番石榴Psidium guajava为桃金娘科番石榴属的常绿灌木或小乔木，原产于美洲秘鲁至墨西哥一带，传入我国至今已有300多年的历史^[1-2]。研究发现番石榴具有抗氧化、消炎、免疫调节、降糖和抗癌等多种药理活性^[2]，经济价值极高，在我国热带亚热带地区广泛种植。然而，由番石榴纳氏霉Nalanthamala psidii侵染导致的番石榴枯萎病严重限制了番石榴的生产^[3-4]。该病原隶属于丛赤壳科 Nectriaceae纳氏霉属Nalanthamala，已报道4个种，未发现有性态^[5]；虽然番石榴纳氏霉能够形成链状的分生孢子和类似青霉属Penicillium近帚状分支的分生孢子梗^[4]，但系统发育分析表明其与镰刀菌属Fuasrium和丛赤壳属Nectria真菌亲缘关系紧密，而与青霉属真菌不能聚在一个分支^[4-5]。事实上，番石榴枯萎病菌的分类地位一直比较混乱，2005年，Schroers等^[5]将来自中国台湾^[6-7]、马来西亚和南非^[8]的番石榴枯萎病菌统一鉴定为番石榴纳氏霉。随后，该病害在泰国和孟加拉等地相继发生^[9-10]，又被称为番石榴立枯病、干枯病或凋萎病。田间造成树干或大的枝条干枯直至整株枯死，是番石榴生产上为害最严重的病害^{[4, 6-10]}。现有的番石榴栽培措施及防控方法不能从根本上解决番石榴枯萎病这一生产问题，严重影响我国热带亚热带地区番石榴产业的健康发展，因此急需开展针对性的病害防控研究。

研究发现，多菌灵、噻菌灵、戊唑醇、丙环唑等杀菌剂在室内对番石榴纳氏霉引起的枯萎病菌具有很好的抑制效果，但田间药效不佳^{[6, 11]}。而生物防治方面，Schoeman等^[11]报道了在田间应用生防细菌成功地降低了番石榴枯萎病的发生率，发现蜡质芽孢杆菌Bacillus cereus S7和蜂疫杆菌Paenibacillus alvei T29混合施用可实现对病情的最佳控制。在孟加拉的研究发现，品种、嫁接方法和接穗类型均对番石榴嫁接苗的抗枯萎和生长发育有影响，红心番石榴品种较抗病，适合作为砧木^[12]。

尽管针对番石榴纳氏霉引起的枯萎病已经开展了一些防控方法研究，但在我国番石榴产区特别是枯萎病重发区，病害防控形势仍然十分严峻。该病害发生初期，症状极易与其他病原引起的枝枯病或枯萎病混淆^[13-19]。国内外已报道多种可引起番石榴枝条枯死和整株枯萎的病害，如由尖孢镰刀菌Fusarium oxysporium f. sp. psidii引起的番石榴镰刀菌枯萎病^[13]、由茄镰孢Fusarium solani和根结线虫Meloidogyne enterolobii共同为害造成的番石榴衰退病^[14]、由长喙壳属真菌Ceratocystis manginecans引起的快速凋亡^[15]、由欧文氏菌Erwinia psidii引起的细菌性枯萎病^[16]、由烟草疫霉Phytophthora nicotianae引起的整株枯死^[17]、由葡萄座腔菌Botryosphaeria rhodina侵染导致的溃疡病^[18]、由小新壳梭孢Neofusicoccum parvum造成的枝枯病^[19]等等。针对不同病原的防控方法不尽相同，误诊导致用药没有针对性是造成番石榴枯萎病防控效率低下的重要原因。

华南农业大学热带亚热带真菌研究室前期研究明确了近年在广州南沙发生的番石榴枯萎病是由番石榴纳氏霉侵染引起^[4]，本研究对广州南沙番石榴枯萎病菌番石榴纳氏霉GS-1菌株的生物学特性进行测定并展开生防细菌和防治药剂的筛选，以期为探索番石榴枯萎病的发生规律和病害防控提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   供试菌株

