水稻是全球约半数人口的主食，在东亚地区约有超过70%的人口以水稻为主食，水稻也是我国最重要的粮食作物，因此人们对水稻病害的研究和防治十分重视^[1]。稻瘟病俗称稻热病、火烧瘟，具有突发性、广泛性、毁灭性等特点^[2-4]；在田间发病严重，稻瘟病菌Magnaporthe oryzae是稻田中最具破坏力的病原体之一。目前对稻瘟病的防控以化学防治为主，但长期用药易导致抗性(Resistance)、再猖獗(Resurgence)和残留(Residue)的“3R”问题。研究表明，利用生物防治的方法防治植物病害，不易造成环境污染，病原物也不易产生抗药性^[5]。其中，利用植物中的活性成分防治植物病害深受研究者青睐。曾发姣等^[6]研究发现，迷迭香Rosmarinus officinalis L.及其有效成分能够抑制多种细菌和真菌的生长；梁晶等^[7]检测21种药用植物提取物的抑菌活性，发现曼陀罗Datura stramonium对3种棉花病原菌具有较好的抑菌效果。植物提取物中含有多种抑菌成分，对病原真菌具有良好的抑菌效果，因此植物提取物抑制稻瘟病菌活性的研究具有重要意义^[4-9]。薇甘菊Mikania micrantha又称小花蔓泽兰，菊科，原产于中美洲和南美洲，是一种生长迅速的多年生草本或木质藤本杂草，自1980年代开始在中国南方出现，是世界上最为有害的外来入侵物种之一^[10]，严重破坏生态平衡，被称为“植物杀手”^[11]。此生物具备传播能力强、传播速度快、环境适应性强等特性，一旦大量繁殖会对该地区的农作物及生态系统造成巨大破坏，引发农作物减产、品质下降和本地原有生物物种数量减少甚至灭绝等问题^[12-13]。研究发现薇甘菊提取物具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等作用^[14]。张威等^[15]研究发现，薇甘菊的乙酸乙酯萃取物对炭疽菌Colletotrichum sp.、正丁醇萃取物对叶点霉Phyllosticta sp.的菌丝生长有较强的抑制作用，EC₅₀分别为1.25和1.66 mg/mL。郝彩琴等^[16]研究发现，薇甘菊干样在0.09 mg/mL质量浓度下，乙酸乙酯提取物能显著抑制苹果炭疽病菌Glomerella cingulate、番茄灰霉病菌Botrytis cirerea、南瓜枯萎病菌Fusarium bulbigenum这3种植物病原真菌菌丝的生长，抑制率均在90%以上。冯惠玲等^[17]研究发现，薇甘菊干样在0.02 g/mL质量浓度下，丙酮、甲醇提取物对辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、玉米大斑病菌Setosphaeria turcica菌丝的抑制率达100%。

本文旨在针对入侵物种薇甘菊展开深入研究，探索其作为生物资源在农业病害防控中的潜在应用。鉴于当前关于薇甘菊对稻瘟病菌抑菌活性的研究报道较为匮乏，本研究采用生长速率法评估薇甘菊不同萃取物(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)对稻瘟病菌的抑菌效果，初步筛选出具有显著抑菌活性的成分。通过进一步的硅胶柱层析分离与活性追踪，探究这些组分对稻瘟病菌生长、形态及繁殖的影响机制，从而为薇甘菊的综合开发利用提供科学依据，并为稻瘟病的绿色防控策略开辟新的研究路径。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   植物材料

