马大杂种相思Acacia mangium×A. auriculiformis属含羞草科Mimosaceae金合欢属Acacia^[1]，主要分布在气温12~35 ℃, 年降水量1 200~1 850 mm和海拔50~350 m的地区^[2].马大杂种相思具速生、固氮、涵养水源、极度抗瘠薄等优点，且树干通直、分枝细小，是城市绿化、营造高效生态混交林的优良种植材料，近年来在我国南方逐渐受到重视.

目前，对马大杂种相思离体快繁技术研究已有报道，但这些研究对选择具有优良性状的母株作为外植体来源缺乏重视^[3]；且有效增殖倍数低、芽苗质量较差、增殖芽可用于生根诱导的数量极少^[4]；移栽存活率仅80.4%^[5].本试验从马大杂种相思多年生试验林中进行单株选优，对其离体快繁技术进行了系统研究，成功建立了高效、高质的快繁体系，可应用于工厂化育苗，为马大杂种相思的良种选育及推广种植奠定基础.

1.   材料与方法

1.1   植株来源和试验材料

选取马大杂种相思16年生抗风直杆型优良单株(AMA12001)，先通过扦插繁殖获得较多的无性系材料，然后以其当年新生枝条的带腋芽茎段为外植体进行研究.

1.2   试验方法

1.2.1   外植体消毒和初代培养

最佳消毒时间的确定：于质量分数为0.1%的升汞溶液中分别处理外植体9、12、15 min, 再分别用体积分数为75%的乙醇处理5、15、30 s，无菌水冲洗4~6次.

最佳外植体部位的确定：分别将枝条的第1~2节嫩茎(上)、第3~5节嫩茎(中)、第7~8节嫩茎(下)剪成长1.0~2.0 cm带腋芽茎段.

将消毒后的外植体接种在MS培养基上，每个处理接种60瓶，每瓶接种1株芽，重复3次，15 d后统计存活率和出芽率.

1.2.2   丛生芽诱导和增殖培养

6-BA、NAA单因子对增殖的影响：6-BA选择0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L^-1 4个质量浓度，探讨细胞分裂素对增殖的影响；NAA选择0.05、0.10、0.50 mg·L^-1 3个质量浓度，附加6-BA 1.0 mg·L^-1，探讨生长素对增殖的影响.

6-BA、NAA不同质量浓度组合对增殖的影响：设置培养基中的6-BA与NAA质量比例为40:1、30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、3:1、2:1，探讨细胞分裂素与生长素不同质量浓度比例组合对增殖的影响.

基本培养基、活性炭质量浓度、糖浓度单因子对增殖的影响：基本培养基类型选择MS、1/2MS、改良MS; 糖质量浓度选择20、30和40 g·L^-1；活性炭选择0.1、0.5和1.0 mg·L^-1.以上培养基均附加上一步骤筛选出的最佳激素浓度配比.

每处理均接种20瓶，每瓶接种3株芽，重复3次，35 d后调查增殖倍数.

1.2.3   最佳生根方法筛选

高质量浓度激素浸泡法：将长2~3 cm的增殖芽在添加IBA 200、400、600、800和1 000 mg·L^-15个质量浓度的固体培养基上分别预培养4和8 h后，转接入1/2MS培养基中继续培养.

低质量浓度激素诱导法：将长2~3 cm的增殖芽接入含不同类型基本培养基、不同质量浓度活性炭及蔗糖、不同低质量浓度激素的培养基中进行不定根的诱导.

每个处理均接种20瓶，每瓶接种3株芽，重复3次，培养15 d后统计生根率、生根条数.

1.2.4   移栽和驯化

生根培养10~15 d后，炼苗5~10 d，洗净根部的培养基后移栽到经消毒过的营养袋中，移栽基质选择黄心土.

1.3   培养条件

以上试验除特殊说明外，增殖培养以MS为基本培养基，生根培养以1/2MS为基本培养基，均添加琼脂7 g·L^-1、蔗糖30 g·L^-1，控制pH为5.5~6.5，培养基均在121 ℃高压灭菌15 min，培养温度为(25±2) ℃，每日光照12 h，光照度2 500 lx.