番石榴纳氏霉菌株GS-1^[4]、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens B2^[20]、枯草芽孢杆菌B. subtilis XX^[21]和贝莱斯芽孢杆菌B. velezensis BS^[22]，均分离并保藏于华南农业大学热带亚热带真菌研究室。

1.2   番石榴纳氏霉菌株GS-1生物学特性研究

以MM培养基为基础培养基，分别配制质量浓度为200 g/L的葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖溶液替代MM培养基中的碳源。取每皿含15 mL各种碳源的培养基制成平板，将直径为7 mm的病原菌菌饼接种于不同碳源平板中央，于28 ℃条件下培养5 d后观察菌落形态、测量菌落直径以及产孢量。

将活化的菌株GS-1接种于马铃薯果糖琼脂培养基(PFA)上，分别置于20、22、24、26、28、30、32、34 ℃的培养箱黑暗培养3 d后测量菌落直径并比较不同温度对该菌生长的影响。每个处理重复3次。

收集菌株GS-1的孢子制成含量为10³ mL⁻¹的孢子悬浮液，混匀后分装至灭菌的2.0 mL离心管中，置于不同温度(28、40、42、44、46、48、50、52 ℃)的水浴锅中处理10 min，吸取100 μL处理后的孢子悬浮液均匀涂布在PFA平板上，置于28 ℃条件下黑暗培养2 d后通过单菌落的数量判断不同温度处理对菌株GS-1孢子萌发的影响，每个处理重复3次。

用NaOH和HCl溶液调节PFA培养基的pH为3~12，经高压湿热灭菌后制成不同pH的平板，在平板中央接种直径为7 mm的GS-1菌饼，置于28 ℃培养箱黑暗培养5 d，观察菌落生长形态、测量菌落直径，每个处理重复3次。

华南沿海地区土壤中的NaCl一般不超过20 g/L，约为0.35 mol/L。在PFA培养基中加入适量的NaCl，分别制成NaCl浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L的平板，控制平板的NaCl质量浓度在40 g/L以内，将直径为7 mm的菌饼置于平板中央，28 ℃下黑暗培养5 d，观察菌落生长形态、测量菌落直径，每个处理重复3次。

1.3   番石榴纳氏霉菌株GS-1的生防菌株筛选

以已鉴定的香蕉枯萎病菌生防细菌菌株 ^[20]作为供试生防菌株进行病原菌拮抗菌株的筛选。首先应用平板对峙法初步筛选生防菌株，用灭菌牙签蘸取少许生防菌株的菌液在距离病原菌菌饼约5 cm处划线，置于28 ℃条件下倒置培养5 d，观察并记录抑菌效果。将具有明显拮抗作用的生防菌株进一步应用生长速率法进行复筛。取一接种环生防菌株的菌液至100 mL液体LB培养基中，置于28 ℃、180 r/min培养12 h，然后离心菌体并用孔径为0.22 μm的细菌过滤器过滤得到生防菌株滤液。将滤液和PFA按体积比1∶9混合制作平板，接菌饼于平板中央，对照组用无菌水替代。待对照组菌落长满培养皿后测得处理组直径，计算抑制率。

1.4   番石榴纳氏霉菌株GS-1的拮抗药剂筛选

供试药剂选用针对番石榴病害效果相对较好的6种杀菌剂，且均为原药，分别为98% (w) 吡唑醚菌酯(沈阳化工研究院)、99% (w) 代森锰锌(沈阳化工研究院)、92.1% (w) 霜霉威盐酸盐(江门植保公司)、78.7% (w) 春雷霉素(江门植保公司)、97% (w) 甲基硫菌灵(江苏蓝丰生物化学有限公司)和98% (w) 甲霜灵(沈阳化工研究院)。

