芥菜农杆菌高效遗传转化体系初步建立

    曹必好,雷建军,宋洪元,秦耀国

    曹必好,雷建军,宋洪元,秦耀国. 芥菜农杆菌高效遗传转化体系初步建立[J]. 华南农业大学学报, 2003, 24(4): 48-51. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2003.04.013
    引用本文: 曹必好,雷建军,宋洪元,秦耀国. 芥菜农杆菌高效遗传转化体系初步建立[J]. 华南农业大学学报, 2003, 24(4): 48-51. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2003.04.013
    CAO Bi-hao~1,LEI Jian-jun~1,SONG Hong-yuan~2,QIN Yao-guo~1. Initial Establishment of Efficient and Stable Mustard Transgenic System Mediated with Agrobacterium tumefacciens[J]. Journal of South China Agricultural University, 2003, 24(4): 48-51. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2003.04.013
    Citation: CAO Bi-hao~1,LEI Jian-jun~1,SONG Hong-yuan~2,QIN Yao-guo~1. Initial Establishment of Efficient and Stable Mustard Transgenic System Mediated with Agrobacterium tumefacciens[J]. Journal of South China Agricultural University, 2003, 24(4): 48-51. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2003.04.013

    芥菜农杆菌高效遗传转化体系初步建立

    基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30270912)

    Initial Establishment of Efficient and Stable Mustard Transgenic System Mediated with Agrobacterium tumefacciens

    • 摘要: 采用农杆菌导入法,探讨了影响芥菜农杆菌遗传转化效率的因素,优化了参数,初步建立了以MS 6-BA(2.0mg/L) NAA(0.2mg/L)为分化培养基,预培养时间3或4d,共培养时间4d,农杆菌浓度D600nm为O.5,浸菌时间10min,筛选压Kan为25mg/L的遗传转化体系。
    • 奶牛养殖业在畜牧业发展中具有极其重要的地位[1]。集成化、智能化和标准化养殖已成为保证奶牛进食量、提高牛奶产量及保障乳制品品质的必然选择[2]。对于奶牛饲养,自由采食能提高饲料摄入量和牛奶产量,但奶牛进食时易将饲料拱出饲喂区,造成饲料的分散,不利于奶牛的进食。这样不仅浪费饲料,最重要的是影响奶牛的营养摄入量,最终影响产奶量和产奶质量[3-4]。目前,国外很多牛场采用以Lely、Valmetal公司的PRO-FEED为代表的推料机器人,Lely推料机器人[5]通过旋转的圆柱形外壳将饲料推回到栏杆下,PRO-FEED推料机器人[6]是螺旋式结构,通过滚动的螺旋式叶片将饲料推回到栏杆下。这两种机器人在推进过程中能对饲料进行一定的搅拌,推料效果较好,但结构复杂、加工难度大。现如今国内牛场养殖的推料方式有三种,一是人工扫料,二是人工驾驶的刮板式推料车,三是自走式推料机器人[7]。3种推料工作中,传统的人工扫料方式劳动强度大,需要投入大量的人力[8]。张勤等[9]研发的基于信息融合的智能推料机器人是采用刮板的推料方式,虽然刮板式推料车刮板小、结构简单、便于操作,但推料效果一般,且在纵向方向上有推料现象,影响奶牛采食。现有的自旋式推料机器人[5]推料效果较好,没有漏料情况,但推料效率较低;螺旋式推料机器人推料效率较高,但推料效果不好,有漏料现象。

      对于皮带式推料机,具有代表性的是德国RMH-futterschieber皮带式推料机,针对含水率高、撒料量和撒料面积大的青饲料的推料效果较好。因此,本文对皮带式推料机结构进行设计,并对其推料过程进行仿真试验,为自动推料机实际推料作业参数提供参考。该研究利用离散元软件EDEM创建颗粒实体的参数化模型,此外,将材料力学特性和其他物理特性添加到EDEM中,形成颗粒模型和力学分析过程;基于Design-Expert软件进行正交试验设计,运用EDEM在不同试验条件下对皮带式推料机进行虚拟试验仿真和分析,探究推料机推料过程中物料颗粒群的运动规律,分析推料机不同推料角度、皮带速度、前进速度3个试验因素对推送率和推送效率的影响,以期为寻求推料机推料最优参数组合提供一定的指导。

