20 味中药提取物对无乳链球菌的体外抑菌活性研究
Effects of twenty traditional Chinese medicine extracts against Streptococcus agalactiae in vitro
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摘要: 【目的】 筛选对无乳链球菌 Streptococcus agalactiae 具有良好体外抑菌效果的中药.【方法】 通过乙醇回流、超声波方法提取20味中药的抗菌活性部位，采用试管二倍稀释法测定黄连 Coptis chinensis 等20味中药提取物对无乳链球菌的最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（Minimal bactericidal concentration，MBC），并评价抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌效果.【结果和结论】 乌梅Prunus mume、黄连、黄芩Scutellaria baicalensis、虎杖Polygonum cuspidatum和地榆Sanguisorba officinalis 5味中药提取物对无乳链球菌的MIC范围为7.80～31.25 mg/mL.蒲公英Taraxacum mongolicum、茵陈Artemisia scoparia、秦皮Fraxinus rhynchophylla、艾叶Artemisia argyi、黄柏Phellodendron chinense、鱼腥草Houttuynia cordata、紫花地丁Violae yedoensis和白头翁Pulsatilla chinensis 8味中药提取物的MIC范围为62.50～125.00 mg/mL.何首乌Po. multiflorum、苦参Sophora flavescens、穿心莲Andrographis paniculata、杜仲Eucommia ulmoides、连翘Forsythia suspensa、金银花Lonicera japonica和夏枯草Prunella vulgaris 7味中药提取物的MIC范围为250.00～500.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明，黄芩、虎杖、地榆和黄连的联合抑菌指数（FICI）≤1，虎杖、黄芩和地榆的FICI＞2.黄连、黄芩、虎杖和地榆对无乳链球菌均具有很强的体外抗菌活性，地榆、黄连为相加作用，黄连、黄芩和虎杖为协同作用，地榆与黄芩、虎杖为拮抗作用.Abstract: 【Objective】 Screening for the traditional Chinese medicines which have good antibacterial effects on Streptococcus agalactiae in vitro.【Method】 Using ethanol reflux and ultrasonic method, extracts of 20 different traditional Chinese medicines were obtained. Minimal inhibitory concentration(MIC) and minimal bactericidal concentration(MBC) of Coptis chinensis and other 19 extracts of traditional Chinese medicines on St. agalactiae were detected by macrodilution broth method, and combined antibacterial effects in vitro of them were also observed. 【Result and conclusion】 The MICs of the extracts obtained from Prunus mume, Coptis chinensis, Scutellaria baicalensis, Polygonum cuspidatum and Sanguisorba officinalis against St. agalactiae ranged from 7.80 to 31.25 mg/mL. The MICs of the extracts obtained from Taraxacum mongolicum, Artemisia scoparia, Fraxinus rhynchophylla, Artemisia argyi, Phellodendron chinense, Houttuynia cordata, Violae yedoensis and Pulsatilla chinensis ranged from 62.50 to 125.00 mg/mL. The MICs of the extracts obtained from Po. multiflorum, Sophora flavescens, Andrographis paniculata, Eucommia ulmoides, Forsythia suspensa, Lonicera japonica and Prunella vulgaris ranged from 250.00 to 500.00 mg/mL. The results of joint bacteriostatic test showed that the fractional inhibitory concentration index (FICI) of the extracts obtained from Sc. baicalensis, Po. cuspidatum, Sa. officinalisand C. chinensis was less than or equal to 1. The FICI of Po. cuspidatum, Sc. baicalensis and Sa. officinalis was more than 2. C. chinensis, Sc. baicalensis, Po. cuspidatum and Sa. officinalis showed a good antibacterial effect against St. agalactiae in vitro. The combination of Sa. officinalis and C. chinensis was characterized by a additive effect, whereas the combination of C. chinensis, Sc. baicalensis and Po. cuspidatum was characterized by a synergism effect. The combination of Sa. officinalis and Sc. baicalensis, Po. cuspidatum showed antagonism effect.