薇甘菊地上部分于2020年8月采自云南德宏，标本存放于云南省森林灾害预警与控制重点实验室。

1.1.2   供试菌株

稻瘟病菌ZB10由西南林业大学刘丽副教授提供。

1.1.3   供试培养基

黑麦培养基：黑麦60 g、琼脂18 g、白砂糖15 g、无菌水1 000 mL。马铃薯液体培养基：马铃薯200 g、白砂糖20 g、无菌水1 000 mL。

1.2   试验方法

1.2.1   植物提取物的制备

将薇甘菊地上部分(29 kg)风干粉碎，采用95%(φ)乙醇溶液回流提取3次，每次3 h，合并提取液用旋转蒸发仪浓缩至膏状，用蒸馏水将浸膏溶解，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，用旋转蒸发仪浓缩各萃取液得到相应的萃取物备用。乙酸乙酯萃取物采用硅胶柱层析，采用石油醚、丙酮(体积比为1∶0~0∶1)进行梯度洗脱得到14个组分：Fr₁(体积比1∶1、收集瓶1—16)，Fr₂(10∶1、收集瓶19—34)，Fr₃(10∶1、收集瓶19—34)，Fr₄(1∶1、收集瓶4—18)，Fr₅(10∶1、收集瓶4—18)，Fr₆(10∶1、收集瓶1—8)，Fr₇(20∶1、收集瓶13—17)，Fr₈(20∶1、收集瓶10—13)，Fr₉(20∶1、收集瓶1—9)，Fr₁₀(1∶1、收集瓶19—33)，Fr₁₁(2∶1、收集瓶5—8)，Fr₁₂(5∶1、收集瓶1—10)，Fr₁₃(3∶1、收集瓶3—12)，Fr₁₄(1∶1、收集瓶2—8)。称取一定量的提取物用二甲亚砜(DMSO)溶解分别配成100 mg/mL的母液，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2   抑菌活性测定

采用带毒平板法^[18]测定提取物对稻瘟病菌的抑菌活性。黑麦培养基经高压灭菌，冷却至45 ℃以下，加入经巴氏消毒的100 mg/mL母液混合均匀，使其终质量浓度为1 mg/mL。以黑麦培养基混合0.1%($\varphi $)DMSO溶液为空白对照，将6%(w)春雷霉素配制成0.05 mg/mL终质量浓度作为阳性对照。将培养到第9天的稻瘟病菌培养皿，置于无菌操作台中，从菌落边缘打菌饼(8 mm)置于平板中央，每组3次重复。用封口膜密封，倒置于28 ℃恒温培养箱培养48 h后，使用菌丝生长速率法计算提取物对稻瘟病菌的抑菌率。

1.2.3   抑菌毒力测定

在对薇甘菊乙酸乙酯萃取物的14个组分进行稻瘟病菌抑菌活性测定后，筛选出了抑菌率高于40%的组分：Fr₅、Fr₆、Fr₁₂和Fr₁₃。基于这些组分的初筛结果，进一步评估其EC₅₀。以黑麦培养基混合0.1%($\varphi $)DMSO溶液作为空白对照组，以上4个组分设定不同质量浓度梯度，测定不同质量浓度梯度下各组分的抑菌活性，以质量浓度对数为横坐标、抑菌率几率为纵坐标进行回归分析，求出毒力回归方程和EC₅₀，以此量化各组分的抑菌效果。

1.2.4   菌丝干质量测定

参考赵成萍等^[19]和梁琪^[20]的方法，稍加改进。将稻瘟病菌接种在黑麦培养基上，放置在28 ℃恒温培养箱培养9 d，将Fr₅、Fr₆、Fr₁₂、Fr₁₃这4个组分分别加至250 mL马铃薯液体培养基中，使其终质量浓度为各组分的EC₅₀，空白对照为0.1%($\varphi $)DMSO溶液。每个液体培养基中加入20个8 mm菌饼，每个处理重复3次。将处理后的液体培养基放置于180 r/min、28 ℃振荡仪中培养48 h，得到菌丝球剔除菌饼，并用无菌水在铺有双层滤纸的布氏漏斗上过滤。将过滤出的菌丝，置于60 ℃电热鼓风干燥箱烘干至恒质量，用电子天平称取菌丝干质量。

1.2.5   菌丝MDA含量测定

采用硫代巴比妥酸法测定菌丝MDA含量^[21]。取0.5 g菌丝于研钵中，加入3 mL 10%(w) TCA溶液和少许石英砂研磨至糊状，吸取溶液到离心管。用10%(w) TCA溶液定容至5 mL，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。吸取2 mL上清液，加入0.67%($\varphi $)TBA溶液，100 ℃水浴15 min，再次4 ℃、12 000 r/min离心15 min。每个处理重复3次。分别测定450、532和600 nm波长下的光密度(D)，菌丝MDA含量计算公式如下。

1.2.6   菌丝形态观察

挑取培养第9天对照组和试验组菌丝，观察稻瘟病菌形态变化，通过对比分析得出提取物对稻瘟病菌菌丝形态及生长发育情况的影响。

1.2.7   数据统计

采用SPSS 19.0软件进行相关分析，包括构建毒力回归方程，计算决定系数(R²)以量化变量间的线性关系强度，并计算EC₅₀作为衡量提取物活性的关键指标。数据采用Duncan’s法进行差异显著性分析，以P<0.05计为差异显著，数据以3次重复的“平均值±标准误”呈现。