      可变角度皮带式推料机器人主要由大容量锂电池、机器人主体部分、控制系统、精料抛撒装置、TMR搅拌撒料装置、激光雷达、RGB相机和IMU以及皮带式推料机组成,整机结构如图1所示。

      图  1  推料机器人结构简图
      1:机器人主体部分,2:控制系统,3:精料抛撒装置,4:TMR饲料搅拌装置,5:RGB相机和IMU,6:激光雷达,7:皮带式推料机
      Figure  1.  Structure sketch of pushing robot
      1: The main part of the robot, 2: Control system, 3: Concentrate throwing device, 4: TMR feed stirring device, 5: RGB camera and IMU, 6: LiDAR, 7: Belt type pusher

      工作时,首先,推料机器人融合RGB和雷达信息智能识别牛舍饲料带,控制机器人沿着饲料带自主行走;其次,根据饲料带是否存在饲料,机器人控制推料电机带动推料皮带转动,皮带上的推板将草料推回饲料带,从而完成推料作业。

      皮带式推料机采用的是立式结构,外形尺寸长×宽×高为1 000 mm × 460 mm × 550 mm。如图2所示,皮带式推料机主要由1个伺服电机、2个滚筒、软质PVC带、推料机支撑架和可变角度连接架组成。

      图  2  皮带式推料机结构图
      1:滚筒,2:皮带,3:伺服电机,4:张紧装置,5:皮带机支撑架
      Figure  2.  Structure sketch of belt pusher
      1: Roller, 2: Belt, 3: Servo motor, 4: Tensioning device, 5: Belt conveyor support frame

      其中,滚筒的尺寸直接影响其与皮带的接触面积与摩擦力,这将影响皮带推料效率。滚筒的直径越大,皮带与滚筒的接触面积越大,两者之间的摩擦力越大,皮带运动越稳定。然而,滚筒直径过大会导致设备整机尺寸增大,增大能量消耗。因此,本设计选用的滚筒直径为155 mm、高度为450 mm、材质为碳钢、壁厚为2.5 mm,滚筒表面采用车床粗加工,以增加表面的摩擦力,满足推料作业的实际需求,三维模型如图3所示。

      图  3  滚筒结构图
      Figure  3.  Roller structure diagram

      TMR饲料于2024年4月取自山东省泰安市岱岳区满庄镇泥沟村的金兰奶牛养殖牧场,分别在撒料1、2、3 h后进行取料,含水率(w)为55%~70%。

      利用TMR饲料休止角对饲料间的恢复系数进行仿真标定试验,间接得出饲料间的恢复系数。采用排出法对TMR饲料的休止角进行测定,如图4所示。将一定量的饲料装入无底圆筒中,向上提升圆筒使饲料缓慢排出,待料堆稳定后,测量料堆竖直高度(h)与底面直径(d)的尺寸大小,通过公式(1)计算其休止角[10],试验重复3次取平均值,测得休止角为45°~47°,平均46.75°。为降低摩擦因数对测量结果的影响,圆筒材质选用钢制。

      图  4  休止角测定
      h:料堆竖直高度,d:料堆底面直径
      Figure  4.  Determination of rest angle
      h: Vertical height of feed pile, d: Basal diameter of feed pile

      休止角计算公式:

      $$ \varphi = {\tan ^{ - 1}}\dfrac{{2h}}{d} 。 $$ (1)

      通过饲料与皮带、饲料与地面间的滑动摩擦角,可以仿真标定饲料与皮带、饲料与瓷砖地面间的恢复系数。饲料滑动摩擦角测量所用仪器为斜面仪,摩擦面材料为PVC皮带和瓷砖。将所取饲料样本放置在水平摩擦面上,缓慢匀速转动手柄,使摩擦面一端缓慢上升,避免振动。如图5所示,当饲料试样开始向下滑动时,记录此时的摩擦面倾角,即为饲料滑动摩擦角(θ)。测得饲料与皮带间的滑动摩擦角平均值为37°,饲料与瓷砖间的滑动摩擦角平均值为42°。