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苦瓜Momordica charantia起源于非洲，属于葫芦科Cucurbitaceae苦瓜属Momordica蔓生草本植物，在亚洲、南美洲和非洲有着悠久的种植历史[1-2]。苦瓜富含维生素、氨基酸及矿物质，营养成分丰富。此外，苦瓜所含的皂苷、多糖、小分子蛋白及黄酮类物质具有降低血糖含量[3]、抑制肿瘤细胞增殖[4]、增强人体免疫力[5]和消炎[6]等活性。随着消费者对苦瓜价值的深入认识和接受，也推动了苦瓜研究工作的深入开展。种质资源不仅包括栽培种，还包括近缘种和野生种，是种质创新和新品种选育的物质基础，蕴含着丰富的遗传多样性[7]。遗传多样性和亲缘关系分析是种质资源评价的主要内容。前人对苦瓜种质资源遗传多样性进行了大量研究。温庆放等[8]分析了24份苦瓜材料的亲缘关系，将供试材料分为3大类群。张长远等[9]对国内外的45份苦瓜种质进行了亲缘关系分析，将45份苦瓜种质分为滑身苦瓜和麻点苦瓜，研究表明苦瓜种质存在一定的地域性差异。黄如葵等[10]基于28个形态性状对33份苦瓜种质资源进行聚类分析，发现各组群间存在明显的地域性差异，中国苦瓜种质与印度、东南亚地区的种质资源间遗传距离较大。杨衍等[11]对36份苦瓜种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，结果表明供试材料存在广泛的遗传变异。康建坂等[12]对48份苦瓜种质的遗传多样性进行分析，准确地将形态特征相似、亲缘关系极其密切的种质区分开来。张凤银等[13]研究表明，苦瓜种质资源的形态学性状和营养成分具有丰富的多样性。陈禅友等[14]对30份苦瓜种质进行了遗传多态性分析，发现苦瓜种质间的亲缘关系与地理分布和植物学性状特征等有一定关联。周坤华等[15]对国内外不同栽培类型和野生资源共48份苦瓜材料进行了聚类分析，结果表明苦瓜种质资源遗传基础丰富，并能有效地区分栽培类群和野生类群。张燕等[16]评价了51份苦瓜种质资源，明确了不同品系的表型特征和遗传多样性，筛选出了一些特异种质资源。
随着种质资源的不断收集和积累，庞大的数量不仅保存困难，而且筛选特异种质材料的难度不断加大，很难对其进行深入地研究并加以有效利用。因此，筛选具有多样性和代表性的一部分种质资源加以保存和研究，成为一个亟需解决的问题。Frankel等[17]和Brown[18]于80年代提出了构建核心种质的理念，即在深入评价与鉴定种质资源的基础上，以最少的种质数量最大限度地保存整个群体的遗传变异。构建核心种质库不仅有利于种质库的管理，也是促进种质资源深入研究和有效利用的关键。以往研究主要基于性状表型值、分子标记、性状基因型值3种方法构建核心种质。性状表型值的测量具有直接、简便、易行的优点，被广泛应用于园艺植物核心种质库构建的研究[19-24]，但表型值受基因型、环境以及环境条件与基因型互作等多重影响，因此单纯依靠表型值来度量种质间的遗传差异具有一定的局限性。近年来，随着分子标记的发展，分子标记技术已被应用于核桃[25]、甘蔗[26]、番茄[27]等作物的核心种质构建。苦瓜基因组研究相对滞后，可以利用的序列资源及标记数量有限，依靠稳定、可靠、高通量的标记类型进行核心种质构建具有一定的局限性，国内外有关苦瓜核心种质库构建的研究鲜见报道。准确度量遗传材料间的遗传差异及理想的聚类和抽样方法是有效构建核心种质的关键所在。本研究利用MLM（Mixed linear model）模型无偏预测苦瓜性状的基因型值，通过不同聚类法和抽样方法构建苦瓜核心种质，以期为苦瓜种质资源的收集、评价和高效利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
供试苦瓜种质资源共154份，20份来自中国海南，18份来自中国福建，25份来自中国广东，10份来自中国云南，10份来自中国广西，5份来自中国山东，8份来自中国湖南，8份来自中国江西，15份来自泰国，20份来自日本，5份来自斯里兰卡，10份来自印度（表 1）。不同种质间第1雌花节位、果实大小等性状存在显著差异。
