苦楝Melia azedarach又名翠树、楝树、紫花树、森树等，为楝科楝属落叶乔木，分布于中国、韩国、日本、印度、斯里兰卡、印度尼西亚和澳大利亚等地，欧洲、美洲也有栽培^[1].苦楝在我国分布广泛，水平分布为北纬18° ~ 40°，南至海南省崖县，北到河北保定和山西运城、陕西渭南、陇南地区，东至台湾、沿海各省，西到四川、云南保山^[2].它生长速度快、木材材质优良、纹理美丽，易加工，可用于家具、建筑、农具、船舶、乐器制作等方面，木材抗白蚁、抗虫蛀、耐腐.苦楝耐烟尘，能大量吸收有毒有害气体，是优良的城市及工矿区绿化树种，也是我国南方四旁绿化常用树种^[3-4].苦楝的根、皮、花、果均可入药，也可作为植物源农药^[5].遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，SRAP（Sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性）结合了AFLP及RAPD各自的优点，方便快速，只需要极少量DNA材料，且不需要预先知道DNA序列信息，即可快速获得大量的信息，试验结果稳定可靠，且再现性较高，重复性较好^[6-7].目前为止，国内对于苦楝的遗传多样性分析，鲜见开展过SRAP的研究.本试验采用单因素和正交试验设计从DNA、dNTPs、Mg²⁺、引物和TaqDNA聚合酶5个组分浓度对苦楝SRAP-PCR反应体系进行优化，旨在寻找一种高效、快速、经济的试验方法，建立适合苦楝的SRAP-PCR反应体系，为进一步应用SRAP技术对苦楝群体遗传多样性、种质资源鉴定等研究提供参考^[7].

1.   材料与方法

1.1   材料

苦楝幼叶于2013年7月取自华南农业大学苗圃，随用随采，用于苦楝基因组DNA的提取，采集叶片分别为海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸种源.所用正向引物序列为Me19（TGAGTCCAAACCGGTTG）和Me27（TGGGGACAACCCGGCTT），反向引物序列为Em2（GACTGCGTACGAATTTGC）、Em4（GACTGCGTACGAATTTGA）和Em5（GACTGCGTACGAATTAAC）.

1.2   主要试剂和仪器

用于SRAP-PCR反应的Taq酶、dNTPs、Mg²⁺为TaKaRa公司产品，引物由北京华大基因研究中心合成，PCR反应在东胜创新生物技术有限公司的PCR扩增仪上进行，DNA浓度和纯度使用超微量紫外分光光度计（Thermo Nanodrop 2000）检测.

1.3   基因组DNA的提取

苦楝基因组DNA提取参照上海生工生物工程有限公司柱式基因组DNA提取试剂盒说明书进行.所提取的基因组DNA用8 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳检测品质，并采用超微量紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，然后将DNA稀释至50 ng·μL^-1，置于-20 ℃条件下保存备用.

1.4   PCR扩增

SRAP-PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min.扩增产物采用20 g·L^-1的琼脂糖凝胶电泳，电泳后在自动凝胶图像分析仪上拍照分析.

1.5   PCR反应体系单因素分析

对影响苦楝SRAP-PCR反应的主要因素（模板DNA、dNTPs、Mg²⁺、引物和Taq酶）进行单因子试验.对各影响因子分别设置8个梯度处理：模板DNA为0、10、20、30、40、50、60和70 ng；dNTPs为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mmol · L-1；Mg²⁺为0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 mmol·L^-1；引物为0、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56和0.64 μmol·L^-1；Taq DNA聚合酶为0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 U.

1.6   PCR反应体系的正交试验

在对影响苦楝SRAP-PCR反应的模板DNA、dNTPs、Mg²⁺、引物和Taq酶进行单因子试验后采用L16（4⁵）正交试验设计，共16个处理，每个处理设2个重复，各因素水平见表 1.根据电泳条带的多少、清晰度及背景颜色进行打分.最优的得5分，最差的得1分，并计算每个因素在不同水平下的平均得分^[8].

表  1  SRAP-PCR正交试验设计L 16（4⁵）及试验结果

Table  1.  L 16(45) Orthogonal designs and results of SRAP-PCR reaction

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2.   结果与分析

2.1   单因素试验分析

以SRAP-PCR反应产物电泳得到的条带数目较多且清晰为筛选原则，对反应体系中起主要作用的5个因素进行单因素浓度梯度筛选试验^[9-12]，每个因素设置8个浓度梯度.试验结果表明：在25 μL反应体系中，模板DNA为25 ~ 40 ng、dNTPs为0.125 ~ 0.200 mmol·L^-1、Mg²⁺为1.75 ~ 2.25 mmol·L^-1、引物为0.40 ~ 0.52 μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶为0.50 ~ 1.25 U时扩增效果好，条带较多且清晰，故将其选为后续正交试验的适宜浓度范围.