      图  5  滑动摩擦角测量
      θ:饲料滑动摩擦角
      Figure  5.  Measurement of sliding friction angle
      θ: Sliding friction angle of feed

      使用MXD-2型摩擦因数试验仪,测定饲料之间、饲料与皮带之间以及饲料与瓷砖地面之间的动、静摩擦系数,如图6所示。测定饲料之间的动、静摩擦系数时,将饲料用胶水平整均匀地固定在水平试验台上,并在试验仪滑块底面也均匀粘固一层饲料,使2个面上的饲料平整接触,启动试验仪后2个接触面上的饲料产生相对移动,滑块产生一定距离的相对移动后,仪器根据摩擦力的大小自动计算摩擦系数。试验重复5次取平均值,结果如表1所示。

      图  6  摩擦系数测定
      Figure  6.  Determination of friction coefficient
      表  1  试验测定摩擦系数
      Table  1.  Determination of friction coefficient by tests
      参数
      Parameter
      饲料与饲料
      Feed and
      feed
      饲料与皮带
      Feed and
      belt
      饲料与地面
      Feed and
      ground
      静摩擦系数
      Static friction
      coefficient
      0.54 0.75 0.80
      滚动摩擦系数
      Rolling friction
      coefficient
      0.85 0.40 0.48
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      采用试验测试与离散元仿真相结合的方法对饲料进行仿真参数标定及优化。试验时,以实测的休止角、滑动摩擦角为响应值设计中心组合试验方案,利用Design-Expert软件分析各因素的编码值和数据,对各项进行方差分析和回归系数显著性检验,分析仿真参数对仿真结果的影响,确定饲料EDEM的最优参数。TMR饲料仿真离散元模型建立方法如下。

      1)TMR饲料模型。由作物秸秆、球形米粒和青贮块组成奶牛饲料,并进行仿真建模。采用理想球形颗粒组合法对实际物料进行替代。对混合物料几何尺寸进行实测并取平均值[11],3种球形填充物料颗粒的直径分别设为12、10和8 mm。物料离散元模型如图7a~7c所示。

      图  7  物料颗粒离散元模型
      Figure  7.  Discrete element models of material particles

      2)接触模型。利用EDEM软件对推料作业进行仿真。由于不考虑传热及磨损等问题,选用Hertz Mindlin(no slip)模型作为离散元仿真中饲料颗粒与皮带的接触模型[12]

      3)碰撞恢复系数仿真标定试验。利用EDEM离散元参数标定对饲料堆积过程进行仿真,如图8所示;对饲料滑动摩擦角测定过程进行仿真,如图9所示。通过优化碰撞恢复系数,使饲料仿真堆积过程的休止角与实际休止角一致,以及饲料仿真过程的滑动摩擦角与实际滑动摩擦角一致,从而预测碰撞恢复系数,为推料仿真分析提供基础数据[13]

      图  8  TMR饲料堆积过程模拟
      Figure  8.  Simulation of TMR feed stacking process
      图  9  TMR饲料滑动摩擦角测定过程模拟
      θ:饲料滑动摩擦角
      Figure  9.  Simulation of TMR feed sliding friction angle measurement process
      θ: Sliding friction angle of feed

      4)仿真参数。TMR饲料模型参数包括材料参数和接触参数。其中,材料参数包括TMR饲料、皮带、地面的密度、泊松比、剪切模量等[5, 10, 14-15],具体数值如表2所示。

      表  2  物料特性参数
      Table  2.  Property parameters of materials
      材料
      Material
      密度/(kg·m−3)
      Density
      泊松比
      Poisson’s ratio
      剪切模量/Pa
      Shear modulus
      饲料 Feed 700 0.30 2.30×107
      皮带 Belt 1 380 0.45 2.40×108
      地面 Ground 1 500 0.20 1.25×1010
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      通过以上测量试验、仿真测定及查阅相关文献,得到饲料与饲料之间、饲料与推料皮带装置之间、饲料与瓷砖地面之间的碰撞恢复系数均为0.30。

