Resistance and metabolic pathway of Spodoptera frugiperda population to beta cypermethrin in Sichuan
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摘要:目的
探究四川地区草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda种群对高效氯氰菊酯的抗药性及代谢途径。
方法采用点滴法测定四川地区草地贪夜蛾米易(MY)、德昌(DC)、苍溪(CX)、会东(HD)和仁和(RH)种群对高效氯氰菊酯的抗药性水平，采用光电比色法和RT-qPCR测定细胞色素P450酶(Cytochrome P450 enzymes，P450s)、羧酸酯酶(Carboxylesterases，CarE)、谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase，GST) 3种解毒代谢酶的活性及基因表达量，采用皮尔逊相关性系数分析高效氯氰菊酯抗药性与酶活性、基因表达的相关性，并通过液相色谱−质谱(High performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)分析经LD50高效氯氰菊酯处理的MY种群(试验组)和未经处理的MY种群(对照组)的高效氯氰菊酯代谢产物差异。
结果MY种群对高效氯氰菊酯的抗性倍数(Resistance ratio, RR)最高，为4.02倍，其LD50为84.201 μg/g。CarE、GST、P450s活性均随抗性升高而升高，CES12、GST epsilon9、CYP6B50基因表达量显著上调且与高效氯氰菊酯抗药性显著相关。对照组和试验组代谢差异产物有3−苯氧基苯甲酸(3-PBA)、邻苯二酚、癸酸、甲基−2, 3−二氢−3, 5−二羟基−2−氧代−3−吲哚乙酸。其中，3-PBA只在试验组中检出，在对照组中未被检出，推断高效氯氰菊酯通过草地贪夜蛾体内酶将高效氯氰菊酯代谢为3-PBA，3-PBA在单加氧酶催化下，在苯环上引入2个羟基，生成邻苯二酚。[结论]草地贪夜蛾可能通过上调解毒代谢酶相关基因的表达，提高酶活性，从而增强对高效氯氰菊酯的解毒代谢能力，降低农药的毒效。
Abstract:ObjectiveTo investigate the resistance and metabolic pathways of beta cypermethrin in fall armyworm (Spodoptera frugiperda) populations in Sichuan.
MethodThe resistance levels of fall armyworm to beta cypermethrin in MY, DC, CX, HD and RH populations in Sichuan were determined by drip method. The activities and gene expressions of three kinds of detoxification metabolic enzymes, such as cytochrome P450 enzymes (P450s), carboxylesterases (CarE) and glutathione S-transferase (GST), were determined by photoelectric colorimetric method and RT-qPCR. The Pearson correlation coefficient was used to analyze the correlation of beta cypermethrin resistance with enzyme activity and gene expressions. The differences in beta cypermethrin metabolic products between the MY population treated with LD50 beta cypermethrin (the experimental group) and the untreated MY population (the control group) were analyzed by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS).
ResultThe MY population showed the highest resistance ratio (RR) to beta cypermethrin, the RR was 4.02 times and the LD50 was 84.201 μg/g. The activities of CarE, GST and P450s increased with the increase of beta cypermethrin resistance, and the expression levels of CES12, GST epsilon9 and CYP6B50 genes were significantly up-regulated and significantly correlated with beta cypermethrin resistance. The metabolism differential products in the control group and the experimental group were 3-phenoxybenzoic acid (3-PBA), pyrocatechol, capric acid, methyl-2, 3-dihydro-3, 5-dihydroxy-2-oxo-3-indoleacetic acid. Among them, 3-PBA was only detected in the experimental group and not in the control group. It was inferred that beta cypermethrin was metabolized into 3-PBA through the enzyme activity of fall armyworm, 3-PBA was catalyzed by monooxygenase, two hydroxyl groups were introduced into benzene ring, and then pyrocatechol was finally generated.
ConclusionSpodoptera frugiperda may up-regulate the expression of genes associated with detoxification enzymes, leading to increased enzyme activities. This enhanced detoxification capacity accelerates the metabolic degradation of beta cypermethrin, thereby reducing the pesticide’s efficacy.