表 1 苦瓜种质资源的来源Table 1. The origin of bitter gourd germplasm种质编号 来源 Y1~Y20 日本 Y21~Y25 中国山东 Y26~Y50 中国广东 Y51~Y58 中国江西 Y59~Y78 中国海南 Y79~Y93 泰国 Y94~Y103 中国云南 Y104~Y111 中国湖南 Y112~Y121 中国广西 Y122~Y139 中国福建 Y140~Y144 斯里兰卡 Y145~Y154 印度 1.2 方法
1.2.1 材料种植和性状调查
试验于2015年1月初在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所试验基地进行育苗，1月下旬进行田间移栽，按随机区组设计种植154份苦瓜种质资源，2次重复，每个重复种植6株。2015年2— 4月参考《苦瓜种质资源描述规范与数据标准》[28]调查第1雌花节位、瓜纵径、瓜橫径、瓜肉厚、单瓜质量。在同一生长季节完成农艺性状表型值的调查，避免了不同种植季节造成的误差。采用MLM模型调整无偏预测法预测性状的基因型效应值[29]。
1.2.2 遗传距离计算与聚类分析
基于性状的基因型值，采用马氏距离方法计算不同苦瓜遗传材料间的遗传距离[30]。基于遗传距离分别利用最短距离法、中间距离法、最长距离法、类平均法、重心法、可变类平均法、可变法以及离差平方和法进行聚类分析[31]。
1.2.3 抽样与核心种质遗传变异评价
采用随机抽样法[32]、优先抽样法[33]和偏离度抽样法[34]基于30%的抽样率分别构建苦瓜核心种质库。采用极差、方差、变异系数和均值等4个指标评价苦瓜核心资源库的优劣。 t检验分析均值的差异性， F测验分析方差的差异性。
2. 结果与分析
2.1 苦瓜资源主要数量性状变异情况
苦瓜种质资源主要数量性状的变异情况见表 2。各性状变异系数平均值为0.238。5个数量性状中，单瓜质量变异系数最大，为0.310，变异幅度几乎是平均值的2倍；第1雌花节位变异系数为28.93%，位居第2位；瓜纵径最大值为49.60 cm，最小值为10.60 cm，变异系数为0.214，位居第3位；瓜肉厚变异系数为0.207；瓜横径最大值为10.60 cm，最小值为1.40 cm，变异系数在5个性状中最小，为0.167。种质Y5、Y87、Y112、Y139、Y152性状优良，为苦瓜骨干材料。Y5纵径23.0~25.0 cm，横径6.5~7.5 cm，肉厚1.0 cm左右，单瓜质量0.25~0.35 kg，皮色油绿有光泽，短纺锤型，中早熟，强雌性系，耐寒性较强，中抗白粉病、枯萎病; Y87纵径30.0~35.0 cm，横径6.0~7.5 cm，肉厚1.5 cm左右，单瓜质量0.50~0.70 kg，皮色油绿有光泽，长圆锥形，中晚熟，肉质致密，微苦，抗枯萎病; Y112纵径20.0~25.0 cm，横径8.0~8.5 cm，肉厚1.5 cm左右，单瓜质量0.75~0.95 kg，皮色油绿有光泽，晚熟，耐热性较强，中抗白粉病、枯萎病; Y139纵径29.0~32.0 cm，横径6.0~7.0 cm，肉厚1.1 cm左右，单瓜质量0.40~0.50 kg, 果实长圆锥形，油绿色，瘤粗长，肉质脆，优质，抗病，雌性强，中熟，分枝性强。Y152纵径24.0~26.0 cm，横径5.5~6.0 cm，肉厚1.0 cm左右，单瓜质量0.35~0.39 kg，瓜形整齐，肩部平整，早熟。
表 2 苦瓜资源主要数量性状的变异情况Table 2. Genetic variations of main quantitative traits in bitter gourd germplasm性状 第1雌花节位 瓜纵径/cm 瓜横径/cm 瓜肉厚/cm 单瓜质量/kg 最小值 4 10.6 1.4 0.6 0.1 最大值 31 49.6 10.6 2.3 1.1 平均值 14 30.7 7.2 1.2 0.6 极差 27 39.0 9.2 1.7 1.0 标准差 4.1 6.6 1.2 0.2 0.2 变异系数 0.289 0.214 0.167 0.207 0.310 2.2 不同聚类方法构建的苦瓜核心种质比较