      为便于推料仿真的计算,本研究去除了与物料运动无接触关系的部件。推料机的皮带与饲料直接接触,其材质为软质PVC材料,将其导入EDEM中,如图10所示。

      图  10  皮带式推料机仿真模型
      Figure  10.  Simulation model of belt type grass pusher

      根据表12和标定的碰撞恢复系数设置仿真参数,通过动态生成的方式在颗粒工厂中生成物料颗粒,设定颗粒总质量为180 kg,作物秸秆、球形米粒、青贮块的质量比为35∶10∶55。

      根据相关文献[14]可知,推送率随着饲料含水率的增加而增大。本研究推料机皮带速度、推料角度以及前进速度的定义图如图11所示。

      图  11  三因素定义图
      Figure  11.  Three-factor definition diagram

      在推料机构作用下,饲料颗粒间相互作用,饲料颗粒沿着皮带表面速度方向运动。如图12所示,当推料角度为0°时,饲料运动轨迹垂直运动方向,若运动速度增大会将未及时推送到饲喂区的饲料向斜前方推送,出现饲料分布不均匀现象;随着推送角度增大,饲料运动轨迹开始向斜后方运动,在一定前进速度下,饲料可以更好地被推到原位置;但当推料角度超过30°时,会出现将已推过去的饲料带到皮带后面的现象。

      图  12  物料颗粒在各个角度的运动方向
      各小图中的箭头指饲料运动方向
      Figure  12.  Movement direction of the material particles at various angles
      The arrows in each figure indicate the movement direction of feed

      选取推送率(Y1)和推送效率(Y2)作为推料效果的评价指标,计算方式如公式(2)和(3)。设置图13中阴影区域的颗粒质量为150 kg,仿真完成后对未被推到撒料带的饲料进行统计。

      图  13  试验设计示意图
      Figure  13.  Schematic diagram of experiment design
      $$ {Y}_{1}=\dfrac{m-{m}_{_{{0}}}}{m}\times 100{\text{%}} \text{,} $$ (2)
      $$ {Y}_{2}=\dfrac{m-{m}_{_{{0}}}}{{t}} \text{,} $$ (3)

      式中,m:推送前阴影区域饲料的质量,kg;$m_{_{{0}}} $:推送后未推到撒料带饲料的质量,kg;t:推料时间,min。

      以推料机推料角度(x1)、皮带速度(x2)和前进速度(x3)为研究因素,设计三因素三水平试验表,如表3所示。

      表  3  试验因素水平表1)
      Table  3.  Table of test factor and level
      水平
      Level
      x1/(°) x2/(m·s−1) x3/(m·s−1)
      −1 0 1 0.5
      0 15 2 1.0
      1 30 3 1.5
       1)x1:推料角度,x2:皮带速度,x3:前进速度
       1) x1: Pushing angle, x2: Belt speed, x3: Forward speed
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      以各因素编码值x1x2x3为自变量,Y1Y2为目标值,试验设计与结果如表4所示。

      表  4  推料仿真试验设计与结果1)
      Table  4.  Design and results of pushing simulation experiment
      序号
      Serial number
      x1 x2 x3 Y1/% Y2/(kg·min−1)
      1 0 1 1 92.6 833.4
      2 1 1 0 96.5 579.0
      3 −1 0 1 91.8 826.2
      4 1 −1 0 93.3 559.8
      5 1 0 1 92.0 828.0
      6 −1 1 0 94.8 568.8
      7 0 0 0 93.5 561.0
      8 0 −1 −1 93.9 281.7
      9 −1 −1 0 91.1 546.6
      10 1 0 −1 95.8 287.4
      11 0 0 0 94.0 564.0
      12 −1 0 −1 95.1 285.3
      13 0 −1 1 89.7 807.3
      14 0 0 0 93.9 563.4
      15 0 0 0 94.3 565.8
      16 0 1 −1 98.1 294.3
      17 0 0 0 95.0 570.0
       1) x1:推料角度,x2:皮带速度,x3:前进速度,Y1:推送率,Y2:推送效率
       1) x1: Pushing angle, x2: Belt speed, x3: Forward speed, Y1: Pushing rate, Y2: Pushing efficiency
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      对各因素与推送率和推送效率的关系进行方差分析和回归系数显著性检验,结果如表56所示。依据表5,利用响应面法建立推送率与试验因素编码值的关系模型为