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Keywords:
- Spodoptera frugiperda /
- Beta cypermethrin /
- Detoxification enzyme /
- HPLC-MS /
- Metabolic pathway
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在全球气候变暖以及人类活动的共同影响下，干旱已成为限制玉米生长以及产量的重要因素之一[1-2]。东北地区是我国玉米主要产区，但近些年来东北地区干旱愈发严重，对玉米产量造成了极大的威胁[3]。在我国玉米的整个生长周期中，抽雄期至吐丝期是玉米的需水临界期，对干旱胁迫反应最为敏感，此期间的水分亏缺会在很大程度上影响玉米的产量。雄穗作为玉米的主要生殖器官，其发育程度与产量有着密切联系[4-5]。
在干旱条件下，玉米雄穗将从外部形态结构以及内部生理状态等一系列方面发生变化从而适应干旱逆境[6]；宋凤斌等[7]认为干旱胁迫会导致玉米雄穗抽出缓慢甚至不能抽出，雄穗分枝数以及大小也均会受到影响。关于干旱胁迫对玉米生理特性方面的影响，前人做了大量研究，发现干旱胁迫会造成植株体内产生大量活性氧分子，破坏抗氧化系统与活性氧之间的平衡，同时会导致细胞膜蛋白质以及酶结构的损伤[8]。为了避免过度干旱而导致细胞内部环境紊乱，植株体内会产生一系列防御机制。杨娟等[9]模拟干旱胁迫对玉米叶片的研究发现抗氧化系统酶在消除细胞内过多氧自由基方面发挥了积极作用；Liu等[10]、Zaher-Ara等[11]和杨晓龙[12]研究发现，干旱胁迫下渗透调节物质的存在能够有效地维持植株细胞内外渗透压平衡，提高作物抗逆性，对抵御逆境胁迫同样起着关键作用。在干旱胁迫下，玉米雄穗抽出与雌穗吐丝的时间间隔将会增大，此间隔被称为抽雄吐丝间隔[13]，郭江等[14]认为抽雄吐丝间隔与产量具有密切联系。因此，探究干旱胁迫对玉米雄穗发育特征和产量的影响以及应对措施具有重要意义。
关于干旱胁迫对玉米生长及生理特性的影响，前人已做了许多研究，但大多数只探讨了干旱胁迫对玉米植株生长形态以及对穗位叶生理特性的影响[15-16]，对玉米雄穗形态特征和生理特性影响的研究还相对较少。因此，本试验共设置2种土壤处理以及4种水分梯度，通过测定不同处理的玉米抽雄吐丝间隔、雄穗形态结构、雄穗生理指标以及产量，来探究并明确干旱胁迫对玉米雄穗发育特征及产量的影响，确定施用土壤改良剂的效果，从而为中国东北地区玉米种植抗旱保产提供一定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 试验设计
试验地位于吉林农业大学资源与环境学院田间试验培养场(43°47′42″N，123°20′45″E)，供试土壤为盐碱土，0~20 cm土壤理化性质如下：pH (水、土质量比 1∶2.5) 8.3，有机质16.14 g/kg，碱解氮31.44 mg/kg，速效磷7.23 mg/kg，速效钾88.76 mg/kg。
供试作物为玉米，品种为‘富民985’。试验共设置2种土壤处理，分别是供试土壤施用无机肥料(原土处理)以及供试土壤施用无机肥料后添加土壤改良剂(添加土壤改良剂处理)，并于玉米大喇叭口期至吐丝期进行不同程度的干旱胁迫处理，干旱胁迫共持续20 d左右，土壤含水量梯度水平分别是正常供水(CK，保证土壤含水量大于田间持水量的80%)、轻度干旱胁迫(LD，保证土壤含水量维持在田间持水量的70%~80%)、中度干旱胁迫(MD，保证土壤含水量维持在田间持水量的60%~70%)以及重度干旱胁迫(SD，保证土壤含水量维持在田间持水量的50%~60%)。胁迫期间采用便携式土壤水分测定仪定期检测土壤含水量，根据含水量进行补水，保证胁迫期间土壤含水量在所设范围内。2种土壤处理土壤水分基础数据如表1所示。
为消除单个试验数据搜集可能产生的误差，盆栽盆的位置随机排列，并定期调换位置。每个处理设置3次重复，每次重复设置3盆。盆高35 cm，每盆装土16 kg，肥料用量根据田间施用量计算为每盆施入尿素5.9 g，磷酸二铵3.4 g，硫酸钾4.0 g。
表 1 2种土壤处理土壤水分基础数据Table 1. Basic data of soil moisture in two soil treatments土壤处理
Soil treatment含水量/%
Water content田间持水量/%
Field water capacity饱和含水量/%
Saturated water content容重/(g·cm−3)
Bulk density萎蔫系数/%
Wilting coefficient原土
Original soil3.55±0.04 17.53±0.22 35.33±0.95 1.47±0.04 8.83±0.08 添加土壤改良剂
Adding soil conditioner7.72±0.12 23.19±0.28 40.81±0.24 1.48±0.12 7.22±0.11 1.2 测定方法
1.2.1 玉米抽雄吐丝间隔测定
观察记录各玉米植株雄穗开花期以及雌穗吐丝期，计算抽雄吐丝间隔[13]。
1.2.2 玉米雄穗形态指标测定
雄穗大小=雄穗主轴长+平均分支长×分枝数，雄穗主轴长采用卷尺进行测量；主轴粗采用游标卡尺进行测量；干物质量采用烘干法测定。
1.2.3 玉米雄穗生理指标测定
抗氧化系统酶活性均采用ELISA检测试剂盒进行检测：取一定量的玉米雄穗加入PBS缓冲溶液充分研磨，4 000 r/min离心15 min后取上清液，根据ELISA检测试剂盒的操作说明步骤进行提取，利用酶标仪测定玉米雄穗中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性。脯氨酸(Pro)含量采用磺基水杨酸法测定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[17]。
1.2.4 玉米产量指标测定
玉米成熟收获后测定单株产量构成因子——穗长、秃尖长、穗粗、行数以及行粒数。
1.3 数据分析