将上述6种药剂配制成10 mg/mL的母液，4 ℃条件下保存。所用药剂梯度稀释成菌株GS-1所需测定的浓度，其中春雷霉素使用无菌水进行稀释，吡唑醚菌酯、代森锰锌、霜霉威盐酸盐、甲基硫菌灵和甲霜灵均使用二甲基亚砜(DMSO)进行稀释，分别设置6个质量浓度梯度。吡唑醚菌酯为0.312 5、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000 μg/mL；代森锰锌为3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000 μg/mL；霜霉威盐酸盐为25、50、100、200、400、800 μg/mL；春雷霉素为25、50、100、200、400、800 μg/mL；甲基硫菌灵为0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000 μg/mL；甲霜灵为0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000 μg/mL。

采用菌丝生长速率法之含毒介质法测定。分别吸取对应质量浓度的供试杀菌剂1 mL于50 mL离心管，加入灭菌并冷却至50 ℃的培养基定容至10 mL，摇匀，倒入平板并晾干备用，对照组培养基加入等量的无菌水，每个处理设置3个重复。用灭菌的直径5 mm打孔器打取新鲜菌饼若干，用无菌牙签挑取1块菌饼，菌丝面朝下接种于含药培养基正中央。密封培养基，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养4 d。菌落直径采用十字交叉法测量，计算抑菌率。

数据采用Excel软件进行统计分析，以杀菌剂浓度对数值为自变量x，以抑菌率的概率值为因变量y，计算出药剂的毒力回归方程、相关系数和药剂对病菌的抑制中浓度EC₅₀。

2.   结果与分析

2.1   番石榴纳氏霉菌株GS-1的生物学特性

测定不同碳源对病原菌GS-1菌株生长和产孢的影响，结果(图1)发现在MM培养基的基础上，以果糖作为碳源时菌株GS-1生长最快，菌落直径可达7.4 cm，产孢量也较多，为1.2×10⁶ mL⁻¹；甘露醇作为碳源时生长最慢，菌落直径仅为5.8 cm，且菌丝较为稀疏，但产孢量最大达到1.4×10⁶ mL⁻¹。而葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖作为碳源时生长较缓慢，产孢量远远低于以果糖和甘露醇作为碳源时。可见，番石榴纳氏霉最适生长碳源为果糖，最适产孢碳源为甘露醇和果糖。

图  1  不同碳源对番石榴枯萎病菌GS-1生长的影响

各图中，柱子上方不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)

Figure  1.  Effects of different carbon sources on the growth of Nalanthamala psidii GS-1

In each figure, different lowercase letters on columns indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method)

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不同温度对GS-1的生长测定结果(图2)表明，在28~34 ℃的环境温度下GS-1生长均较快速，30 ℃为最适生长温度，接种3 d就能长满整个培养皿；而20 ℃生长最慢，菌落直径只有2 cm左右。这也表明30 ℃以上的气候条件更有利于病原菌的生长。

图  2  不同温度对番石榴枯萎病菌GS-1生长的影响

柱子上方不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)

Figure  2.  Effects of different temperatures on the growth of Nalanthamala psidii GS-1

Different lowercase letters on columns indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method)

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经不同温度处理后，由图3可知，GS-1的分生孢子经28~46 ℃处理后大量萌发，而48~50 ℃处理后只有极个别的孢子可以萌发和生长，但当温度提升至52 ℃时，分生孢子彻底丧失萌发和生长的能力，因此该病原菌分生孢子的致死温度为52 ℃。

图  3  番石榴枯萎病菌GS-1孢子的耐热性

Figure  3.  Heat tolerance of spores of Nalanthamala psidii GS-1

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由图4可知，GS-1在pH为4的PFA平板上，已不能正常生长，6是病原菌最适生长pH；而当pH达到8~12时，病原菌仍能保持一定的生长能力，显示出了较强的耐碱性。

图  4  不同pH对番石榴枯萎病菌GS-1的生长影响

柱子上方不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)

Figure  4.  Effects of different pH on the growth of Nalanthamala psidii GS-1

Different lowercase letters on columns indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method)

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结果（图5）表明，盐浓度对病原菌GS-1的生长有明显的抑制作用。当盐浓度达到0.3 mol/L时，菌丝的生长明显受到抑制，当盐浓度达到0.4 mol/L(已超华南沿海土壤含盐量水平)时，GS-1仍能保持一定的生长能力，表明其具有一定的耐盐性。

