度降低遗传背景对目标基因的影响，因此它是准确分析目标基因对产量性状影响的理想材料。为了更准确地分析pl41对水稻产量性状的影响、更详细地评估pl41的应用潜力，目前正在构建pl41的近等基因系，拟利用pl41的近等基因系来分析pl41对农艺性状的影响。这些工作将为阐明pl41对水稻产量性状的影响和评价pl41的应用潜力奠定坚实的基础。