数据均采用Microsoft Excel 2016软件整理，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差统计分析，采用Origin 2018软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 干旱胁迫对玉米抽雄吐丝间隔的影响
如图1所示，干旱胁迫对玉米抽雄吐丝间隔有显著影响。在正常供水条件下，2种土壤处理的玉米雌、雄穗开花吐丝同步性较强，抽雄吐丝间隔较小；但随着干旱程度加剧，玉米抽雄吐丝间隔也随之延长，并在重度干旱胁迫时达到峰值。从抽雄吐丝间隔分析，重度干旱胁迫时，添加土壤改良剂处理的抽雄吐丝间隔同CK相比延长了4.67 d，而原土处理中则延长了6.33 d；因此，在干旱胁迫条件下施用土壤改良剂可以在一定程度上缓解玉米抽雄吐丝间隔的延长。
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图 1 干旱胁迫对玉米抽雄吐丝间隔的影响CK：正常供水，LD：轻度干旱胁迫，MD：中度干旱胁迫，SD：重度干旱胁迫；相同土壤处理不同干旱胁迫程度柱子上的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 1. Effects of drought stress on maize tasseling-silking intervalCK: Normal water supply, LD: Light drought stress, MD: Moderate drought stress, SD: Severe drought stress; Different lowercase letters on the columns of different drought stress degrees in the same soil treatment indicate significant differences (P<0.05, Duncan’s method)2.2 干旱胁迫对玉米雄穗形态特征的影响
由表2可知，随着干旱胁迫程度增加，2种土壤处理的雄穗大小、主轴长以及主轴粗均不同程度地降低。在CK中，原土处理与添加土壤改良剂处理中的雄穗形态特征并无明显差异；但在重度干旱胁迫时，原土处理的雄穗大小、主轴长、主轴粗相对于CK分别缩小了50.76%、11.64%、52.52%，而添加土壤改良剂处理分别缩小了49.08%、11.32%、37.94%。
表 2 干旱胁迫对玉米雄穗形态特征的影响1)Table 2. Effects of drought stress on morphological characteristics of maize tassels土壤处理
Soil treatment干旱胁迫
Drought stress大小/cm
Size主轴长/cm
Spindle length主轴粗/mm
Spindle thickness干质量/g
Dry weight原土
Original soilCK 202.47±9.41a 43.80±1.50a 7.73±0.11a 4.76±079a LD 167.60±18.49ab 42.77±4.20ab 6.67±0.10ab 5.02±0.43a MD 127.83±32.04bc 40.83±0.76ab 5.33±0.12bc 4.02±0.96ab SD 99.70±22.25c 38.70±0.75b 3.67±0.06c 2.98±0.71b 添加土壤改良剂
Adding soil conditionerCK 213.40±11.84a 44.17±2.84a 8.33±0.08a 4.75±0.88ab LD 178.73±7.92b 43.17±1.26ab 7.33±0.06ab 5.58±0.80a MD 150.20±20.19c 41.87±3.46ab 6.10±0.07bc 4.20±0.92ab SD 108.67±3.18d 39.17±1.26b 5.17±0.08c 3.44±0.69b 1) CK：正常供水，LD：轻度干旱胁迫，MD：中度干旱胁迫，SD：重度干旱胁迫；相同土壤处理同列数据后的不同小写字母表示不同干旱胁迫程度间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1) CK: Normal water supply, LD: Light drought stress, MD: Moderate drought stress, SD: Severe drought stress; Different lowercase letters in the same column of the same soil treatment indicate significant differences among different drought stress degrees (P<0.05, Duncan’s method)随着干旱胁迫程度增加，不同土壤处理的玉米雄穗干物质量均呈现先增加后降低的趋势。轻度干旱胁迫可促进玉米雄穗积累干物质，原土处理的雄穗干物质较CK相比增加了5.18%，添加土壤改良剂处理的雄穗干物质则增加了14.87%；同CK及轻度干旱胁迫处理相比，中度及重度干旱胁迫的雄穗干物质量均有所下降，其中添加土壤改良剂处理的雄穗干物质积累量要稍优于原土处理的。
2.3 干旱胁迫对玉米雄穗生理特性的影响
2.3.1 干旱胁迫对玉米雄穗抗氧化系统酶活性及MDA含量的影响
如图2A所示，在正常供水条件下，2种土壤处理的雄穗SOD活性均大于1000 U·g−1；雄穗的SOD活性在中度干旱胁迫时达到峰值，随干旱胁迫程度变化显著，原土处理和添加土壤改良剂处理的雄穗SOD活性同CK相比分别增加了35.32%和41.57%；在重度干旱胁迫时，2种土壤处理的雄穗SOD活性均下降至与CK处理中酶活性相当的水平，但土壤改良剂处理中的SOD活性依旧较高，酶活性达1 199.83 U·g−1，同CK相比升高了14.26%。