采用优先抽样法、马氏距离和30%的抽样比率，分别基于8种聚类方法（最短距离法、中间距离法、最长距离法、类平均法、重心法、可变法、可变类平均法和离差平方和法）构建苦瓜核心种质。由表 3可知，8种聚类方法构建的核心种质的均值与原群体的差异不显著(P>0.05)，5个性状的方差与原群体相比均得到不同程度地提高，极差与原群体一致。利用最短距离法构建的核心种质，5个性状的方差均大于其他7种聚类方法，与原群体方差相比差异均达极显著水平(P < 0.01)。采用最长距离法和可变法构建的核心种质均有4个性状的方差与原群体相比差异达极显著水平。采用离差平方和法构建的苦瓜核心种质有3个性状的方差与原群体方差相比差异达极显著水平。采用中间距离法、重心法、可变类平均法构建的核心种质，分别有2个性状的方差与原群体的差异达极显著水平，采用类平均法构建的核心种质有1个性状的方差与原群体的差异达极显著水平。第1雌花节位、瓜纵径、瓜橫径、瓜肉厚和单瓜质量5个性状原群体的极差分别为27、39.0 cm、9.2 cm、1.7 cm和1.0 kg，各性状8种聚类方法构建的核心种质的极差与原群体的完全一致。8种聚类方法构建的核心种质所有5个性状的变异系数均高于原群体；采用最短距离法构建的苦瓜核心种质所有5个性状的变异系数均高于其他7种聚类方法。综合以上分析结果，采用最短距离法构建的苦瓜核心种质与其他聚类方法相比具有较大的遗传差异，5个性状的变异系数均最大，明显优于其他7种聚类方法。
表 3 不同聚类方法构建的苦瓜核心种质与原群体间遗传差异比较1)Table 3. Comparisons of genetic variations between core collections constructed using eight clustering methods and the initial population of bitter gourd性状 项目 原群体 核心种质 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 第1雌 平均值 13.66 13.78 14.33 14.07 13.80 14.41 14.15 14.22 13.93 花节位 方差 16.436 30.618** 30.402** 28.773** 29.183** 27.314* 28.799** 29.063** 29.129** 变异系数 0.297 0.401 0.385 0.381 0.391 0.363 0.379 0.379 0.387 瓜纵径/cm 平均值 30.69 29.69 29.83 29.70 28.76 30.01 30.00 30.18 30.15 方差 43.074 78.911** 74.871** 61.356 65.589* 68.444* 67.415* 70.856* 68.566* 变异系数 0.214 0.299 0.290 0.264 0.282 0.276 0.274 0.279 0.275 瓜横径/cm 平均值 7.23 7.27 7.19 7.23 7.11 7.29 7.27 7.13 7.17 方差 1.468 2.929** 2.648** 2.699** 2.685** 2.744** 2.544** 2.652** 2.604** 变异系数 0.168 0.235 0.226 0.227 0.230 0.227 0.220 0.228 0.225 瓜肉厚/cm 平均值 1.16 1.19 1.18 1.21 1.17 1.18 1.17 1.18 1.19 方差 0.058 0.109** 0.101** 0.091* 0.091* 0.096* 0.097* 0.100** 0.103** 变异系数 0.207 0.277 0.270 0.250 0.257 0.262 0.265 0.266 0.269 单瓜质量/kg 平均值 0.58 0.59 0.57 0.57 0.55 0.59 0.58 0.57 0.57 方差 0.034 0.068** 0.055* 0.056* 0.052* 0.054* 0.052* 0.058** 0.055* 变异系数 0.315 0.447 0.412 0.413 0.415 0.395 0.390 0.424 0.412 1）H1~H8分别表示基于最短距离法、最长距离法、中间距离法、重心法、类平均法、可变类平均法、可变法以及离差平方和法构建的核心种质；相同性状的核心种质与原群体的均值差异均不显著（P>0.05, t检验）；*或**分别代表相同性状的核心种质与原群体的方差差异达到显著(P < 0.05) 或极显著水平(P<0.01，F测验）。 2.3 不同抽样方法构建的苦瓜核心种质比较