2.   结果与分析

2.1   薇甘菊萃取物对稻瘟病菌的抑菌活性

薇甘菊不同萃取物对稻瘟病菌的抑菌效果如图1所示。培养第9天，空白对照组的稻瘟病菌已长满平板(图1A)；3种萃取物对稻瘟病菌均有抑菌效果，菌落直径均小于空白对照组，且菌落形态发生了改变(图1C~1E)。空白对照组的菌落呈灰白色，菌丝茂密且生长状况良好(图1A)；处理组的菌丝稀疏，菌落偏白色或中部出现黑色(图1C~1E)。由表1可知，阳性对照组春雷霉素的抑菌率最高，为55.24%。乙酸乙酯萃取物对稻瘟病菌的抑菌率(49.84%)显著高于正丁醇萃取物和石油醚萃取物的抑菌率(35.95%和17.54%)。结果表明，乙酸乙酯作为萃取溶剂可能更有效地保留了薇甘菊中的活性成分和其对稻瘟病菌的抑制能力。

图  1  培养第9天薇甘菊不同萃取物对稻瘟病菌的抑菌效果

Figure  1.  Antifungal effect of different Mikania micrantha extracts against Magnaporthe oxyzae at the 9th day of culture

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表  1  培养第9天薇甘菊不同萃取物对稻瘟病菌的抑菌活性

Table  1.  Antifungal activity of different Mikania micrantha extracts against Magnaporthe oxyzae at the 9th day of culture

萃取物 Extract	抑菌率1)/% Inhibition ratio	95%置信区间 95% Confidence interval
阳性对照 Positive control	55.24±0.55a	52.88~57.60
乙酸乙酯 Ethyl acetate	49.84±0.21b	48.93~50.75
正丁醇 l-Butanol	35.95±0.27c	34.77~37.13
石油醚 Petroleum ether	17.54±0.21d	16.63~18.45
1)抑菌率数据后的不同小写字母表示不同萃取物间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。 　1) Different lowercase letters after the inhibition ratio data indicate significant differences among different extracts at P<0.05 (Duncan’s method).

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2.2   薇甘菊乙酸乙酯萃取物各组分的抑菌活性

通过硅胶柱层析对抑菌活性最好的乙酸乙酯萃取物进行分离，获得14个组分，通过抑菌活性测定评估这些组分在质量浓度为1 mg/mL时对稻瘟病菌菌丝生长的影响。结果表明，14个组分显示出不同程度的抑菌作用，存在显著差异(表2)。组分Fr₅、Fr₆、Fr₁₂和Fr₁₃表现出较高的抑菌率，均超过40%；其中，Fr₁₃展现出最强的抑菌活性，其抑菌率为50.55%，显著高于其他组分。此外，Fr₁₀也显示出相对较好的抑菌效果，其抑菌率为35.31%。剩余9个组分的抑菌率均低于20%，其中Fr₄、Fr₇、Fr₈、Fr9、Fr₁₁和Fr₁₄的抑菌率介于10%~20%；Fr₁、Fr₂和Fr₃对稻瘟病菌的抑制作用较弱，抑菌率均低于10%。

表  2  培养第9天薇甘菊乙酸乙酯萃取物14个组分对稻瘟病菌的抑菌活性¹⁾

Table  2.  Antifungal activity of 14 components of Mikania micrantha ethyl acetate extract against Magnaporthe oxyzae at the 9th day of culture

组分 Component	菌落直径/mm Colony diameter	抑菌率/% Inhibition ratio		组分 Component	菌落直径/mm Colony diameter	抑菌率/% Inhibition ratio
空白对照 Blank control	50.00±0.00a	0.00±0.00n		Fr8	36.30±0.12fg	13.57±0.27j
Fr1	39.63±0.09c	5.63±0.21l		Fr9	34.67±0.26i	17.45±0.62f
Fr2	38.87±0.03d	7.46±0.08k		Fr10	27.17±0.18j	35.31±0.42e
Fr3	40.30±0.12b	4.05±0.27m		Fr11	35.57±0.24h	15.32±0.57h
Fr4	37.37±0.22e	15.48±0.27g		Fr12	24.73±0.12k	41.11±0.29d
Fr5	21.27±0.15m	49.37±0.35b		Fr13	20.77±0.18n	50.55±0.42a
Fr6	23.80±0.17l	43.33±0.41c		Fr14	36.23±0.09g	13.73±0.21i
Fr7	36.73±0.12f	12.54±0.29i
1)同列数据后的不同小写字母表示不同组分间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。 　1) Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different components at P<0.05 (Duncan’s method).