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图 2 干旱胁迫对玉米雄穗抗氧化系统酶活性及丙二醛含量的影响CK：正常供水，LD：轻度干旱胁迫，MD：中度干旱胁迫，SD：重度干旱胁迫；各小图中相同土壤处理不同干旱胁迫程度柱子上的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 2. Effects of drought stress on antioxidant system enzyme activities and MDA content in maize tasselsCK: Normal water supply, LD: Light drought stress, MD: Moderate drought stress, SD: Severe drought stress; Different lowercase letters on the columns of different drought stress degrees in the same soil treatment in each figure indicate significant differences (P<0.05, Duncan’s method)如图2B、2C所示，玉米雄穗的CAT和POD活性受干旱影响显著，二者均在中度干旱胁迫时达到峰值，在重度干旱胁迫时活性下降。在中度干旱胁迫时，原土处理和添加土壤改良剂处理的CAT活性分别比CK升高了66.61%以及69.39%；在重度干旱胁迫时，原土处理的雄穗CAT活性下降幅度较大，降至与CK的酶活性相当的水平，虽然添加土壤改良剂处理的雄穗酶活性也有所降低，但依旧处于较高水平，同CK相比增加了21.22%。雄穗POD活性的变化趋势同CAT变化趋势基本一致。在正常供水条件下，2种土壤处理雄穗的POD活性差异不明显；在轻度干旱胁迫时，原土处理雄穗POD的分泌水平较低，同CK相比升高了36.67%，而添加土壤改良剂处理POD的分泌水平则较高，同CK相比升高了60.71%；在中度干旱胁迫时，原土处理中的POD活性达到峰值，酶活性达到1 845.17 U·g−1，虽然土壤改良剂处理酶活性依旧较高，但其分泌水平有所减缓；在重度干旱条件下，2种处理雄穗的酶活性均有所下降。
如图2D所示，雄穗的MDA含量是随着干旱胁迫程度增加而大幅度升高，并在重度干旱胁迫时达到峰值。在正常供水条件下，2种土壤处理雄穗的MDA含量无较大差异。随着干旱胁迫程度的增加，原土处理的雄穗对干旱胁迫反应较为敏感，在重度干旱胁迫时，雄穗MDA含量达111.27 μmol·g−1，同CK相比增加了62.92%；添加土壤改良剂处理的雄穗对轻度、中度干旱胁迫反应不敏感，对重度干旱胁迫反应较为敏感，在轻度以及中度干旱胁迫时，其雄穗MDA含量同CK相比分别提高了10.86%以及25.82%，在重度干旱胁迫时提高40.45%。
2.3.2 干旱胁迫对玉米雄穗渗透调节物质含量的影响
如图3A所示，添加土壤改良剂处理雄穗Pro含量在轻度干旱胁迫时增长相对较快，同CK相比增加了25.42%，在中度干旱胁迫时增长率则稍有减缓，而原土处理的雄穗Pro含量变化则与之相反；在重度干旱胁迫时，2种土壤处理雄穗中的Pro含量都显著提升，同CK相比分别增加了53.48%以及53.64%，但2种土壤处理间差异明显。
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图 3 干旱胁迫对玉米雄穗渗透调节物质含量的影响CK：正常供水，LD：轻度干旱胁迫，MD：中度干旱胁迫，SD：重度干旱胁迫；各小图中相同土壤处理不同干旱胁迫程度柱子上的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 3. Effects of drought stress on the content of osmotic adjustment substances in maize tasselsCK: Normal water supply, LD: Light drought stress, MD: Moderate drought stress, SD: Severe drought stress; Different lowercase letters on the columns of different drought stress degrees in the same soil treatment in each figure indicate significant differences (P<0.05, Duncan’s method)如图3B所示，干旱胁迫显著增加了玉米雄穗的可溶性蛋白含量。正常供水时，2种土壤处理雄穗的可溶性蛋白含量未有明显差异；在轻度干旱胁迫下，2种处理雄穗的可溶性蛋白含量均有所上升，但添加土壤改良剂处理的雄穗可溶性蛋白分泌水平较高，原土处理中的可溶性蛋白分泌水平相对较弱；中度干旱胁迫时，原土处理与土壤改良剂处理中的雄穗可溶性蛋白含量同CK相比均有大幅度上升，增幅分别为45.38%以及39.79%；重度干旱胁迫时，2种土壤处理雄穗中的可溶性蛋白含量均达到峰值，其中添加土壤改良剂处理的雄穗可溶性蛋白变化相对显著，同CK相比增加了59.17%。
如图3C所示，雄穗的可溶性糖含量也随干旱程度加重而增加。在轻度干旱胁迫时，添加土壤改良剂处理的雄穗可溶性糖含量变化较为明显，同CK相比上升了20.77%，原土处理上升了17.27%；在中度干旱胁迫时，原土处理雄穗对干旱反应较为敏感，可溶性糖含量同CK相比增加了29.61%，添加土壤改良剂处理的雄穗可溶性糖分泌能力则相对较弱一点；在重度干旱胁迫时，2种土壤处理雄穗中的可溶性糖含量均有所提高，但二者间未有明显差异。
2.4 干旱胁迫对玉米产量性状的影响