1.4   统计分析

使用Excel、SPSS18.0对数据进行处理和方差分析，以最小显著差数法(LSD)评价差异的显著性.

2.   结果与分析

2.1   外植体消毒对初代培养的影响

2.1.1   不同处理时间对初代培养的影响

带腋芽茎段是最理想的组培外植体材料，其诱导的芽遗传变异小，能保持亲本的优良性状^[6].本试验以带腋芽茎段为外植体，消毒效果见表 1.处理1至处理3(升汞消毒9 min)的消毒时间偏短，导致污染率偏高，存活率偏低；随着升汞消毒时间的增加，污染率逐渐降低，存活率逐渐上升，当选用15 min升汞配合30 s乙醇(处理9)消毒时，其褐化率虽然较高，但污染率仅6.67%，存活率达78.33%，是最适宜的消毒方案.

表  1  升汞及乙醇不同处理时间对初代培养的影响¹⁾

Table  1.  Effects of sterilization time on initial culture

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2.1.2   不同部位的外植体对初代培养的影响

外植体污染率、褐化率和芽诱导率受枝条的木质化程度影响较大.木质化程度越高，污染率越高，新生顶芽内生菌含量少，但材质娇嫩，容易被消毒剂杀死.枝条中上部半木质化的茎段出芽率高^[7]，且污染率低^[8]，本试验(表 2)也发现中段(第3~5个腋芽)半木质化茎段污染率和褐化率都较低，且出芽率较高，因而当年生新枝第3~5个腋芽茎段是理想的外植体材料.

表  2  不同外植体来源及部位对初代培养的影响¹⁾

Table  2.  Effects of different sampling positions on initial culture

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综上所述，剪取枝条的中部(第3~5个腋芽)作为外植体，用体积分数为75%的乙醇和质量分数为0.1%的升汞分别消毒30 s、15 min，是获得马大杂种相思无菌材料的最佳途径.将无菌茎段接入MS基本培养基初代培养10 d后，腋芽开始萌动，30 d调查时新芽长约为2~4 cm(图 1A)，可用于增殖培养.

图  1  马大杂种相思快繁体系

A：初代培养；B：增殖培养；C：生根培养；D：移栽.

Figure  1.  Processes of in vitro propagation of Acacia mangium×A. auriculiformis

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2.2   丛生芽诱导与增殖培养基筛选

2.2.1   6-BA、NAA单因子对增殖的影响

增殖培养10 d左右从基部腋芽处开始冒出新芽，且茎段基部逐渐变粗.第35天时调查可知(表 3)，增殖倍数随6-BA浓度的增加而增加，当6-BA质量浓度为1.0~1.5 mg·L^-1时，增值倍数均达到3以上，且6-BA质量浓度为1.5 mg·L^-1时，增殖倍数较高，芽长势较好；但当质量浓度达到2.0 mg·L^-1时，芽玻璃化现象严重，有效芽减少.而NAA对芽生长起主要作用，随着NAA质量浓度的升高，芽体长势变好，当NAA质量浓度为0.5 mg·L^-1时，芽生长健壮，生长速度快，但增值倍数低；而NAA质量浓度为0.1 mg·L^-1时的增殖倍数最高，芽的长势也较好.

表  3  不同比例的6-BA、NAA对增殖的影响

Table  3.  Effects of various concentrations of 6-BA and NAA on proliferation

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2.2.2   6-BA、NAA不同浓度组合对增殖的影响

腋芽的增殖不只受6-BA和NAA的绝对值影响，还受二者的比值影响^[9]，试验结果经方差分析表明，6-BA与NAA的质量比对马大杂种相思增殖倍数的影响达到极显著水平，增殖倍数随着二者比值的增加呈先上升后下降的趋势，m(6-BA):m(NAA)在2:1至10:1范围时，增殖倍数普遍较低，但芽的长势健壮，生长速度快.m(6-BA):m(NAA)为20:1至40:1时，腋芽处萌发出大量的丛生芽，但芽丛矮小，玻璃化现象严重，有效芽数目随比值的增加而减少，因此，在此质量比范围时，增殖倍数呈现下降趋势，且芽品质变差.而当m(6-BA):m(NAA)为15:1时(即6-BA为1.5 mg·L^-1、NAA为0.10 mg·L^-1)，诱导的增殖芽一方面具有长势健壮的特点，又具有较高增殖倍数的优势，是试验筛选出较适宜的激素浓度比例.