图  5  不同NaCl浓度对番石榴枯萎病菌GS-1生长的影响

柱子上方不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)

Figure  5.  Effects of different NaCl concentrations on the growth of Nalanthamala psidii GS-1

Different lowercase letters on columns indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method)

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2.2   番石榴纳氏霉菌株GS-1生防菌的室内筛选

通过拮抗菌与GS-1的平板对峙培养筛选，结果发现供试的解淀粉芽孢杆菌 B2、枯草芽孢杆菌XX和贝莱斯芽孢杆菌 BS对病原菌GS-1均有明显的抑制效果(图6A)。为进一步量化和比对这3株生防菌的生防效果，我们比较了生防菌发酵滤液BS对病原菌GS-1的抑制生长试验，结果(图6B~6D)发现解淀粉芽孢杆菌B2对病原菌GS-1的抑制生长效果最佳，抑制率达到88.1%；其次是枯草芽孢杆菌XX，抑制率为77.8%；贝莱斯芽孢杆菌BS的抑制率为35.5%。

图  6  不同生防菌株对番石榴枯萎病菌GS-1的平板对峙抑制效果(A)和生长抑制效果(B~D)

BS：贝莱斯芽孢杆菌，B2：解淀粉芽孢杆菌，XX：枯草芽孢杆菌；C、D图中，柱子上方不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)

Figure  6.  The plate confrontation inhibition effect (A) and growth inhibition effect (B, C and D) of different biocontrol strains on Nalanthamala psidii GS-1

BS: Bacillus velezensis, B2: B. amyloliquefaciens, XX: B. subtilis; In figure C and D, different lowercase letters on columns indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method)

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2.3   番石榴纳氏霉菌株GS-1对6种杀菌剂的室内敏感性测定

用6种不同药剂对病原菌GS-1进行室内敏感性测定， 结果见表1，EC₅₀越小，病原菌对药剂越敏感。6种药剂对番石榴纳氏霉菌株的EC₅₀排序为春雷霉素 > 霜霉威盐酸盐 > 代森锰锌 > 甲基硫菌灵 > 甲霜灵 > 吡唑醚菌酯。在6种药剂中，吡唑醚菌酯和甲霜灵的EC₅₀分别为0.4912和0.8805 μg/mL，低于1 μg/mL，敏感性较高；代森锰锌和甲基硫菌灵的EC₅₀分别为24.6578和24.5999 μg/mL，敏感性略低；霜霉威盐酸盐EC₅₀为7379.3042 μg/mL，敏感性较低；春雷霉素EC₅₀为44193.1643 μg/mL，敏感性最低。本研究同时也使用97% (w) 的咪鲜胺原液稀释至低浓度进行药剂敏感性测定试验，结果发现GS-1在咪鲜胺浓度为0.0004 μg/mL的条件下不生长，表明番石榴纳氏霉菌株对咪鲜胺的敏感性最强。

表  1  番石榴枯萎病菌GS-1对6种不同药剂的敏感性

Table  1.  Sensitivity of Nalanthamala psidii GS-1 to six types of fungicides

杀菌剂 Fungicide	毒力回归方程1) Toxicity regression equation	EC502)/ (μg·mL−1)	相关系数 Correlation coefficient
吡唑醚菌酯 Pyraclostrobin	y = 5.19561 + 0.63355x	0.4912c	0.9995
甲霜灵 Metalaxyl	y = 5.135 00 + 2.44163x	0.8805c	0.9827
甲基硫菌灵 Thiophanate-methyl	y = 4.11042 + 0.63956x	24.5999c	0.9608
代森锰锌 Mancozeb	y = 3.09376 + 1.36947x	24.6578c	0.9895
霜霉威盐酸盐 Propamocarb hydrochloride	y = 3.82053 + 0.30493x	7379.3042a	0.9630
春雷霉素 Kasugamycin	y = 3.32901 + 0.42801x	44193.1643b	0.9273
1) x表示药剂质量浓度的对数值，y表示抑菌率的概率值；2) 同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 (P< 0.05，Duncan’s法) 　1) x indicates logarithm value of the mass concentration of the fungicide, y indicates corresponding mortality probability value; 2) Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P< 0.05, Duncan’s method)