由表3可知，在抽雄期进行干旱胁迫会导致玉米产量严重降低，干旱程度对玉米产量的影响具体表现为重度干旱胁迫>中度干旱胁迫>轻度干旱胁迫>正常供水。轻度干旱胁迫对2种土壤处理的玉米穗长、行数、行粒数以及百粒质量影响较小；但在中度以及重度干旱胁迫时，玉米的穗长、行数以及行粒数均受干旱影响显著，在重度干旱胁迫时，原土处理的玉米穗长、行数、行粒数以及百粒质量同CK相比分别降低了55.67%、50.00%、77.92%以及26.77%，土壤改良剂处理则降低了34.66%、37.93%、57.95%以及22.81%。玉米果穗的秃尖长受干旱影响显著，具体表现为随干旱程度加剧果穗秃尖变长，在重度干旱胁迫时，原土处理与添加土壤改良剂处理的果穗秃尖长度较CK相比分别增长了4.68倍以及7.82倍。玉米果穗穗长、穗粗、行数、行粒数以及百粒质量均随着干旱胁迫程度加剧而降低，进而导致玉米产量严重下降。在各胁迫水平中，添加土壤改良剂处理的玉米产量以及果穗穗部性状都明显优于原土处理的。
表 3 干旱胁迫对玉米产量性状的影响1)Table 3. Effects of drought stress on maize yield characteristics土壤处理
Soil
treatment干旱胁迫
Drought
stress穗长/cm
Spike
length秃尖长/cm
Bald tip
length穗粗/cm
Spike
thickness行数
Row
number行粒数
Row grain
number百粒质量/g
100-grain
weight单株产量/g
Yield per
plant原土
Original soilCK 16.17±1.53a 0.37±0.32c 2.47±0.35a 18.67±2.31a 25.67±3.79a 37.92±0.76a 134.62±5.60a LD 14.00±0.50b 0.87±0.32bc 2.13±0.23ab 17.33±2.83ab 22.33±3.21b 34.79±0.90b 110.66±5.55b MD 11.17±1.61c 1.60±0.4ab 1.93±0.12bc 11.30±5.03bc 15.00±2.00c 30.82±1.28c 76.28±2.95c SD 7.17±0.76c 2.10±0.79a 1.50±0.2c 9.33±3.79c 5.67±2.52c 27.77±1.15d 50.63±2.90d 添加土壤改良剂
Adding soil conditionerCK 16.33±0.29a 0.17±0.29c 2.73±0.25a 19.33±6.73a 29.33±2.08a 40.56±1.32a 163.14±5.04a LD 14.83±0.58b 0.63±0.25bc 2.33±0.15a 17.33±1.00a 27.00±2.00b 39.09±1.90a 117.47±5.83b MD 13.50±0.5c 0.90±0.46ab 2.03±0.06b 14.67±1.91b 23.67±3.21bc 35.12±2.51b 100.56±5.38c SD 10.67±0.58d 1.50±0.40a 1.77±0.06c 12.00±1.91c 12.33±3.06c 31.31±1.47c 68.89±0.53d 1) CK：正常供水，LD：轻度干旱胁迫，MD：中度干旱胁迫，SD：重度干旱胁迫；相同土壤处理同列数据后的不同小写字母表示不同干旱胁迫程度间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1) CK: Normal water supply, LD: Light drought stress, MD: Moderate drought stress, SD: Severe drought stress; Different lowercase letters in the same column of the same soil treatment indicate significant differences among different drought stress degrees (P<0.05, Duncan’s method)2.5 玉米抽雄吐丝间隔与产量的关系
由表4可知，玉米抽雄吐丝间隔与果穗秃尖长呈显著正相关，与玉米产量、百粒质量、行粒数以及行数呈极显著负相关；果穗秃尖长与玉米产量、百粒质量、行粒数以及行数呈极显著负相关；行数、行粒数以及百粒质量均和玉米产量呈极显著正相关。这说明干旱胁迫延长玉米的抽雄吐丝间隔会导致雌雄穗抽雄吐丝不同步，对授粉造成严重影响，进而对玉米产量造成一定影响。因此，玉米抽雄吐丝间隔与产量有着密切联系。
表 4 玉米抽雄吐丝间隔与产量构成因素的相关分析1)Table 4. Correlation analysis between tasseling-silking interval and output composition of maize性状
Trait抽雄吐丝间隔
Anthesis-silking interval秃尖长
Bald tip length行数
Row number行粒数
Row grain number百粒质量
100-grain weight秃尖长 Bald tip length 0.968* 行数 Row number −0.956** −0.980** 行粒数 Row grain number −0.947** −0.973** 0.947** 百粒质量 100-grain weight −0.925** −0.967** 0.940** 0.950** 单株产量 Yield per plant −0.975** −0.980** 0.964** 0.949** 0.935** 1)“*”和“**”分别表示在P<0.05和P<0.01水平显著相关(Pearson法)
1) “*” and “**” indicate significant correlations at P<0.05 andP<0.01 respeectively (Pearson method)3. 讨论与结论