表  4  6-BA与NAA不同质量浓度组合对增殖的影响

Table  4.  Effects of different combinations of 6-BA and NAA on proliferation

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2.2.3   基本培养基、活性炭浓度、糖浓度单因子对增殖的影响

由表 5可知，活性炭、蔗糖质量浓度对增殖的影响达极显著水平，而培养基类型对增殖的影响不显著.随着活性炭质量浓度的增加，增殖倍数明显下降，但芽生长情况越来越好，甚至有部分芽开始生根，因此，当发现增殖芽出现玻璃化现象时，可将芽转移至添加有较低质量浓度活性炭(0.04 g·L^-1)的培养基中进行增殖培养，从而改善增殖芽质量；随着蔗糖质量浓度的增加，玻璃化现象也会得到缓解，有效芽数增多，芽的健壮程度也提升，当蔗糖质量浓度为30和40 g·L^-1时显著优于蔗糖为20 g·L^-1时的增殖效果，不仅增殖倍数较高，芽长势也较好；试验发现，虽然培养基类型对增殖倍数影响不大，但改良MS上的芽叶片更绿，生长也更健壮.

表  5  不同添加剂对增殖的影响

Table  5.  Effects of different additives on proliferation

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综合以上试验结果，马大杂种相思比较适宜的增殖培养基为改良MS+6-BA 1.5 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1+蔗糖30~40 g·L^-1，培养35 d可获得3.97的有效增殖倍数，且芽体较健壮(图 1B).在工厂化生产中，多次继代需要添加适量的Ac来改善芽苗生长情况，减小玻璃化现象发生.

2.3   生根诱导

2.3.1   高质量浓度激素浸泡法(两步生根法)

将在含有高质量浓度IBA的MS培养基预培养4、8 h的芽接入无激素的MS培养基后，第5天即可见白色圆点冒出，第10天时调查结果见表 6.两步生根法生根效果普遍较好，不仅生根率高，平均生根数也较多.虽然不同质量浓度的IBA对生根率的影响达显著、极显著水平，但IBA200~800 mg·L^-14个组诱导的生根效果总体差异不显著，芽长势也无明显区别；随着IBA质量浓度的升高，生根率呈先上升后下降趋势，而生根数逐渐增多，当IBA为1 000 mg·L^-1时，基部形成大量愈伤组织，根系过于发达，导致苗长势较差(表 6).比较发现，4和8 h的预培养时间对生根效果并无显著差别，但预培养8 h的芽生根数略多，总体的生根率也较高.当选择IBA 600 mg·L^-1预培养4~8 h后再转接至MS中，生根率可达100%，且苗较健壮，是较好的处理方法.

表  6  两步生根法结果¹⁾

Table  6.  Results of the two-step rooting method

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2.3.2   低质量浓度激素诱导法

将2~3 cm长的增殖芽接入Ⅰ型至Ⅵ型生根培养基中，4~5 d后基部出现白点，6~7 d开始生根，15 d根最长, 可达6.5 cm.由表 7可知，Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅵ型这3种培养基的生根效果均极显著高于另3种培养基，而添加了0.1和0.5 mg·L^-1活性炭的Ⅱ型和Ⅲ型培养基虽然平均根长要远高于其他组，但生根率却比不添加活性炭的低17.07%和40.50%；此外，蔗糖质量浓度为30 g·L^-1的生根效果(Ⅰ)要优于10 g·L^-1(Ⅳ)；1/2 MS(Ⅴ)比MS(Ⅰ)更利于不定根的诱导；IBA 1.5 mg·L^-1(Ⅵ)比IBA 1.0 mg·L^-1(Ⅴ)诱导的根数要多，但根系太发达反而会抑制苗的生长；由此可见，不添加活性炭的Ⅴ型培养基诱导马大杂种相思不定根效果最好，不仅生根率达99.4%，且根系较长，有须根，苗健壮.