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3.   结论与讨论

番石榴枯萎病菌GS-1的生物学特性研究结果表明，PDA培养基中的葡萄糖并非该病原菌生长的最适碳源，这也是虽然田间病害发生相当严重，但一直未能分离到该病原菌的原因。综合来看，最适合该病原菌生长和产孢的碳源为果糖；30 ℃和pH=6的弱酸环境是该菌生长的最佳条件，超过48 ℃病原菌的孢子萌发严重受阻，52 ℃时孢子完全失去活性；GS-1菌丝在0.4 mol/L NaCl条件下仍保持一定的生长能力，说明病原菌具有一定的耐盐性。综上所述，番石榴枯萎病菌适应范围较广，温度较高、中性偏弱酸的环境条件更利于其快速生长和繁殖。

伤口是番石榴纳氏霉侵染番石榴并致病的关键^{[4, 7]}。而番石榴栽培过程中果树枝条修剪和台风也会造成大量的伤口，加剧病原菌的侵染。因此，在广州可选择台风较少的冬天，温度较低时修剪果树，同时配合必要的植保措施，可大大降低该病原菌地传播与蔓延。

仅仅通过农业栽培措施进行番石榴枯萎病的防控是远远不够的。生物防治因无污染、无残留、对人和动植物无害等优点广泛应用于植物病害防控。其中，芽孢杆菌可以产生多种如细菌素、抗菌肽、脂肽类、氨基酸类、核酸类等抑菌活性物质，诱导植物抗病而被广泛应用于防控植物病害^[23]。研究发现用生防菌防控由尖孢镰刀菌引起的番石榴枯萎病时，解淀粉芽孢杆菌的效果最显著，其次是哈茨木霉和荧光假单胞菌的混合使用，生防菌的应用大大提高了番石榴枯萎病的防治效率，替代了诸如多菌灵、代森锰锌和戊唑醇等化学农药的使用^[24-25]。本研究通过生防菌株筛选，发现芽孢杆菌对番石榴纳氏霉菌的生长有明显抑制作用，是较为理想的生防材料。其中，解淀粉芽孢杆菌B2的抑制效果最佳，室内筛选的抑制率达到88.1%，其次为枯草芽孢杆菌XX，抑菌率最低的是贝莱斯芽孢杆菌BS。这3株生防细菌对香蕉枯萎病菌也有良好抑菌效果^[20-22]，这可为广州南沙发现的香蕉和番石榴枯萎病病害的统一防控提供参考。

邵雪花等^[19]对由小新壳梭孢菌引起的番石榴枝枯病菌进行杀菌剂的毒力测定和田间防效试验，发现30% (w) 咪鲜胺抑菌能力最强，30% (w) 咪鲜胺和60% (w) 苯醚甲环唑的预防作用、治疗效果及田间防效最好。本研究中番石榴枯萎病菌对咪鲜胺的敏感性最强，因此，推荐咪鲜胺作为田间同时防治番石榴枯萎病和枝枯病的首选杀菌剂。生产上药剂防治番石榴枯萎病可以优先交替选用咪鲜胺等咪唑类、吡唑醚菌酯等甲氧基丙烯酸类和甲霜灵等苯胺类杀菌剂。

Suwan等^[26]研究发现番石榴枯萎病菌对多菌灵、苯菌灵和萎锈灵等杀菌剂的敏感性较高；Leu等^[6]发现戊唑醇、丙环唑等杀菌剂在室内对番石榴纳氏霉具有良好的抑制效果；而Schoeman等^[11]的研究结果表明，多菌灵、敌菌丹和噻苯唑等杀菌剂在实验室条件下对番石榴纳氏霉菌抑制效果较好，但这些杀菌剂的田间试验抑制效果并不明显。这可能与病原菌主要通过根侵染而发病的特性有关^[7]。本研究筛选的对番石榴枯萎病菌GS-1敏感的杀菌剂能否在田间具有同样的防治效果还需进一步地研究探索。