穗期是玉米雄穗生长发育的重要时期，也是对水分需求最敏感的时期，若在此时水分亏缺则不利于雄穗正常生长以及维持内部正常生理特性[18]。本研究发现：干旱胁迫导致玉米雄穗主轴长度、粗度以及分枝数均不同程度地减少，且下降程度随干旱胁迫程度加重而增大，这与贾波等[19]的研究结果基本一致；适当的干旱有利于雄穗干物质积累，可促进其发育；干旱胁迫同样导致玉米抽雄吐丝间隔增大，引起雌雄穗抽雄吐丝不同步，对后续玉米授粉工作造成严重影响。通过对玉米抽雄吐丝间隔与产量的相关性分析发现：抽雄吐丝间隔与玉米产量呈极显著负相关，这与王艺煊等[20]的研究结果相类似。本研究还发现施用土壤改良剂可以在一定程度上改善盐碱土的保水能力，减小干旱胁迫对玉米雄穗的消极影响，同原土处理相比，其雄穗穗部性状、抽雄吐丝间隔以及产量受干旱胁迫影响相对较小。
在干旱条件下，玉米细胞失水达到一定程度时会产生大量活性氧分子，这些氧自由基会造成细胞膜氧化损伤，诱导其脂质化，产生大量MDA，大量的活性氧和MDA会改变细胞膜的流动性和通透性，最终导致细胞的结构和功能发生改变。这种过度的损伤促使玉米雄穗内部分泌抗氧化系统酶(如SOD、POD和CAT)来消除这种副作用[21-22]。本研究发现：随着干旱胁迫程度加剧，2种土壤处理雄穗内部的SOD、POD和CAT活性均呈现先升后降的趋势，结合前期对干旱影响玉米生理调节机制的研究[23]分析，导致此变化趋势的原因可能是重度干旱胁迫对雄穗细胞造成一定损伤，内部抗氧化系统酶无法过量分泌进而无法消除分解雄穗内产生的过多的活性氧以及MDA。在干旱胁迫前期，添加土壤改良剂处理雄穗内部抗氧化系统酶分泌速率较快，在中后期则有所减缓，出现此现象的原因可能是在胁迫前期土壤改良剂在土壤中会快速吸收水分，从而维持一定含水量，进而造成土壤中水分匮缺加剧，刺激玉米雄穗分泌抗氧化系统酶抵御干旱带来的损害，这与周客等[24]和田丽等[25]对土壤改良剂的研究结果相符合；而在胁迫中后期，土壤改良剂中会释放出一部分水分供应植株生长，此时玉米植株缺水情况有所缓解，使其雄穗内部抗氧化系统酶分泌速率减缓。在不同干旱程度胁迫下，SOD活性变化在2种土壤处理中均无明显差异且其含量较高，这表明在干旱条件下SOD对玉米雄穗的重要性。本研究结果与前期的研究结果[26]相类似。
已有研究表明，干旱条件下玉米无法正常从土壤中吸取水分，细胞因失水导致细胞内外渗透压不一致，从而造成细胞皱缩且活性下降。在这种逆境条件下，雄穗内部会大量分泌并积累渗透调节物质(如Pro、可溶性糖以及可溶性蛋白)，从而降低细胞水势，维持细胞内外渗透压一致，使雄穗能正常生长发育，完成后期授粉工作[27-28]。本研究发现，渗透调节物质含量变化受干旱胁迫影响显著，2种土壤处理雄穗的渗透调节物质含量变化均是在重度胁迫时达到峰值，这表明玉米可以通过增加体内渗透调节物质含量来避免胁迫所带来的损伤，渗透调节物质在调节细胞内外因干旱胁迫而产生的渗透压时发挥着重要作用。本研究还发现渗透调节物质含量变化和抗氧化系统酶变化趋势基本一致，说明渗透调节在干旱条件下可以保护有利于清除活性氧的酶活性，这与前人的研究结果[29-30]基本一致。
本研究发现，干旱胁迫严重影响玉米雄穗生长发育以及产量，施用土壤改良剂可以在一定程度上缓解干旱对植株产生的负作用，轻度干旱胁迫促进玉米雄穗发育，但重度干旱胁迫时，雄穗内部有害物质分泌过多，抗氧化系统酶以及渗透调节物质无法正常发挥作用，对雄穗造成不可逆伤害。干旱胁迫同样会造成玉米抽雄吐丝间隔的延长，从而严重降低玉米产量。因此在玉米抽雄期至吐丝期做好保水工作是抗旱保产的首要任务。
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图 1 SUS、CX、MY种群中CarE基因的相对表达量
相同基因不同种群柱子上方的不同小写字母表示种群间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)。
Figure 1. Relative expression of CarE genes in SUS, CX and MY populations
Different lowercase letters on the columns of the same gene and different populations indicate significant differences among populations (P<0.05, one-way ANOVA).
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图 2 SUS、CX、MY种群中GST基因的相对表达量
相同基因不同种群柱子上方的不同小写字母表示种群间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)。
Figure 2. Relative expression of GST genes in SUS, CX and MY populations
Different lowercase letters on the columns of the same gene and different populations indicate significant differences among populations (P<0.05, one-way ANOVA).
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图 3 SUS、CX、MY种群中P450s基因的相对表达量
相同基因不同种群柱子上方的不同小写字母表示种群间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)。
Figure 3. Relative expression of P450s genes in SUS, CX and MY populations
Different lowercase letters on the columns of the same gene and different populations indicate significant differences among populations (P<0.05, one-way ANOVA).