表  7  不同培养基的生根效果¹⁾

Table  7.  Effects of different media on rooting

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综上所述，马大杂种相思增殖苗生根可采用2种办法.方法1，用两步生根法，将增殖苗接入含IBA600 mg·L^-1的固体培养基上预培养4-8 h后接种到1/2MS基本培养基上，15 d即可全部生根.方法2，直接将较健壮的增殖苗接入1/2 MS + IBA 1.0 mg·L^-1 + NAA 0.5 mg·L^-1+蔗糖30 g·L^-1培养基上，第15天时生根率可达99.43%(图 1C).从节约成本，缩减操作程序的角度出发，方法2更利于工厂化生产.

2.4   驯化与移栽

生根培养10~15 d后，苗长至2~4 cm，根长达2~3 cm，在自然条件下炼苗5~10 d后，将苗根部的培养基洗净，移植于经高锰酸钾消毒过的5种基质的营养袋中，5种基质分别为：黄心土、黄心土:沙(体积比分别为3:1、2:1、1:1)、沙，盖膜保湿.1周后揭开薄膜，1个月后调查其存活率分别为94.67%、94.00%、96.00%、96.00%、93.33%，均在90%以上(图 1D)，以黄心土:沙(体积比为2:1、1:1)生根率最高，在实际生产过程中，含沙量较多的营养杯在上山造林的运输过程中，容易松散，使得造林存活率低，因而，移栽基质应尽可能考虑黄心土.至此，马大杂种相思的组培快繁体系基本建立(图 1).

3.   讨论与结论

3.1   影响外植体消毒的相关因子

外植体消毒成功与否，不仅与消毒剂的处理时间有关，也与外植体采集时间、外植体部位等因素有关，本试验发现半木质化枝条的中上部节段是最理想的外植体部位，春末夏初的晴朗天气采条可以降低污染.与赵建萍等^[10]、张玮等^[11]的研究结果一致.

3.2   影响增殖效果的相关因子

想要获得高增殖倍数和短增殖时间，必须选择合适的细胞分裂素和生长素质量浓度^[12].本试验发现6-BA 1.5 mg·L^-1、NAA 0.1 mg·L^-1是最佳的适宜马大杂种相思增殖的激素质量浓度，不仅增殖倍数较高，芽体也较健壮.

较高的激素质量浓度易使芽玻璃化，且外源调节剂对植物作用的时效较长^[13]，多次继代会使芽苗增殖缓慢、质量变差，可通过改变基本培养基类型、适当提高蔗糖质量浓度、适当降低激素质量浓度、添加低质量浓度的活性炭解决.

3.3   影响生根效果的相关因子

IBA与NAA组合使用可明显提高生根率，改善根的质量和苗的生长情况^[14]，本研究也证明，用IBA 1.0 mg·L^-1 + NAA 0.5 mg·L^-1可获得较好的生根效果.

Otroshy等^[15]认为合适质量浓度的活性炭可提供暗环境、吸附激素和其他有害物质，利于植株生长.本试验发现，活性炭的存在确实能促进苗的生长，但一定程度上抑制了马大杂种相思不定根的形成，导致生根率下降，具体机理还有待相关研究证明.

蔗糖是生根培养基的重要组成部分，对维持培养基的渗透压具有重要作用.本试验还发现降低蔗糖质量浓度对根的生长影响较大，10 g·L^-1的蔗糖质量浓度对根的生长不利，且苗生长缓慢，在生根培养基中添加30 g·L^-1的蔗糖生根效果更佳.

从节约生产成本、简化操作程序的角度来说，即使两步生根法可使马大杂种相思组培苗的生根率达到100%，却不宜采用，但对其他生根较困难的相思树种来说，是值得尝试的生根方法.