      表  5  推料仿真试验推送率响应面方差分析
      Table  5.  Variance analysis of response surface of pushing rate in material pushing simulation test
      来源
      Source
      平方和
      Square
      sum
      自由度
      Freedom
      degree
      均方
      Mean
      square
      F P1)
      模型
      Model
      64.08 9 7.12 15.44 0.000 8**
      x1 2.88 1 2.88 6.25 0.042 0*
      x2 24.50 1 24.50 53.15 0.000 2**
      x3 35.28 1 35.28 76.53 <0.000 1**
      x1x2 0.06 1 0.06 0.14 0.723 6
      x1x3 0.06 1 0.06 0.14 0.723 6
      x2x3 0.42 1 0.42 0.92 0.370 3
      x12 0.01 1 0.01 0.03 0.867 0
      x22 0.10 1 0.10 0.23 0.648 6
      x32 0.70 1 0.70 1.52 0.257 9
      残差
      Residual error
      3.23 7 0.46
      失拟项
      Misfit term
      1.98 3 0.66 2.10 0.240 0
      纯误差
      Pure error
      1.30 4 0.31
      总和
      Sum
      67.30 16
       1)“*”“**”分别表示在P<0.05和P<0.01水平影响显著(方差分析)
       1) “*” and “**” indicate significant effects at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively (Analysis of variance)
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      Y1=94.140 0+0.600 0x1+1.750.0 x2−2.100 0x3−0.125 0x1x2−0.125 0x1x3+0.325 0x2x3−0.057 5x12−0.157 5x22−0.408 0x32

      表5可知,推送率与试验因素编码值之间的关系是极显著的(P<0.01),失拟项影响不显著(P>0.05),表示模型合理。其中x1对推料率影响显著,x2x3对推送率影响极显著,其余各项都影响不显著。从单因素分析来看,各因素对推送率的影响由大到小为x3>x2>x1。从各因素交互作用来看,交互作用项对推送率的影响由大到小为x2x3>x1x3>x1x2

      各因素的交互作用对推送率的响应面如图14。当推料角度在中间水平时,推送率随皮带速度增加而增大;当皮带速度在中间水平时,推送率随推料角度增加而增大。当推料角度在中间水平时,推送率随前进速度增加而明显降低;当前进速度在中间水平时,推送率随推送角度增加而增加。当前进速度在中间水平时,推送率随皮带速度增加而明显增高。

      图  14  各因素对推送率的响应面图
      Figure  14.  Response surface graph of various factors to pushing rate

      依据表6,利用响应面法建立推送效率与试验因素编码值之间的关系模型为

      表  6  推料仿真试验推送效率响应面方差分析
      Table  6.  Variance analysis of response surface of pushing efficiency in material pushing simulation test
      来源
      Source
      平方和
      Square
      sum
      自由度
      Freedom
      degree
      均方
      Mean
      square
      F P1)
      模型
      Model
      5.77×105 9 64 117 3 484 <0.000 1**
      x1 93.16 1 93.16 5.06 0.060 0
      x2 802.00 1 802.00 43.60 0.000 3**
      x3 5.76×105 1 5.76×105 31 293 <0.000 1**
      x1x2 2.25 1 2.25 0.12 0.736 9
      x1x3 0.02 1 0.02 0.00 0.973 1
      x2x3 45.56 1 45.56 2.48 0.159 6
      x12 1.67 1 1.67 0.09 0.771 9
      x22 15.52 1 15.52 0.84 0.388 9
      x32 322.00 1 322.00 17.50 0.004 1**
      残差
      Residual error
      128.79 7 18.40
      失拟项
      Misfit term
      83.72 3 27.91 2.48 0.200 8
      纯误差
      Pure error
      45.07 4 11.27
      总和
      Sum
      5.77×105 16
       1)“**”表示在P<0.01水平影响显著(方差分析)
       1) “**” indicates significant effect at P<0.01 level (Analysis of variance)
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      Y2=564.840+3.410x1+10.010x2+268.280x3−0.750x1x2−0.075x1x3+3.380x2x3+0.630x12−1.920x22−8.740x32