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图 4 草地贪夜蛾中肠代谢物质总离子色谱图
S1、S2为ESI+离子模式总离子图，S3、S4为ESI−离子模式总离子图；S1、S3为对照组MY，S2、S4为试验组MY+LD50高效氯氰菊酯，扫描范围为“Full ms”。
Figure 4. Total ion chromatogram of intestinal metabolites in Spodoptera frugiperda
S1 and S2 are the total ion plots of ESI+ ion mode, S3 and S4 are the total ion plots of ESI− ion mode. S1 and S3 are control group MY, S2 and S4 are experimental group MY+LD50 beta cypermethrin, the scanning range is “Full ms”.
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图 5 草地贪夜蛾体内代谢高效氯氰菊酯的预测途径
Figure 5. Prediction of in vivo metabolism pathway of beta cypermethrin in Spodoptera frugiperda
表 1 差异表达基因RT-qPCR引物信息
Table 1 RT-qPCR primer information of differentially expressed genes
基因
Gene引物名称
Primer name引物序列(5'→3')
Primer sequence片段长度/bp
Fragment lengthU20139.1 EF1α-F TGGGCGTCAACAAAATGGA 148 EF1α-R TCTCCGTGCCAGCCAGAAAT NC_058085.1 GADPH-F CGGTGTCTTCACAACCACAG 140 GADPH-R TTGACACCCAACGACGAACAT NC_064218.1 GST epsilon11-F GGTTGCTGGTGACCAACCTA 81 GST epsilon11-R ATGTCCCAACCAACAGCCAG NC_064231.1 GST epsilon9-F CTTTGGACATGAGTCCGCCT 91 GST epsilon9-R GCCGGTACGTTGACGATGAT NC_036208.1 GST3-F CACAAAAGGAGTTGCCGGTG 133 GST3-R ATGGCCCTTGCTTTAGGGTC NC_064241.1 GST delTA1-F AACAACAGCCTGTACCCGAG 124 GST delTA1-R CCCCACCGAAGATTTGTGGA NC_064218.1 GST delTA3-F TTTCCTATCAGCGGGCCTTC 91 GST delTA3-R GCAATAGCACGACTCTCCCA NC_064238.1 CYP4G75-F ATGAGCTACACGACTGCAG 148 CYP4G75-R GTTTGGCCGCGAGTTCATAT NC_064233.1 CYP6AB12-F ATGCAGTCTTTAGCCGGTCT 114 CYP6AB12-R AATGCACTGAACCACGGAAC ULR85595.1 CYP6AN4-F CATAAGTTCGCGTACCTGCC 96 CYP6AN4-R AACTGCTGCTAACCCTGCTA NC_064214.1 CYP6B50-F ACAATCTTTTCCACGCCGAC 111 CYP6B50-R CTCGGTTGGCAAGCATGTAA AGO62005.1 CYP321A7-F AAGTGCTCAAGACTTCGTGC 116 CYP321A7-R TGCCGAAGATAGCTCCACAA XM_035579984.1 CESFS8-F TGGCGCAGCTGCTATAGATT 136 CESFS8-R TCCAAGCTTGAACGCTCTGT XM_035584193.1 CESFS9-F GCTACCCTGGAATGGTCCTC 95 CESFS9-R TTTGGGAGTTCCGGTGGTTG XM_035596781.2 CESFS2-F TGCTCCACAGAAGGATGGTG 123 CESFS2-R TGCCAGATGTGGTACAATCCA XM_035578942.1 CESFS5-F ACGATCCTGTTGGATACGCC 120 CESFS5-R TCAGTGCAGTGTGCAAAACG XM_035586904.1 CESFS12-F GGCGGATATACCGGACGAAG 133 CESFS12-R GCCTACCGGTGGTTTAGCAT 
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表 2 高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾田间种群毒力测定
Table 2 Determination of the virulence of beta cypermethrin on field populations of Spodoptera frugiperda
种群
Population斜率±标准误
Slope±SELD50/(μg·g−1) 95%置信限/(μg·g−1)
95% CIχ2 df P 抗性倍数
Resistance ratio米易 MY 2.250±0.350 84.201 68.161~109.453 5.741 13 0.924 4.02 德昌 DC 3.583±0.468 72.263 58.973~90.387 8.789 13 0.762 3.45 仁和 RH 3.949±0.768 71.889 57.164~86.001 14.214 13 0.966 3.43 苍溪 CX 2.751±0.367 42.622 34.667~51.013 7.831 13 0.923 2.03 会东 HD 3.042±0.452 41.166 32.939~49.345 5.433 13 0.952 1.96 敏感品系 SUS1)
Sensitive strain SUS2.704±0.565 20.950 17.763~24.094 7.409 13 0.876 1.00 1) 敏感品系SUS为室内草地贪夜蛾敏感品系。
1) SUS is an indoor susceptible strain of Spodoptera frugiperda.
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表 3 高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾3龄幼虫解毒酶活性的影响1)
Table 3 Effects of beta cypermethrin on detoxification enzyme activities for 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda
mmol·min−1 组别
GroupCarE GST P450s SUS 0.225±0.02f 0.419±0.02f 0.510±0.04e SUS+LD50 0.409±0.03c 0.525±0.09e 0.544±0.02e CX 0.305±0.03e 0.808±0.02d 0.880±0.07d CX+LD50 0.472±0.07b 0.919±0.04c 0.948±0.04c MY 0.341±0.09d 0.961±0.09b 1.115±0.06b MY+LD50 0.654±0.11a 1.316±0.05a 1.462±0.13a 1) 同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)。
1) Different lowercase letters after the same column data indicate significant differences among treatments (P<0.05, one-way ANOVA).