采用最短距离法、马氏距离和30%的抽样率，分别基于随机抽样、优先抽样和偏离度抽样方法构建苦瓜核心种质库，结果见表 4。由表 4可知，利用这3种抽样方法构建的苦瓜核心种质的均值与原群体均值相比没有显著性差异。基于3种抽样方法构建的苦瓜核心种质，5个性状的方差与原群体相比均得到不同程度地提高。采用优先抽样与偏离度抽样2种方法构建的苦瓜核心种质，所有5个性状的方差均极显著地高于原群体(P < 0.01)。采用偏离度抽样法构建的苦瓜核心种质，有3个性状（瓜横径、瓜肉厚和单瓜质量）的方差高于其他2种抽样法。采用优先抽样与偏离度抽样构建的核心种质的极差与原群体一致，采用随机抽样法构建的核心种质瓜纵径的极差低于原群体。与原群体相比，采用3种抽样方法构建的苦瓜核心种质5个性状的变异系数均有不同程度地提高，基于偏离度抽样法构建的苦瓜核心种质，其中3个性状（第1雌花节位、瓜横径和瓜肉厚）的变异系数高于其他2种抽样法。综合以上，与优先抽样和随机抽样相比，采用偏离度抽样法构建的苦瓜核心种质具有相对较大的遗传差异。
表 4 不同抽样方法构建的苦瓜核心种质与原群体间遗传变异比较1)Table 4. Comparisons of genetic variations between core collections constructed using three sampling methods and the initial population of bitter gourd性状 项目 原群体 核心种质 F1 F2 F3 第1雌 平均值 13.66 13.61 13.78 12.91 花节位 极差 27.0 27.0 27.0 27.0 方差 16.436 30.688** 30.618** 29.948** 变异系数 0.297 0.407 0.401 0.424 瓜纵径/cm 平均值 30.69 29.41 29.69 30.08 极差 39.0 32.6 39.0 39.0 方差 43.074 67.341* 78.911** 76.956** 变异系数 0.214 0.279 0.299 0.292 瓜横径/cm 平均值 7.23 7.22 7.27 7.36 极差 9.2 9.2 9.2 9.2 方差 1.468 2.990** 2.929** 3.215** 变异系数 0.168 0.240 0.235 0.244 瓜肉厚/cm 平均值 1.16 1.18 1.19 1.22 极差 1.7 1.7 1.7 1.7 方差 0.058 0.110** 0.109** 0.119** 变异系数 0.207 0.281 0.277 0.284 单瓜质量/kg 平均值 0.58 0.57 0.59 0.60 极差 1.0 1.0 1.0 1.0 方差 0.034 0.066** 0.068** 0.070** 变异系数 0.315 0.454 0.447 0.442 1) F1~F3分别表示基于随机抽样、优先抽样和偏离度抽样方法构建的核心种质；相同性状的核心种质与原群体的均值差异均不显著（P>0.05, t检验）；*或**分别代表相同性状的核心种质与原群体的方差差异达到显著(P < 0.05) 或极显著水平(P<0.01, F测验）。 2.4 苦瓜核心种质构建的结果
采用最短距离法、马氏距离、30%的抽样率和偏离度抽样法构建苦瓜核心种质，获取了46份核心种质，编号为：Y5、Y7、Y16、Y39、Y43、Y47、Y48、Y50、Y58、Y60、Y66、Y69、Y72、Y74、Y77、Y83、Y85、Y86、Y87、Y90、Y96、Y100、Y101、Y102、Y108、Y112、Y113、Y115、Y119、Y120、Y121、Y122、Y124、Y125、Y131、Y134、Y139、Y140、Y141、Y142、Y144、Y146、Y147、Y149、Y150、Y153。核心种质5个性状的均值与原群体相比没有显著差异，5个性状的方差均极显著地高于原群体，保存了原群体的极差。