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对Fr₅、Fr₆、Fr₁₂、Fr₁₃这4个抑菌率高于40%的组分，进行不同质量浓度梯度的抑菌活性测定，分别于接种后的第3、5、7、9天统计抑菌率。各组分的抑菌率与质量浓度成正相关，随着质量浓度升高，抑菌效果也随之提升；在培养第9天时不同质量浓度提取物仍有明显抑菌效果(图2、3)。

图  2  不同培养天数时不同质量浓度Fr₅、Fr₆、Fr₁₂、Fr₁₃对稻瘟病菌的抑菌活性

各小图中相同质量浓度柱子上方的不同小写字母表示不同培养天数间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。

Figure  2.  Antifungal activity of different mass concentrations of Fr₅, Fr₆, Fr₁₂ and Fr₁₃ against Magnaporthe oxyzae on different cultivation days

Different lowercase letters on the columns of the same mass concentration in each graph indicate significant differences among different cultivation days at P<0.05 (Duncan’s method).

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图  3  培养第9天不同质量浓度Fr₅、Fr₆、Fr₁₂、Fr₁₃对稻瘟病菌的抑菌效果

Figure  3.  Antifungal effect of different mass concentrations of Fr₅, Fr₆, Fr₁₂, Fr₁₃ aganist Magnaporthe oxyzae at the 9th day of culture

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以质量浓度对数为横坐标(x)、抑菌率转换为对应的几率为纵坐标(y)拟合各组分抑菌毒力的回归方程。毒力最强的是Fr₁₃，EC₅₀为0.290~0.818 mg/mL，在第3天测定的毒力最强，随着时间推移毒力逐渐减弱；其次是Fr₁₂，EC₅₀为0.330~0.865 mg/mL，在第3天毒力最强；Fr₅次之，EC₅₀为1.428~1.856 mg/mL，在第5天的抑菌毒力最强；Fr₆的毒力最弱，EC₅₀为1.563~2.134 mg/mL(表3)。

表  3  不同培养天数4个组分对稻瘟病菌的抑菌毒力

Table  3.  Antifungal virulence of four components against Magnaporthe oxyzae on different cultivation days

组分 Component	t培养/d Cultivation days	毒力回归方程1) Toxicity regression equation	R2	EC50/(mg·mL−1)
Fr5	3	y=3.397x−0.912	0.999	1.856
	5	y=5.055x−0.782	0.982	1.428
	7	y=4.136x−0.661	0.985	1.445
	9	y=6.339x−1.446	0.990	1.691
Fr6	3	y=4.587x−0.889	0.974	1.563
	5	y=5.565x−1.483	0.978	1.847
	7	y=6.351x−1.691	0.991	1.846
	9	y=7.652x−2.519	0.990	2.134
Fr12	3	y=2.064x+0.994	0.963	0.330
	5	y=2.338x+0.582	0.965	0.564
	7	y=3.272x+0.647	0.983	0.634
	9	y=3.031x+0.191	0.964	0.865
Fr13	3	y=3.461x+1.858	0.992	0.290
	5	y=2.182x+1.135	0.968	0.302
	7	y=2.137x+0.774	0.966	0.434
	9	y=2.683x+0.234	0.981	0.818
1) x：质量浓度对数，y：抑菌率对应的几率。 　1) x: Logarithm of mass concentration, y: Corresponding odds of the inhibition ratio.

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2.3   4个组分对稻瘟病菌菌丝干质量的影响

菌丝干质量直接反映菌丝被抑制的程度。由表4可见，4个组分处理后的菌丝干质量均比对照显著降低。其中，Fr₁₃菌丝干质量变化最为明显，只有对照组干质量的9.03%；Fr₅、Fr₆、Fr₁₂这3个组分处理的菌丝干质量分别为对照菌丝干质量的19.10%、18.00%、13.23%。

表  4  4种组分处理后稻瘟病菌菌丝干质量

Table  4.  Dry mass of Magnaporthe oxyzae mycelia after treatment of four components

组分 Component	干质量1)/g Dry mass	95%置信区间 95% Confidence interval
空白对照 Blank control	0.209 4±0.003 9a	0.192 8~0.226 1
Fr5	0.040 0±0.000 6b	0.037 2~0.042 8
Fr6	0.037 7±0.000 4b	0.035 9~0.039 4
Fr12	0.027 7±0.000 9c	0.023 9~0.031 4
Fr13	0.018 9±0.000 4d	0.017 4~0.020 5
1)干质量数据后的不同小写字母表示不同组分间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。 　1) Different lowercase letters after the dry mass data indicate significant differences among different components at P<0.05 (Duncan’s method).