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表 4 高效氯氰菊酯抗性倍数与羧酸酯酶活性及基因表达量的相关性分析1)
Table 4 Correlation analysis of beta cypermethrin resistance ratios with carboxylesterase activity and gene expressions
标目 Item 抗性倍数 RR CESFS8 CESFS9 CESFS2 CESFS5 CESFS12 CarE 抗性倍数 RR 1 0.390 −0.948* 0.622 −0.056 0.948* 0.922* CESFS8 0.390 1 −0.076 −0.478 0.897 0.663 0.716 CESFS9 −0.948* −0.076 1 −0.839 0.371 −0.797 −0.751 CESFS2 0.622 −0.478 −0.839 1 −0.817 0.340 0.270 CESFS5 −0.056 0.897 0.371 −0.817 1 0.264 0.335 CESFS12 0.948* 0.663 −0.797 0.34 0.264 1 0.997* CarE 0.922* 0.716 −0.751 0.27 0.335 0.997* 1 1) *表示在0.05水平相关性显著(双尾检验)。
1) * indicates a significant correlation at 0.05 level (Two-tailed test).
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表 5 高效氯氰菊酯抗性倍数与细胞色素P450s活性及基因表达量的相关性分析1)
Table 5 Correlation analysis of beta cypermethrin resistance ratios with cytochrome P450s activity and gene expressions
标目 Item 抗性倍数 RR CYP4G75 CYP6AB12 CYP6AN4 CYP6B50 CYP321A7 P450s 抗性倍数 RR 1 0.588 0.940* 0.540 0.995* 0.308 0.953* CYP4G75 0.588 1 0.829 −0.363 0.666 −0.588 0.316 CYP6AB12 0.940* 0.829 1 0.220 0.969* −0.035 0.793 CYP6AN4 0.540 −0.363 0.220 1 0.453 0.967* 0.769 CYP6B50 0.995* 0.666 0.969* 0.453 1 0.211 0.918 CYP321A7 0.308 −0.588 −0.035 0.967* 0.211 1 0.582 P450s 0.953* 0.316 0.793 0.769 0.918 0.582 1 1) *表示在0.05水平相关性显著(双尾检验)。
1) * indicates a significant correlation at 0.05 level (Two-tailed test).
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表 6 高效氯氰菊酯抗性倍数与谷胱甘肽转移酶活性及基因表达量的相关性分析1)
Table 6 Correlation analysis of beta cypermethrin resistance ratios with glutathione S-transferase and gene expressions
标目 Item 抗性倍数 RR GST epsilon11 GST epsilon9 GST3 GST delTA1 GST delTA3 GST 抗性倍数 RR 1 0.252 0.959* 0.707 0.094 0.996* 0.911 GST epsilon11 0.252 1 0.515 0.863 −0.940* 0.338 −0.170 GST epsilon9 0.959* 0.515 1 0.878 −0.191 0.981 0.757 GST3 0.707 0.863 0.878 1 −0.638 0.767 0.351 GST delTA1 0.094 −0.940* −0.191 −0.638 1 0.005 0.497 GST delTA3 0.996* 0.338 0.981 0.767 0.005 1 0.870 GST 0.911 −0.170 0.757 0.351 0.497 0.870 1 1) *表示在0.05水平相关性显著(双尾检验)。
1) * indicates a significant correlation at 0.05 level (Two-tailed test).
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表 7 高效氯氰菊酯解毒代谢产物分析
Table 7 Analysis of detoxification metabolites of beta cypermethrin
代谢物
Metabolite碎片化分数Fragmentation score 化学式
Formulam/z 保留时间/min
Retention time加合物
Adduct质量误差/(mg·kg−1)
Mass error试验组1)
Test group对照组2)
Control group3−苯氧基苯甲酸
3-Phenoxybenzoic acid89.7 C13H10O3 213.1 9.42 M-H 1.4 355 223.2 0 癸酸
Capric acid64.4 C11H22O2 186.3 8.58 M+FA-H 1.6 85 599.3 9 933.8 邻苯二酚
Pyrolatechol55.8 C6H6O2 109.0 3.92 M-H 0.1 286293.8 332595.0 甲基−2, 3−二氢−3, 5−二羟基−
2−氧代−3−吲哚乙酸
Methyl 2, 3-dihydro- 3, 5-dihydroxy- 2-oxo-3-indoleacetic acid51.9 C11H11NO5 236.1 1.71 M-H 0.8 95 283.6 6 806.4 1) 试验组为使用LD50高效氯氰菊酯处理的草地贪夜蛾MY种群；2) 对照组为未处理的草地贪夜蛾MY种群。
1) The text group is the MY population of Spodoptera frugiperda treated with LD50 beta cypermethrin; 2) The control group is the MY population untreated with LD50 beta cypermethrin.
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