2.2   苦楝SRAP-PCR正交反应体系的优化

以上述单因素试验确定的各因素适宜浓度范围为基础，采用L 16（4⁵）正交设计对SRAP-PCR反应体系进行优化（表 1），并根据电泳条带的多少、清晰度及背景颜色（图 1）对16个处理进行打分，打分结果如表 1所示，从2次的得分来看，重复间差异不大，试验的一致性较好，其中处理5、处理7、处理8和处理9效果较好，评分均为4分，而处理15效果不好，评分仅为1.0分.从图 2可见，模板DNA 30 ng、dNTPs 0.125 mmol·L^-1、Mg²⁺ 2.25 mmol·L^-1、引物0.48 μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶0.75 U、反应总体积25 μL时得分较高，实现最佳扩增，确定为最优组合.

图  1  SRAP-PCR反应体系正交试验结果

M：DNA maker DL2000；1 ~ 16：处理1 ~ 16（陕西蒲城种源）.

Figure  1.  Amplified patterns of the SRAP-PCR based on orthogonal design

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图  2  模板DNA、dNTPs、Mg²⁺、引物、Taq DNA聚合酶与平均得分的关系

Figure  2.  Relationship between concentrations and mean scores of template DNA, dNTPs, Mg²⁺, primer and Taq polymerase

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2.3   苦楝SRAP-PCR反应体系稳定性的检测

为了验证体系的准确性，以来自海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸的8个苦楝种源DNA为模板，选取引物Me27/Em2、Me27/Em4进行SRAP-PCR验证，其结果如图 3所示，每个种源对每个引物均有清晰的条带，且不同种源间条带有差异.由此可见，本试验建立的SRAP-PCR体系稳定可靠，适用于苦楝后续的SRAP分析.

图  3  SRAP-PCR反应体系稳定性检测

M：DNA maker DL2000；1 ~ 8：引物Me27/Em2；9 ~ 16：引物Me27/Em4；自1和9开始，从左到右依次为海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸种源DNA.

Figure  3.  The verification of Melia azedarach SRAP-PCR reaction system

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3.   结论

本试验建立并优化了适应苦楝SRAP-PCR的反应体系，前期对苦楝模板DNA、Mg²⁺、引物和Taq酶进行单因子试验，研究发现，SRAP对苦楝DNA浓度的要求不高，有一个较宽的浓度适宜范围，在25 μL体系中，模板DNA为10 ~ 70 ng时都扩增出了较清晰、带型基本相同的谱带；dNTPs设计的8个浓度梯度中，0.1 ~ 0.2 mmol·L^-1范围内能扩增出清晰谱带，且条带基本相同，浓度低于0.1 mmol·L^-1时，扩增条带弥散，高于0.2 mmol·L^-1时，出现条带丢失的现象；Mg²⁺为2.00 mmol·L^-1左右时扩增条带较清晰且数量多；引物介于0.48 ~ 0.64 μmol·L^-1之间均能产生较为清晰的条带，且带型基本上保持一致，条带数并没有随着浓度的增加而增加；Taq DNA聚合酶用量在0.50 ~ 2.0 U范围内均可以得到清晰的带型，对其用量要求不高.进一步对苦楝SRAP-PCR的反应体系进行正交试验，并根据电泳条带的多少、清晰度及背景颜色对16个处理进行打分，从2次的得分来看，重复间差异不大，试验的一致性较好，其中处理5、处理7、处理8和处理9效果较好，评分均为4.0分，而处理15效果不好，评分仅为1.0分.根据得分可知，在25 μL反应体系中，当模板DNA 30 ng、dNTPs 0.125 mmol·L^-1、Mg²⁺ 2.25 mmol·L^-1、引物0.48 μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶0.75 U时，实现最佳扩增，确定为最优组合.以来自海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸的8个苦楝种源DNA为模板，选取引物Me27/Em2、Me27/Em4进行SRAP-PCR反应体系稳定性验证，结果表明，筛选体系能很好地满足苦楝基因组SRAP-PCR扩增的要求且不同种源间条带有差异.