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2.4   4个组分对稻瘟病菌菌丝MDA含量的影响

稻瘟病菌细胞膜受损后引起膜脂过氧化反应，影响菌丝生长，MDA是反应产物之一，可以间接反映细胞膜受损程度。由图4可知，Fr₅、Fr₆、Fr₁₂、Fr₁₃这4个组分处理后的稻瘟病菌菌丝的MDA含量，均显著高于空白对照组(2.040 0 µmol/g)；表明各组分处理后，菌丝体细胞膜均有不同程度的损伤。Fr₁₃处理菌丝的受损程度最高，MDA含量为2.758 4 µmol/g，显著高于其他处理组；Fr₅处理菌丝的损伤程度最低，MDA含量为2.225 2 µmol/g；Fr₆、Fr₁₂处理菌丝的MDA含量分别为2.378 0、2.556 4 µmol/g。这些结果表明，活性组分通过诱导细胞膜脂质过氧化反应，导致稻瘟病菌菌丝的细胞膜结构受到不同程度的破坏；特别是Fr₁₃组分表现出最强的诱导脂质过氧化作用。

图  4  4个组分对稻瘟病菌菌丝MDA含量的影响

柱子上方的不同小写字母表示不同组分间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。

Figure  4.  Effect of four components on MDA content of Magnaporthe oxyzae mycelia

Different lowercase letters on the columns indicate significant differences among different components at P<0.05 (Duncan’s method).

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2.5   4个组分对稻瘟病菌菌丝形态的影响

通过显微镜观察，进一步分析不同组分处理后稻瘟病菌菌丝的形态变化。如图5所示，经Fr₅、Fr₆、Fr₁₂和Fr₁₃组分处理后的菌丝表现出明显的形态学变化。处理组的菌丝出现了明显的皱缩或弯曲现象，部分菌丝集结成网格状结构，并且菌丝变得更为细长和平滑，菌丝隔膜消失。

图  5  4个组分对稻瘟病菌菌丝形态的影响

Figure  5.  Effect of four components on morphology of Magnaporthe oxyzae mycelia

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3.   讨论与结论

目前，我国农业已进入绿色高质量发展阶段，稻瘟病的生物防治日益受到重视。Uda等^[22]研究发现芦荟Aloe vera、柑橘Citrus hystrix、沙巴蛇草(Sabah snake grass)和姜Zingiber officinale的植物提取物对水稻稻瘟病菌具有抗菌活性。Qiao等^[23]研究发现7种石蒜属Lycoris Herb.植物的球茎提取物在400 mg/L时对稻瘟病菌的菌丝生长和孢子萌发具有良好的抑制作用。Ngo等^[24]发现从杜茎山Maesa japonica (Thunb.) Moritzi植物中分离出的新三萜皂苷对稻瘟病菌具有抗真菌活性。薇甘菊提取物具有抗真菌特性，其含有多种植物成分，如生物碱、单宁和多酚、皂苷和三萜类化合物^[25]。祝木金等^[26]研究发现，薇甘菊乙酸乙酯提取物在干样质量浓度0.1 g/mL时，对苹果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜炭疽病菌Colletotrichum langenarium等8种植物病原菌的离体抑制效果高达100%；在干样质量浓度0.05 g/mL时，对小麦白粉病菌Blumeria graminis的保护效果达83.3%。

本研究对薇甘菊不同萃取物进行抑菌活性初筛，初步得出薇甘菊乙酸乙酯萃取物对稻瘟病菌有较好抑菌效果；在此基础上进一步对乙酸乙酯萃取物的14个组分进行生长速率测定，发现石油醚、丙酮体积比为10∶1、5∶1、3∶1的洗脱物有较好抑菌效果，表明具抑菌活性成分可能主要为小极性或中极性物质。本文初步探索发现薇甘菊活性组分可抑制菌丝生长，影响菌丝形态及发育；其中，Fr₁₃对稻瘟病菌的抑菌活性最好，且抑菌率随质量浓度的增加而升高。菌丝MDA含量升高，间接反映菌丝受到损伤，可能导致细胞膜结构和功能受损。显微观察发现，薇甘菊萃取物4个组分使菌丝发生畸变、菌丝隔膜消失、在一定程度上削弱菌丝的生长发育，从而抑制稻瘟病菌，但其中具体的活性成分及其抑菌机制值得深入研究。本研究利用薇甘菊萃取物抑制稻瘟病菌，以期为薇甘菊的综合开发利用提供科学依据，也为稻瘟病菌的绿色防控奠定理论基础。