      表6可知,推送效率与试验因素编码值之间的关系是极显著的(P<0.01),失拟项影响不显著(P>0.05);这表明模型合理,可以用来预测推料机推送效率。其中,x2x3x32对推料机推送效率影响极显著,其余各项均不显著。从单因素分析来看,各因素对推送效率的影响由大到小为x3>x2>x1。从各因素交互作用来看,交互作用项对推送效率的影响由大到小为x2x3>x1x2>x1x3

      各因素的交互作用对推送效率的响应面如图15。推料角度和皮带速度对推料效率的影响不明显。当推料角度和皮带速度分别在中间水平时,推料效率都会随着前进速度增加而明显增高。

      图  15  各因素对推送效率的响应面图
      Figure  15.  Response surface graph of various factors to pushing efficiency

      以推料机的推送率和推料效率最大为目标值,通过响应面法进行优化求解,得到推料机理论最优作业参数水平组合:推料角度30°、皮带速度2.99 m/s、前进速度0.83 m/s。在此作业参数下,推送率和推送效率分别为94.6%、724.5 kg/min。

      图16所示,在泰安市金兰奶牛场进行试验,选取推料机理论最优作业参数水平组合和仿真结果较好的2组试验参数进行试验。每次推料前对图13阴影区域TMR饲料的质量进行记录,推料作业完成后收集未推到撒料区的TMR饲料并称质量,推料过程中TMR饲料水分损失忽略不计,每组试验重复3次。选取推送率和推送效率作为推料效果的评价指标,将结果与EDEM仿真试验结果做对比,测试皮带式推料机器人在真实工作情况下的推料效果。

      图  16  试验设备与环境
      Figure  16.  Test equipment and environment

      利用TMR饲料进行试验,推料机器人3次推料试验推送率为91%~96%,推送效率为720~820 kg/min。当推料前进速度为1.5 m/s时,机器人推料效率最高;但是当皮带速度低于2 m/s时,皮带无法及时完成推料作业,导致大量饲料堆积在皮带前方。当推料机器人推送到位的饲料较少,剩余饲料会导致饲料流反向运动,造成饲料分布不均匀。前进速度和皮带速度一定时,当推料角度为0°时,饲料运动轨迹是斜前方,当推送角度逐渐增大时,饲料运动轨迹逐渐向斜后方运动,但是推送角度过大会导致出现将已推过去的饲料带到皮带后面的现象,即漏料现象。当皮带速度为3 m/s时,无论推料机器人的前进速度是高速还是低速,在3个工作角度下的推料效果都是良好的;在皮带高速转动的情况下,皮带通过摩擦力和皮带表面凸起将饲料从一侧带动到另一侧,高速转动的皮带能快速地将饲料推送到指定位置,从而验证了本文的推料机推料效果可以满足牧场需求。实际试验结果与仿真结果基本一致,验证了推料机结构和作业参数的合理性。

      针对目前国内采用螺旋式推料机器人对含水率高、撒料量多的TMR饲料推料效果不好等问题,研制了一种皮带式推料机,采用旋转的皮带将饲料推回到奶牛采食区域。皮带式推料机试验表明,推送效率达到牧场的要求,仿真模拟结果为皮带式推料机的动力学分析和参数优化提供了参考。

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    出版历程
    • 修回日期:  2002-12-16
    • 刊出日期:  2003-10-09

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