与原群体相比，苦瓜核心种质所有5个性状的变异系数均有不同程度地提高，获取的46份核心种质能够代表苦瓜原群体的遗传多样性。入选的核心种质Y5、Y87、Y112和Y139为苦瓜骨干材料，表明构建的苦瓜核心种质是有效的。入选的核心种质Y153与骨干材料Y152来源于同一地区，农艺性状十分相似，Y153与其他种质的遗传差异大于Y152，因此利用Y153取代骨干材料Y152配制杂交组合，能够更好地利用杂种优势，推动苦瓜种质资源的高效利用。另外，来自中国云南、中国广西、印度、斯里兰卡的苦瓜种质入选核心种质的比例较高（表 5），说明来源于这些地区的苦瓜资源具有丰富的遗传多样性。
表 5 不同来源地苦瓜种质入选核心种质所占比例Table 5. The proportions of selected core germplasms from different origins来源地 收集种质总数 入选核心种质数量 占比/% 日本 20 3 15.0 中国山东 5 0 0 中国广东 25 5 20.0 中国江西 8 1 12.5 中国海南 20 6 30.0 泰国 15 5 33.3 中国云南 10 4 40.0 中国湖南 8 1 12.5 中国广西 10 6 60.0 中国福建 18 6 33.3 斯里兰卡 5 4 80.0 印度 10 5 50.0 合计 154 46 29.9 3. 讨论与结论
作物种质资源内蕴含着丰富的遗传变异，是农业生产和新品种选育的物质基础[35]。构建核心种质库对新种质收集、种质繁殖更新及种质资源的高效利用具有重要意义。表型值不仅受基因型控制，还受环境条件的影响，基于农艺性状表型值进行遗传分类不能够准确度量种质间的遗传差异，种质资源固有的遗传结构不能够被真实地反映[36]。采用统计模型进行性状的基因型值预测，可以有效排除环境效应、基因型与环境的互作效应及试验误差。李长涛等[37]以992份水稻品种为材料，基于13个农艺性状表型数据，采用调整无偏预测法预测水稻性状的基因型值，成功构建了水稻核心种质。马洪文等[38]以250份粳稻为研究材料，基于7个数量性状的基因型预测值，有效构建了粳稻核心种质。本研究采用MLM无偏预测苦瓜5个性状的基因型效应值并计算种质间的遗传距离，从而进行聚类分析，结果更准确可靠。
为确保核心资源尽可能多地保存原种质群体的遗传结构，首先需要对原群体进行遗传分类。聚类分析常应用于种质资源的分类、亲缘关系及遗传多样性分析[39]。聚类方法主要包括最长距离法、最短距离法、中间距离法、可变类平均法、类平均法、重心法、离差平方和法和可变法等。本研究比较了8种聚类方法和3种抽样方法构建的苦瓜核心种质的优劣。研究结果表明，8种聚类方法中，采用最短距离法构建的苦瓜核心种质具有相对较大的遗传变异，能使5个农艺性状的方差和变异系数最大化，明显优于其他7种聚类方法，这与刘遵春等[22]、李慧峰等[24]、马洪文等[40]的研究结果一致；3种抽样方法中，偏离度抽样法构建的苦瓜核心种质所有5个性状的方差均大于其他2种抽样方法，并且核心种质的极差与原群体一致，优于随机抽样法和优先抽样法，这与李长涛等[37]和马洪文等[38]的研究结果一致。
通常采用分析性状的方差、均值、变异系数、极差等参数对核心种质的遗传变异进行评价。有效的核心种质各性状的均值与极差应与原群体无显著性差异，方差和变异系数应大于原群体[41]。本研究采用马氏距离、最短距离法聚类、30%的抽样率和偏离度抽样法构建了苦瓜核心种质，核心种质的均值与原群体没有显著差异，所有5个性状的方差和变异系数均比原群体有不同程度地提高，且变异幅度与原群体一致，获取的46份苦瓜核心资源保持了原群体的遗传多样性。其中来自中国云南、中国广西、印度、斯里兰卡的苦瓜种质入选核心种质的比例较高，具有丰富的遗传多样性，也进一步说明了苦瓜可能起源于印度及东南亚热带地区。在前期研究中培育的5份骨干材料中有4份材料入选核心种质。利用优良种质材料Y5、Y87、Y112、Y139配制了一系列杂交组合，其中，Y5×Y87、Y112×Y87、Y112×Y139组合综合性状表现良好。在今后的研究过程中，会进一步选取亲缘关系较远的核心材料配制杂交组合，培育优良苦瓜新品种。
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